Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales

Transcripción

1 Perspectivas de futuro del diagnóstico prenatal de las anomalías cromosómicas fetales Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales Antoni Borrell Hospital Clínic de Barcelona

2 Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PASADO

3 Tasa procedimientos invasivos (REDCBarcelona ) total Edat 35+ Edat<

4 Cribrado secuencial con interpretación independente ~ 8% edad materna avanzada ~ 5% TN aumentada ~10% screening bioquímico positivo ~ 6% angustia ~ 1% marcadores ecografía 20 semanas 30% procedimientos invasivos 85% detección T21

5 Evolución AC y BC HCB

6 Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PRESENTE

7 Amniocentesis Biopsia Corial Obtención de líquido amniótico por punción transabdominal Obtención de vellosidades coriales por vía transcervical/transabdominal

8 Indicaciones Indicación AC BC Alto riesgo aneuploidia - edad materna avanzada - cribado bioquímico 2o trimestre - cribado combinado 1r trimestre - anomalía parental - anomalía previa - anomalía fetal 2t 1t Estudios moleculares/bioquímicos Infección fetal/amniótica

9 Edad gestacional AC < 14 s. nunca 14 s. excepcionalmente 15 s. si membranas coaptadas 16 s. idonea BC < 10 s. nunca s. TC 11 s. TA Riesgo elevado RPM y malposición extremidades Nicolaides. Lancet, 1994 Asociado a defectos de reducción de extremidades e hipoplasia oromandibular Dolk. Lancet, 1992

10 Preprocedimiento Grupo y RhD Serologías víricas VIH VHB VHC si factores de riesgo Evaluar riesgobeneficio VIH: CV, HAART VHB: HBeAg,DNA VHC: DNA AC mejor BC? Lopez & Coll, Fetal Diagn Ther 2010

11 Técnica procedimiento: AC Técnica ambulatoria Control ecográfico: previo a punción punción ecoguiada aspiración ecoguiada Romero et al. Obstet Gynecol 1995 Aguja 22-20G - Punción transplacentaria si es el acceso más fàcil al pool de LA

12 Ventajas Amnio-Vacutainer Borrell et al.,prenat Diagn 2008 Aspiración más sencilla no se necesita un segundo operador o dejar la sonda ecográfica colocación de vacutainers por auxiliar Menor manipulación Mejor transporte

13 Técnica procedimiento BC Procedimiento ambulatorio Control ecográfico continuo TC Pinza Cánula TA aguja G doble aguja cánula 18G +pinza

14 Dolor -Anestesia subcutánea AC: no diferencias RCOG AC en zona más baja, más dolor -Scores de dolor Csaba,06 41 BC-TA 35 AC 26 BC-TC -BC: TA más dolorosa en obesas TC más dolorosa en nulíparas Wax,09

15 Postprocedimiento Gammaglobulina anti-d si RhD negativo VHB: IG específica (600UI) en: - HBeAg o DNA positivo - AC transplacentaria o en tercer trimestre Reposo 24 h. Dolor abdominal: AC, BC-TA Sangrado vaginal: BC-TC Riesgo de amniorrexis Riesgo de pérdida fetal

16 AC: riesgo de pérdida fetal Estudio Randomizado Tabor,1986 en 4606 mujeres bajo riesgo: 1% exceso (1.7% vs 0.7%) Cochrane Review Alfirevic & Mujezinovik, estudios con grupo control: 0,6% exceso de pérdida Centros con experiencia 0,13% exceso de pérdida (CI 0,07-0,20).Odibo,2007 Amniocentesis de tercer trimestre (Hodor, 2007 no aumenta riesgo de RPM, DPPNI, exitus fetal, cesarea urgente

17 BC: Riesgo de perdida fetal No estudios randomizados: BC vs Control Metaanálisis Alfirevic, 2007 AC BC antes d. total Cohorte Danesa: > gestantes. AC 1.4% - BC-1.9% (Tabor,2009) Grupo control: No exceso riesgo BC. No diferencias TC vs TA (Odibo, 2008) Randomización (US) TC (2.5%) vs. TA (2.3%) (Jackson, 1992)

