Normal PIN I PIN III Figura 1. Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN).

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1 INFORME DEL PROYECTO ANÁLISIS DE LA EXPRESION DEL GEN QUE CODIFICA PARA EL CANAL IÓNICO EAG1 COMO MARCADOR MOLECULAR TEMPRANO DE CÁNCER DE PRÓSTATA. RESUMEN En México, los tumores malignos se ubican en el segundo lugar de la tabla de mortalidad general. El Cáncer de Próstata (CP) es el tipo de cáncer más común en hombres y es la segunda causa más frecuente de muerte entre los hombres en México, con una tasa de 71.7 por 100 mil habitantes. La frecuencia del CP se incrementa conforme aumenta la edad y de hecho, el 87.5 por ciento del total de las muertes por esta causa, se registró en varones de 65 años y más. En general los CP son asintomáticos, crecen lentamente, dando lugar a un carcinoma invasivo que con el tiempo puede causar la muerte. El cuadro clínico sólo se observa cuando su tamaño rebasa el tamaño normal y tiene algún grado de invasión. Invaden primero la cápsula prostática, luego ganglios pélvicos y dan metástasis preferentemente a la columna vertebral. De hecho, al momento del diagnostico histopatológico más del 50% de los casos de CP están localmente avanzados o tienen metástasis. Es importante hacer notar que los síntomas clínicos asociados a CP no son exclusivos de esta condición, sino que pueden presentarse en otras entidades clínicas como la hipertrofia benigna de próstata. Asimismo, el marcador sérico de tumor más comúnmente usado en CP que es el antígeno prostático específico (APE), puede estar aumentado en procesos diferentes al CP y tiene una muy limitada precisión para predecir el desarrollo clínico y patológico del CP, Por esta razón, el marcador APE no es muy preciso ni absolutamente confiable, por lo cual, existe una imperiosa necesidad para encontrar factores predictivos precisos en pacientes con CP dada la marcada variación en los tratamientos a seguir. También, es importante encontrar estrategias quimiopreventivas o citostáticas que puedan emplearse en el tratamiento del CP, preferentemente de forma temprana para así mejorar el pronóstico de vida de los pacientes con CP. En el presente proyecto, nosotros propusimos caracterizar la expresión y la actividad del canal de K+, KCNH1 (EAG, Kv10.1) en biopsias de pacientes con CP y determinar si existen diferencias en el patrón e intensidad de expresión del gen del canal EAG1 entre tejidos prostáticos benignos y cancerosos, y si existe una correlación entre la expresión de este canal con diferentes estadíos del CP. En este proyecto trabajamos en el análisis de la expresión del canal EAG1 con biopsias de CP de pacientes, y biopsias de tejido prostático no canceroso con RTPCR convencional, confirmando su valor como probable marcador de diagnóstico temprano. INTRODUCCIÓN El CP es una de las neoplasias malignas más frecuentes en los hombres y se incrementa conforme aumenta la edad. En México en 1999, dentro de los tumores malignos, el cáncer de próstata (CP) se ubicó en segundo lugar en el grupo de edad postproductiva, con una tasa de 71.7 por 100 mil habitantes y se incrementa conforme aumenta la edad. De hecho, el 87.5 por ciento del total de las muertes por esta causa, se registró en varones de 65 años y más (Programa de Acción: Cáncer de Próstata. Programa Nacional de Salud Secretaría de Salud). En las primeras etapas de la enfermedad, el cáncer se limita a la próstata y no suele ser mortal. Sin embargo, el cáncer puede diseminarse a otras partes del cuerpo y con el tiempo causar la muerte. En general los CP son silenciosos, crecen lentamente, invaden primero la cápsula prostática, luego ganglios pelvianos y dan metástasis preferentemente al hueso. Clínicamente, sólo presenta síntomas cuando su tamaño rebasa el tamaño normal y tiene algún grado de invasión (Schmidt et al 1986, Garnick 1993). Por esto, al momento del diagnóstico histopatológico, más del 50% de los casos de CP están localmente avanzados o tienen metástasis. Sin embargo, los síntomas clínicos asociados a CP no son exclusivos de esta condición, sino que pueden presentarse en otras entidades clínicas como la hipertrofia benigna de próstata (proceso no canceroso que presenta crecimiento de la próstata). Estos síntomas son: orinar frecuentemente, especialmente por la noche (nicturia), necesidad repentina o urgencia de orinar, disminución de la fuerza y adelgazamiento del chorro urinario,

