IDENTIFICACIÓN DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESADOS EN RESPUESTA A DÉFICIT HÍDRICO EN PLÁNTULAS DE FRIJOL COMÚN

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1 IDENTIFICACIÓN DE GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESADOS EN RESPUESTA A DÉFICIT HÍDRICO EN PLÁNTULAS DE FRIJOL COMÚN Participante: Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez Actividad: Análisis de la respuesta en crecimiento y fisiología del frijol al déficit hídrico. Las plantas de frijol común de las variedades BAT 477 (resistente a M. phaseolina y déficit hídrico) y Pinto UI-114 (susceptible a ambas condiciones) (Mayek-Pérez et al., 2004) fueron sembradas en invernadero (marca Stuppy) en Reynosa, México. Las semillas se colocaron en macetas de plástico con 1 Kg de suelo esterilizado del Rancho Los Lirios, Reynosa y regadas diariamente con agua desionizada. El tratamiento de sequía consistió en suspender el riego a los 19 días de emergencia y hasta alcanzar el punto de marchitez permanente (PMP). En esta condición, las plantas fueron mantenidas durante tres días. Posteriormente, se aplicó un riego de recuperación y las plantas fueron separadas en raíz, tallo y área foliar y mantenidas a 70 C durante tres días para obtener el peso seco. El testigo consistió de plantas que se mantuvieron en condiciones de riego constante durante todo el experimento. A las variedades de frijol también se evaluó su resistencia al hongo Macrophomina phaseolina. Dos niveles de inoculación con M. phaseolina fueron evaluados: inoculado y no inoculado (testigo). Se utilizaron dos métodos para inocular las variedades de frijol. El primero consistió en tomar discos de PDA con crecimiento del hongo en los cuales se determinó el número de unidades formadoras de colonia (ufc). El segundo método consistió en infestar palillos estériles de madera con el hongo. Las plantas fueron inoculadas utilizando palillos de madera infestados con un aislamiento de M. phaseolina altamente virulento obtenido de plantas de soya colectadas en Altamira, Tamaulipas (Mayek-Pérez et al. 2001). Dicho aislamiento fue inoculado en cajas Petri de PDA y crecido a 30 C en oscuridad durante ocho días y se colocaron 6 palillos por caja y fueron utilizados hasta que el palillo estuvo completamente invadido por esclerocios del hongo. Fueron incluidos testigos de las dos variedades en estudio, tratamientos con palillo sin hongo en condiciones de déficit hídrico y riego. Los tratamientos a evaluar se replicaron cinco veces. La unidad experimental fue una maceta con tres plantas. Diariamente, a partir del inicio del período de estrés hídrico, hojas jóvenes completamente expandidas fueron colectadas durante todo el período de sequía y hasta el día de la aplicación del riego de recuperación, para la extracción del ARN, donde las raíces, tallos y hojas de cada tratamiento fueron colectados por separado.

2 Participante: Krystal Lira Méndez Actividad: Apoyo en el desarrollo del análisis de la respuesta en crecimiento y fisiología del frijol al déficit hídrico. Después del riego de recuperación las plantas fueron cortadas y evaluada la severidad de la pudrición carbonosa causada por M. phaseolina sobre el tallo, utilizando una escala con valores de 1 a 9, donde 1 corresponde a síntomas no visibles y 9 representa más del 75 % del tejido del tallo infectados por el hongo (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). Los valores de 1 a 3 se consideran como reacción de resistencia y los valores de 4 a 9 como reacción de susceptibilidad. Las plantas fueron separadas en hojas, tallos y raíz y las estructuras vegetativas fueron secadas en una estufa de aire forzado a 70 C durante tres días. El análisis de varianza (ANVA) se llevó a cabo para cada variable medida. Cuando se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos con el ANVA, las medias fueron separadas utilizando los valores de Tukey (P=0.05). Participante: Juan Manuel González Prieto Actividad: Análisis de genes diferencialmente expresados en frijol en respuesta al déficit hídrico. El ARN total de 100 mg de tejido fue aislado de cada tratamiento (dos niveles de humedad x dos niveles de inoculación con M. phaseolina) utilizando el RNeasy Plant Mini Kit de la marca Qiagen y siguiendo las especificaciones de dicho proveedor. Los contaminantes de DNA fueron removidos con DNAsa grado amplificación de la marca Invitrogen. El ARN purificado fue almacenado a -70 C. Las reacciones por RT-PCR para el despliegue diferencial fueron llevadas a cabo utilizando el estuche comercial RNAimage (GenHunter Corp.). Cada reacción de transcripción en reversa (RT) estuvo constituida por 5 mm de KCl, 10 mm de Tris-HCl (ph 8.3), 4 mm MgCl µm de cada dntp, 0.2 µm del oligo de anclaje (T11VC, T11A, T11G y T11TC, donde V es A, G o C; 0.4 µg de ARN total y 100 U de transcriptasa reversa MMLV. Las reacciones de RT fueron llevadas a cabo a 40 C por 60 min seguida por una incubación a 70 C por 5 min. Un décimo del cdna fue utilizado como templado para las reacciones de PCR en la presencia de 2.5 µm de cada dntp, 0.2 µm del oligo de anclaje que se utilizó en la reacción de RT, 0.2 µm de un oligo arbitrario (serie AP, GenHunter Corp.), 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Alta enzima) con su amortiguador respectivo conteniendo 1.5 mm de MgCl 2. El programa para la PCR fue de 40 ciclos (92 C por 45 s, 40 C por dos min y 70 C por dos minutos). Un sexto del producto de PCR fue mezclado con buffer de carga (Gen Hunter Corp.) desnaturalizado por 5 min a 95 C y separado por electroforesis en gel

