DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN HERG1 EN BIOPSIAS DE CÁNCER DE MAMA
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- Elena Piñeiro Aguilera
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1 PROYECTO No DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN HERG1 EN BIOPSIAS DE CÁNCER DE MAMA DIRECTORA: IRENE MENDOZA LUJAMBIO RESUMEN En México, actualmente el cáncer de mama es la segunda causa de muerte por cáncer. El cáncer de mama (CM) es una afección en la cual se forman células malignas en los tejidos de la mama. El CM suele tratarse con varias combinaciones de cirugía, radioterapia, quimioterapia y hormonoterapia. Aunque existen algunos marcadores de etapas avanzadas del CM como el gen HER2/neu, no existen marcadores de etapas tempranas. Algunos canales iónicos se han reportado como marcadores tempranos en diferentes tipos de cáncer. Entre estos canales, los de K+ parecen tener un papel importante, ya que se han detectado sobreexpresados en diferentes tipos de neoplasias y de alguna manera involucrados con la regulación del crecimiento neoplásico. Existe una imperiosa necesidad para encontrar factores predictivos precisos en pacientes con CM dada la marcada variación en los tratamientos a seguir. Nosotros queremos dilucidar la relación que pueda tener el canal de K+ HERG1 en la proliferación en líneas celulares de CM y su probable uso como marcadores tempranos de CM. En diversos trabajos, el gen del canal HERG1, entre otros canales iónicos, ha sido reportado como marcador molecular en diversos tipos de cáncer, debido a que estos genes presentan una sobreexpresión notable en tejido neoplásico con respecto al nivel de expresión del gen en tejido no neoplásico. En este trabajo, encontramos que el gen HERG1 presenta una sobre-expresión en tejido de CM en comparación con el tejido de mama normal por medio de RTPCR cuantitativa. Esto nos permite sugerir que el HERG1 podría ser un biomarcador de CM, lo cual debe comprobarse con otras técnicas moleculares.
2 INTRODUCCIÓN En nuestro país, el cáncer provocó 55,731 defunciones anuales, 52 % mujeres y de 48 % hombres en el año En México, actualmente el cáncer de mama es la segunda causa de muerte por cáncer. Cáncer de Mama La mama está compuesta por lóbulos y conductos. Cada glándula mamaria tiene entre 15 y 20 lóbulos, que comprenden secciones más pequeñas llamadas lobulillos. Los lóbulos, los lobulillos y los bulbos están conectados por tubos delgados llamados conductos. El cáncer de mama es una afección en la cual se forman células malignas en los tejidos de la mama. El tipo más común de cáncer de mama es el carcinoma ductal, que empieza en las células de los conductos. El cáncer que empieza en los lóbulos o los lobulillos se llama carcinoma lobular y se encuentra con mayor frecuencia en ambas mamas que otros tipos de cáncer de mama. El cáncer ductal infiltrante o invasor es el tipo histológico más frecuente de cáncer de mama que abarca entre 70% y 80% de todos los casos. Factores de riesgo: Edad avanzada. Menstruación a temprana edad. Edad avanzada al momento del primer parto o no haber dado nunca a luz. Antecedentes personales de cáncer de mama o de enfermedad benigna (no cancerosa) de mama. Madre o hermana con cáncer de mama. Tratamiento con radioterapia dirigida a la mama/pecho. Tejido de la mama que muestra ser denso en una mamografía. Tomar hormonas tales como estrógeno y progesterona. Consumir bebidas alcohólicas. Ser de raza blanca.
3 El cáncer de mama se origina, en algunas ocasiones, por mutaciones heredadas. El cáncer de mama hereditario representa aproximadamente del 5% a 10% de todos los casos de cáncer de mama. Algunos genes alterados relacionados con el cáncer de mama son más comunes en ciertos grupos étnicos. Genética del Cáncer de Mama. Estudios epidemiológicos y genéticos han demostrado que una historia familiar de cáncer de mama y ovario confieren un riesgo mayor el riesgo de contraer cáncer de mama. Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 son comunes en los casos familiares de cáncer de mama. El cálculo de riesgo para toda la vida de contraer cáncer de mama durante su vida para la mujer con mutaciones del BRCA1 y el BRCA2 oscila entre 40% y 85%. Las pacientes con mutaciones en los genes mencionados tienen mayor riesgo de contraer enfermedad contralateral. Los hombres portadores de mutaciones del BRCA2 también tienen mayor riesgo de padecer de cáncer de mama. Las mutaciones de cualquiera de estos genes también confieren un mayor riesgo de cáncer de ovario. Además, los portadores de la mutación podrían tener un riesgo mayor de contraer otros tipos de cáncer primarios. Se dispone de pruebas moleculares para detectar las mutaciones en los miembros de familias de riesgo alto. Desafortunadamente, de todas las mujeres con cáncer de mama, sólo entre 5% y 10% pueden tener una mutación de la línea germinal de los genes BRCA1 y BRCA2. Detección La detección del cáncer de mama es por medio de mamografía, acompañada de un examen clínico de la mama. El cáncer de mama suele tratarse con varias combinaciones de cirugía, radioterapia, quimioterapia y hormonoterapia. El pronóstico y la selección de la terapia pueden estar determinados por la edad y la situación menopáusica de la paciente, el estadio de la enfermedad, el grado histológico y nuclear del tumor primario, el estado del receptor de estrógeno (RE) y del receptor de progesterona (RP), las mediciones de su capacidad de proliferación, y la amplificación del gen HER2/neu.