2 dolor o dificultad miccional (disuria), sensación de no tener nunca la vejiga vacía, pérdidas o goteos, micción vacilante o intermitente (Garnick 1993). En el CP, primero se desarrolla lo que se denomina neoplasia intraepitelial prostática (PIN, en sus siglas en inglés). Se consideran precursores de CP. Es una lesión proliferativa compuesta de células epiteliales que se dividen más rápidamente que el epitelio normal. Sin embargo, las células aún no se han hecho cancerosas. El PIN puede ser clasificado como de alto grado (III), grado medio (II) y de bajo grado (I) (Davidson et al 1995) [Figura 1]. Ya una vez desarrollado el CP, su clasificación se establece como: Tumor, Nódulo y finalmente Metástasis. La evaluación inicial consiste en determinar el estadio local del tumor, que puede ser intracapsular (T1-T2) o extracapsular (T3-T4). El tratamiento a seguir, depende importantemente del estadio que presente el tumor (Garnick 1993). Más del 95% de todos los carcinomas prostáticos son adenocarcinomas y el 97% de los tumores se originan en la periferia. Existe una clasificación basada en la diferenciación celular y la relación estromaglándula del cáncer que es la escala de Gleason. Esta escala va del 2 al 10. En general los cánceres con Gleason del 2 al 4 tienen buen pronóstico, del 5 al 7 son de pronóstico intermedio y del 8 al 10, son los de peor pronóstico. La clasificación Gleason es importante porque determina el pronóstico y la evolución (Schmidt et al 1986, Mettlin et al 1993) [Figura2]. Normal PIN I PIN III Figura 1. Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN).

3 Figura 2. Grado Histológico de Gleason. Actualmente, el diagnóstico se establece a través de estudios clínicos y de gabinete: tacto rectal, ultrasonografía, tomografía axial computarizada (TAC), resonancia magnética nuclear (RMN), y marcadores séricos del tumor; entre estos, sin duda el más importante es el antígeno prostático específico (APE) el cual se produce en el citoplasma de células prostáticas benignas y malignas (Catalona et al 1993). Desafortunadamente, el APE tiene una especificidad muy limitada, ya que no es un marcador tumoral, sino que es una proteasa que se expresa normalmente en próstata. De tal manera que el APE no es un marcador muy preciso ni absolutamente confiable, ya que puede estar aumentado también en procesos infecciosos o inflamatorios (Catalona et al 1991). Su nivel sérico se correlaciona con el volumen de ambos tejidos, maligno y benigno. El APE, se determina como normal (<4 nanogramos (ng)/ml), intermedio ng/ml y altamente sospechoso arriba de 10 ng/ml (Programa de Acción: Cáncer de Próstata. Programa Nacional de Salud Secretaría de Salud). Sin embargo, se ha visto que sólo el 25% de los individuos a los que se les practica una biopsia por niveles aumentados de APE son positivos para CP (Catalona et al, 1991). Inversamente, también se ha detectado que alrededor del 15% de individuos con niveles bajos de APE presentan CP, confirmado por biopsia (Thompson et al 2004). Los tumores de próstata crecen más lentamente que la mayoría de los tumores, pero pueden variar en su agresividad (Chodak et al 1994). Sin embargo, hasta el momento no existen herramientas que puedan funcionar como marcadores pronósticos para la progresión tumoral del CP. Esto debe de ser abordado de manera inmediata para poder ofrecerles a los pacientes con esta neoplasia mejores indicadores diagnósticos y pronósticos. Algunos de los diferentes factores de riesgo para el desarrollo de CP son: Edad avanzada, el CP es visto raramente en hombres menores de 50 años, pero la incidencia aumenta rápidamente con cada década posterior. Raza, se ha reportado una incidencia mayor de CP en raza negra que en la caucásica y oriental (Robbins et al 1998). Dieta, dietas altas en grasas saturadas coinciden con un mayor riesgo para desarrollar CP: Esto es debido a que esta grasa puede incrementar los niveles de testosterona, lo que contribuye a una elevación del riesgo de CP. Historia familiar de CP, los pacientes con parientes con CP presentan un riesgo hasta 3 veces incrementado con respecto a hombres sin antecedentes familiares (Steinberg et