3 de poliacrilamida desnaturalizante al 6 %. Posteriormente, los geles fueron teñidos mediante tinción con plata (Promega, EUA). Resultados y discusión Durante el experimento se manejaron los siguientes tratamientos para las variedades BAT 477 y Pinto UI 114: Trat 1: NIR-No inoculado con riego Trat 2: IR-Inoculado (2400 ufc) con riego Trat 3: IR-Inoculado (4000 ufc) con riego Trat 4 : IR-Inoculado con palillo con riego Trat 5: NIR-Palillo no inoculado con riego Trat 6: NIS-Palillo no inoculado con déficit hídrico Trat 7: IS-Inoculado (2400 ufc) con déficit hídrico Trat 8: IS-Inoculado (4000 ufc) con déficit hídrico Trat 9 : IR-Inoculado con palillo con déficit hídrico Trat 10: NIS-Palillo no inoculado con riego La variedad Pinto UI 114 fue más susceptible al déficit hídrico y al daño por M. phaseolina, presentó valores de severidad de 5.71 comparados con los valores de BAT 477 (3.4) y el peso seco total es mayor en la variedad resistente (Cuadro 1). Cuadro 1. Medias de las características medidas en los genotipos BAT 477 y Pinto UI 114 en condiciones de inoculación con M. phaseolina. ALT SEV PST PSR PSH PSTOT GENOTIPOS BAT PINTO UI DMSH a ALT= altura de planta, SEV= severidad por el hongo, PST= peso seco de tallo, PSR= peso seco de tallo, PSH= peso seco de hoja y PSTOT= peso seco total.

4 Se observó que la severidad por el hongo es mayor en condiciones de déficit hídrico, observándose también un valor mayor en la altura de planta bajo condiciones de humedad (Cuadro 2). Cuadro 2. Medias de las características medidas en los genotipos BAT 477 y Pinto UI 114 en condiciones de M. phaseolina y déficit hídrico. ALT a SEV PST PSR PSH PSTOT HUMEDAD RIEGO DH a DMSH a DH=Déficit hídrico En los tratamientos de inoculación con M. phaseolina podemos observar que son más severos los tratamientos en los cuales el inóculo se pone al momento de la siembra con valores de 6.64 y y aunque es buen método para evaluación de daño, en combinación con déficit hídrico no es adecuado porque disminuye mucho el área foliar y no permite tener tejido para la identificación de fragmentos de genes que se están expresando. Por otro lado el método de inoculación con palillos es bueno porque podemos evaluar el daño y nos permite tener tejido y comparado con el testigo (palillo que no tiene hongo) resulta en un buen método sin interferir con el daño por M. phaseolina. (Cuadro 3). Cuadro 3. Medias de las características medidas en los genotipos BAT 477 y Pinto UI 114 en condiciones de M. phaseolina y déficit hídrico. ALT SEV PST PSR PSH PSTOT INÓCULO 1 a DMSH a Tratamientos: 1=testigo, 2=2400 ufc, 3= 4000 ufc, 4= palillo con M. phaseolina y 5= palillo no inoculado

5 Se colectó tejido foliar durante los tres días del PMP y se procedió a extraer el ARN total. Se probaron dos métodos, el primero utiliza el reactivo Trizol de marca Invitrogen; si embargo no se obtuvo ARN de calidad, se degradaron las subunidades ribosomales encontradas en plantas (25 S y 18 S marcadas con flechas en el gel) por lo cual se procedió a utilizar el RNeasy Plant Mini Kit (Figura 1). Figura 1. ARN total extraído de hojas de frijol en condiciones de M. phaseolina y déficit hídrico. M corresponde al marcador de peso molecular, 1-4 muestras de ARN y 1K ARN extraído con el Kit de Qiagen. Conclusiones La sequía es un factor ambiental adverso importante en la producción de frijol particularmente en el Norte y el Altiplano semiárido de México. Dicho factor altera el estado hídrico de la planta, limitando severamente el crecimiento y desarrollo de la misma, así como su productividad (Acosta-Gallegos et al., 2001). Los avances que estamos reportando van a permitir extraer bandas diferenciales de cdna como respuesta a sequía y M. phaseolina. Los cdnas serán secuenciados y comparada dicha secuencia con una base de datos para determinar posibles genes y la función de alguno de ellos, además se generarán sondas para controlar los niveles de los transcritos mediante RT-PCR. Una de las variedades que se está utilizando en este trabajo (BAT 477) es resistente al déficit hídrico, entonces podremos identificar los genes e incorporarlos en el mejoramiento del cultivo del frijol en México.