4 Canales Iónicos Los canales ionicos de K se han visto relacionados con proliferación, debido a que el uso de bloqueadores específicos de canales de K + como 4- aminopiridina, quinidina y TEA tienen efectos antiproliferativos en líneas celulares como: linfocitos, melanoma, carcinoma de mama, neuroblastoma, leucemia mieloblástica, etc. Este efecto anti-proliferativo es generado por el control de los canales de K + sobre las variaciones del potencial de membrana celular al regular la entrada de Ca 2+, la cual es un factor crucial para la proliferación celular, y por influenciar el transporte de nutrientes dependiente de Na + y el ph intracelular. MÉTODOS Y MATERIALES Extraccion de RNAm de muestras de tejido de cáncer de mama y mama normal. En caso de muestras de cáncer de mama montadas en parafina se empleará el kit de extracción RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Ambion). Se utilizará TRIzol (Sigma) basado en el método de extracción con tiosanato de guanidina, fenol y cloroformo (Chomczynski, P. y Sacchi, N. 1987) en el caso de las muestras de mama normal postmortem y con muestras de cáncer de mama en fresco. La calidad y cantidad del RNA obtenido se obtendrá por métodos espectrofotométricos. Obtención de cdna por retrotranscripción. Se sintetiza cdna a partir de RNA por transcripción reversa con oligonucleótidos hexámeros random con el kit de Superscript II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante. RTPCR Cuantitativa (qrtcpr). Se realizó RTPCR cuantitativa por el método del agente intercalante (SYBR green). El cdna obtenido se somete a amplificación con PCR cuantitativa usando un Master mix (Ampliqon), que contiene la Taq DNA Polimerasa, buffer de la Taq polimerasa y el MgCl 2, SYBR green como fluoróforo, primers gen-
5 específicos más el cdna de las muestras. Los primers para amplificación se diseñan para obtener fragmentos de PCR específico para el gen HERG1 [Tabla 1]. La reacción se normaliza mediante la amplificación de cada muestra con primers de un gen contitutivo que en este caso es el gen de Actina. Asimismo, el análisis de la expresión se realiza incluyendo un gen calibrador que en este caso fue el tejido de cerebro normal. La ausencia de contaminación genómica en las muestras se confirma con controles negativos de transcripción reversa (no RT) para cada experimento. CANAL PRIMERS HERG1 F 5 - CGAGGAGGTGGTCAGCCAC -3 R 5 - GCGTACCAGATGCAGGCTAGC -3 ACTINA F 5'- GCTCGTCGTCGACAACGGCTC -3' R 5'- CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC -3 Tabla 1. Primers específicos utilizados para la amplificación de los genes de humano HERG1 y Actina. F= Forward o sentido, R= Reverse o antisentido. Análisis de la Expresión del Gen de Interés. El análisis de la expresión del gen HERG1 en las muestras de cáncer de mama y mama normal se realizó por medio de.software Fqdpcr versión 4.0, incluído con el Termociclador de Tiempo real Line Gene K (Bioer). RESULTADOS Se analizaron 26 muestras de CM y 15 muestras de mama normal, encontrándose una expresión diferencial del gen HERG1 entre estas muestras, donde se observó una clara sobreexpresión en relación a la expresión menor encontrada en las muestras de mama normal (Fig. 1).
6 MUESTRAS DE CÁNCER DE MAMA 5 MAMA NORMAL Figura 1. Expresión del gen HERG1 en valores de cuantificación relativa. 1-4, Muestras de cáncer de mama; 5, Muestra de mama normal. IMPACTO El resultado obtenido por el presente proyecto constituye información relevante, debido a que no se ha reportado con anterioridad que el gen HERG1 tenga una sobreexpresión en cáncer de mama en comparación con tejido de mama normal. Además, a pesar que cada vez van aumentando los casos de cáncer de próstata en nuestro país, convirtiendo a esta entidad clínica en un problema de salud prioritario, se han realizado pocos estudios encaminados a un diagnóstico pre-invasivo o precoz y preferentemente pronóstico. Nuestro trabajo tomado desde el punto de vista de que encontró un gen que podría funcionar como marcador molecular temprano en CP, es una línea de investigación novedosa. La evaluación de los genes encontrados como posibles marcadores moleculares tempranos y pronósticos podría ayudar a resolver cuestiones como el establecimiento de tratamientos en fases más tempranas del CP y probablemente en el reto de desarrollar nuevas terapias.
Normal PIN I PIN III Figura 1. Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN).
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