4 al 1990). Esta agregación familiar de casos de CP es un dato muy importante que sugiere fuertemente la presencia de una posible susceptibilidad genética involucrada en casos de CP. Esto último se relaciona y valida la información que a nivel molecular se ha obtenido, ya que se han descrito diversas anormalidades genéticas en diferentes tipos de cáncer como: pérdida o ganancia cromosómica, amplificación génica, mutaciones que aumentan o disminuyen la expresión génica y mutaciones que conducen a cambios en la función de las proteínas. La biología y la historia natural del CP no es conocida completamente, pero actualmente existen datos que relacionan la expresión y función alterada de varios genes con el CP. Estos genes están involucrados en la regulación de ciclo celular, metabolismo de hormonas esteroides o la regulación de expresión génica. Datos recientes demuestran que la expresión de ciertos oncogenes afecta directamente la función de canales de Na +, K + y Ca 2+ (Bubien 1999) y que genes que codifican a proteínas de canales de K + tienen potencial oncogénico por sí mismas (Pardo 1999, Mu 2003). Por otro lado, algunos genes que codifican para canales iónicos se han catalogado como genes supresores de tumor en neoplasias humanas (Ivanov et al 2003, Li et al 2004). Incluso, el patrón de expresión de canales iónicos está frecuentemente alterado en células tumorales en comparación con células normales: varios tipos de canales de K + y Na + están sobreexpresados o ausentes en células cancerosas y se ha demostrado una localización anormal de canales entrantes de K + en tumores astrocíticos (Arcangeli & Becchetti 2004). La contribución de los canales iónicos a fenotipos neoplásicos es diversa y la mayoría de los estudios se enfocan al papel de los canales, especialmente de K +, en la regulación del ciclo celular (Wonderlin & Strobl 1996, Wang 2004, Arcangeli & Becchetti 2004). El papel potencial de los canales iónicos en la invasión tumoral y angiogénesis no se ha descrito hasta ahora. Sin embargo, hay datos crecientes en relación a su papel en los cambios en el citoesqueleto e interacciones célula a célula (Davis et al 2002). Estos fenómenos representan los pasos iniciales que conducen al incremento de la motilidad celular, el cual es un prerrequisito para la invasión tumoral. También se ha reportado la interacción de canales iónicos con las integrinas (Davis et al 2002, Arcangeli & Becchetti 2004). De hecho, las integrinas son receptores de adhesión importantes en la metástasis tumoral (Juliano 2002). Asimismo, cada vez se hace más claro que la invasión de células tumorales puede ser detenida con el uso de bloqueadores de canales (Fraser et al 2003, Soroceanu et al 1999, Lastraioli et al 2004). Con respecto al CP, se han identificado ya algunos canales de Ca 2+ y Na + como marcadores moleculares del proceso neoplásico. El canal selectivo a Ca 2+ TRPV6 se encontró sobreexpresado en biopsias de CP, pero sólo en estado avanzado, metastático y en lesiones prostáticas insensibles a andrógenos, mientras que los transcritos de TRPV6 fueron indetectables por hibridación in situ en tejido benigno de próstata de pacientes con hiperplasia prostática benigna (HPB) y en el tejido adyacente al cáncer (Fixemer et al 2003, Wissenbach et al 2001). Algunos otros canales iónicos se han reportado como marcadores tempranos en otros tipos de cáncer diferentes al de próstata. Entre estos canales, los de K + parecen tener un papel importante, ya que se han detectado sobreexpresados en diferentes tipos de neoplasias y de alguna manera involucrados con la regulación del crecimiento neoplásico, como es el caso de los canales: EAG1 (K v 10.1, EAG1) (Pardo et al 1999, Barajas-Farias et al 2004), HERG1 (K v 11.1, KCNH2,) (Arcangeli et al 1995, Wang et al 2002), TASK3 (KCNK9) (Kim et al 2004) y MaxiK (KCNMA1, BKCa) (Liu et al 2002, Weaver et al 2004). El gen de EAG1 codifica para un canal de K + dependiente de voltaje (K v 10.1, ether a go-go 1, KCNH1). Como muchos otros canales de K +, se ha visto que EAG1 participa en el ciclo celular y la proliferación. El canal EAG1 ha sido reportado como marcador tumoral en cáncer cervico uterino (CaCU) (Barajas-Farias et al., 2004). Por RTPCR y Southern blot, se observó expresión de EAG1 en el 100% de las muestras cancerosas y solamente en el 33% de las muestras control. El análisis detallado de estas muestras control, reveló una infección por papilomavirus (el agente etiológico conocido relacionado con CaCU más importante) e hiperplasia adenomatosa atípica, confirmando así el valor diagnóstico de EAG1 como marcador temprano de CaCU. La expresión de EAG1 se ha encontrado alterada también en otros tipos de cáncer como: cáncer de mama, de hígado, ovario, endometrio, colon y tiroides (Pardo L et al., 2002). Hasta el momento, no se ha reportado el análisis de este gen en CP. De hecho, se ha sugerido que la expresión y actividad de este canal (EAG, KCNH1) es relevante en el proceso de proliferación celular, incluso siendo considerado este canal como un posible blanco terapéutico para cáncer. Estas evidencias sobre el papel importante que juegan estos canales iónicos en la

5 biología de diferentes tipos de neoplasias, nos sirven de base para plantear el presente trabajo. A pesar que cada vez van aumentando los casos de CP en nuestro país, convirtiendo a esta entidad clínica en un problema de salud prioritario, se han realizado pocos estudios encaminados a un diagnóstico precoz y preferentemente pronóstico. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Análisis molecular de la expresión del gen del canal EAG1 en biopsias de pacientes con cáncer de próstata (CP) para establecerlo como marcador molecular temprano y pronóstico de CP. OBJETIVOS PARTICULARES 1) Obtener los valores de expresión del gen del canal EAG1 en tejidos prostáticos benignos y cancerosos. 2) Determinar si existen diferencias en el patrón e intensidad de expresión del gen del canal EAG1 en tejidos prostáticos benignos y cancerosos, y en éstos últimos en diferentes niveles de evolución neoplásica. 3) Establecer un método diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata (CP) basado en la expresión de este gen. MÉTODOS Y MATERIALES ANÁLISIS MOLECULAR DE LA EXPRESIÓN DEL GEN DEL CANAL EAG1 EN BIOPSIAS DE PACIENTES CON CÁNCER DE PRÓSTATA (CP). Aislamiento de RNA de biopsias de pacientes con CP. Para aislar RNA de biopsias de pacientes con CP montadas en parafina, se empleó el kit de extracción RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Ambion). Se utilizó TRIzol (Sigma) basado en el método de extracción con tiosanato de guanidina, fenol y cloroformo (Chomczynski, P. y Sacchi, N. 1987) para aislar RNA de las muestras de próstata normal postmortem. La calidad y cantidad del RNA obtenido se obtuvo por métodos espectrofotométricos. Experimentos de RTPCR Se sintetizó cdna a partir de RNA por transcripción reversa con oligonucleótidos hexámeros random con el kit de Superscript II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) de acuerdo al protocolo del fabricante. El cdna obtenido se sometió a amplificación con PCR usando Titanium Taq DNA Polimerase (Clontech). Los primers se diseñaron para obtener fragmentos de PCR específicos para el canal EAG1 [Tabla 1]. La ausencia de contaminación genómica en las muestras se confirmó con controles negativos de transcripción reversa (no RT) para cada experimento. Los productos amplificados se analizaron por secuenciación de DNA para confirmar su identidad. Asimismo, se realizó una reacción de PCR con primers para el gen presente en la mayoría de los tejidos de β-actina, como control de la presencia y calidad del RNA aislado [Tabla 1]. CANAL PRIMERS EAG1 F 5 - CAGCGGCTGTACTCGGGCACAG -3 R 5 - CAGAAGTGGTCGGAGAACTC -3 β-actina F 5'- GCTCGTCGTCGACAACGGCTC -3' β-actina R 5'- CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3' Tabla 1. Primers específicos utilizados para la amplificación de los genes de humano del canal EAG1 y β-actina. F= Forward o sentido, R= Reverse o antisentido.

6 RESULTADOS ANÁLISIS MOLECULAR DE LA EXPRESIÓN DEL GEN DEL CANAL EAG1 EN BIOPSIAS DE PACIENTES CON CÁNCER DE PRÓSTATA (CP). Aislamiento de RNA de biopsias de pacientes con CP. A pesar de que sólo contamos con biopsias de Cáncer de próstata embebidas en parafina, y es más difícil obtener RNA a partir de este material, logramos estandarizar la técnica para aislar RNA de este tipo de biopsias con el Kit de extracción RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (Ambion). Sin embargo, nos percatamos de que esta técnica tenía éxito sólo con muestras de más de 2 mm 2, por lo cual un gran número de muestras se descartaron con este criterio de exclusión. Actualmente, se están tratando de captar muestras con las características adeacuadas para su análisis. Experimentos de RTPCR Se sintetizó cdna exitosamente a partir de RNA por transcripción reversa con oligonucleótidos hexámeros random con el kit de Superscript II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen). El cdna obtenido se sometió a amplificación con PCR usando Titanium Taq DNA Polimerase (Clontech), utilizando primers específicos para el canal EAG1. Se realizaron controles positivos usando primers para β Actina y controles negativos (sin cdna y muestras de tejido de próstata normal postmortem) para cada experimento. Los productos amplificados se analizaron por secuenciación de DNA para confirmar su identidad. En este caso, trabajamos con 8 biopsias de cáncer de próstata adecuadas para el análisis, de las cuales, en todas se pudo obtener una banda para el canal EAG1 por RTPCR, lo cual contrasta con lo obtenido en las muestras de tejido normal de próstata, donde no es posible obtener una banda para este gen. Este resultado preliminar confirma nuestra hipótesis, la cual propone al canal EAG1 como biomarcador molecular de Cáncer de próstata, por su diferencia en expresión en los tejidos normal y neoplásico de próstata. Actualmente, proponemos la continuación de este proyecto como un proyecto recurrente para obtener más biopsias que puedan dar validez a los resultados obtenidos hasta ahora. Inmunohistoquímica Se tiene planeado llevar a cabo Análisis Inmunohistoquímico con cortes histológicos montados en portaobjetos, los cuales serán sujetos a bloqueo con albúmina por al menos 2 h a 4º C. Después de 2 lavados con PBS 1X, se incubarán por 2 horas a T ambiente con el anticuerpo específico para el canal EAG1, que es comercial, obtenido de la compañía Alomone,Labs (Israel). Posteriormente, después de 2 lavados con PBS, las laminillas se incubarán con el anticuerpo secundario Cy3 (550 nm absorción, 570 nm emisión) por 2 h a T ambiente o toda la noche a 4º C. Después de lavar 2 veces con PBS 1x, se les pondrá a las laminillas medio de montaje (Vectashield) y un cubreobjetos que se sellará con esmalte. Finalmente, se observarán en un microscopio de epifluorescencia o confocal para captar las señales específicas de los canales en estudio. Se realizarán paralelamente controles negativos, uno donde el anticuerpo primario es bloqueado con su péptido antigénico y otro utilizando únicamente anticuerpo secundario. Estos controles son importantes para comprobar que las señales obtenidas con los anticuerpos primarios son específicas. IMPACTO Existe una imperiosa necesidad para encontrar factores predictivos precisos en pacientes con CP dada la marcada variación en los tratamientos a seguir. Como ya mencionamos anteriormente, los síntomas clínicos que se presentan en pacientes con CP no son exclusivos de esta condición, sino que pueden presentarse en otras entidades clínicas como la hipertrofia benigna de próstata. Asimismo, se ha encontrado que el APE, que es el marcador sérico más comúnmente usado para confirmar el diagnóstico de CP, puede estar aumentado en procesos diferentes al CP, por lo cual no puede ser considerado absolutamente confiable para diagnosticar el CP. Además sigue siendo limitada la precisión del APE para predecir el desarrollo clínico y patológico (Narayan et al., 1995). Por esto, actualmente hay múltiples esfuerzos para estudiar aspectos moleculares del CP que puedan ayudar a esto.

7 Nosotros queremos dilucidar la relación que pueda tener el canal de K + EAG1 como marcador molecular de cáncer de próstata, debido a que este gen presenta una sobreexpresión notable en tejido neoplásico con respecto al nivel de expresión del gen en tejido no neoplásico en otros tipos de cáncer. De hecho, se ha sugerido que la expresión y actividad del canal EAG1 es relevante en el proceso de proliferación celular, incluso siendo considerado este canal como un posible blanco terapéutico para cáncer. A pesar que cada vez van aumentando los casos de cáncer de próstata en nuestro país, convirtiendo a esta entidad clínica en un problema de salud prioritario, se han realizado pocos estudios encaminados a un diagnóstico pre-invasivo o precoz y preferentemente pronóstico. Nuestro trabajo tomado desde el punto de vista de que se esta analizando un gen recientemente descubierto que podría funcionar como marcador molecular tempranos en CP, es una línea de investigación novedosa no abordada en nuestro país, ni internacionalmente hasta el momento. La evaluación de este canal junto con otros canales como marcadores moleculares tempranos y pronósticos podría ayudar a resolver cuestiones como el establecimiento de tratamientos en fases más tempranas del CP y probablemente en el reto de desarrollar nuevas terapias. Metas de formación de Estudiantes con Beca PIFI y Maestros en Ciencias. Dentro de las actividades del proyecto se incluye la participación de 2 estudiantes de la Maestría en Ciencias del Programa de Biomedicina Molecular, en la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del IPN, programa que recientemente ingresó en el Padrón Nacional de Posgrados (PNP) de CONACYT como un posgrado de Excelencia.