18 Pèrdida < 24 s. (Caughey,06

19 Pérdida fetal: Experiencia operador AC Comparación ginecológo-perinatólogo (Blessed,01) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-ac Comparación con la experiencia anual (Stone,04) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-ac segun </> 50 AC anuales BC 40% más de riesgo de perdida fetal (OR 1,4) según <1000 />1500 proc ( periodo de estudio 11 años) (Tabor, 2009)

20 Borrell, 1999 Pérdida fetal Estudio randomizado HCB 301 BC vs. 335 AC Pérdida fetal espontanea hasta 1 s. post-parto : BC 2.3% (7/301) AC 2.4% (8/335) by intention to treat: 2.3% vs. 2.3% by actual treatment: 2.3% vs. 2.4% Pérdida fetal 2 s. post-procedimiento: BC 1.7% (5/301) AC 0.9% (3/335)

21 RIESGO AMNIOCENTESIS: 0.06%? 1% vs. 0.94% hasta 24 s.

22 RIESGO ABORTO: - edad materna - peso - etnicidad - pérdidas previas - diabetes mellitus - inducción ovulación - PAPP-A bajo - DV reverso - TN aumentada

23 No resultado en AC y BC RIESGO DE NO OBTENER MUESTRA (< 1%) AC: 2 punciones blancas BC-TC: Estenosis cervical BC-TA: No acceso al corion RIESGO DE NO OBTENER UN CARIOTIPO (<1%) AC: 0.5% fallo cultivo BC directo: no hay cultivo

24 Fiabilidad de AC y BC FALSOS POSITIVOS AC: Pseudo/mosaicos (0.9%) BC: Resultado no conclusivo: mosaico/ anomalía confinada placenta (2%) FALSOS NEGATIVOS AC: Contaminación materna (<1%) BC directo: 0.4% pero 9/10 anomalías ecográficas (van denberg,06) BC directo+cultivo 0.08%

25

26

27 QF-PCR en todas las amnios? No es necesario, sólo sirve per avanzar el resultado QF-PCR substituyendo el cariotipo? Quizas sí, en casos de edad materna avanzada y screening de 2 trimestre

28 En gemelos: AC o BC? RIESGO DE CONFUSION DE MUESTRAS EN DC DA - AC: NO (no fluoresceina) - BC: 1% en 2 placentas adyacentes RIESGO DE PERDIDA FETAL - AC: 2% Yukobowich,01 en 476 gemelares - BC: 1% PRECOCIDAD RESULTADO riesgo interrupción selectiva 1 gemelo DC: 5% < 16 s. 10% s. 15% > 20 s.

29 Una o dos entradas? DICORIALES: SI MONOCORIALES DIAMNIOTICOS: NO, a no ser que exista una anomalía discordante MONOCORIALES MONOAMNIOTICOS NO es posible

30 Conclusiones 1) La edad materna no debería considerarse indicación de procedimiento invasivo 2) Los estudios genéticos y cromosómicos precisan de la extracción de material fetal mediante un procedimiento invasivo 3) Los procedimientos invasivos comportan un cierto riesgo de pérdida fetal Indicación clara 4) La AC se realiza a partir de la semana 15, idealmente en la semana 16 5) La BC es una técnica que se realiza precozmente Ventajas 6) En manos expertas, la biopsia corial y la amniocentesis tienen similar tasa de complicaciones. 7) Un programa de cribado precoz debe disponer de un método diagnóstico precoz

31 Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: FUTURO

32 Dos escenarios de futuro 1. Abandono: Diagnóstico prenatal no invasivo 2. Universalización: Estudio genómico masivo

33 Cell-free fetal DNA (cffdna) en circulación materna Descubrimiento del DNA fetal libre (cffdna) abrió nuevas perspectivas 1947: hallazgo DNA extracelular 1977: aumento DNA libre en pacientes cancer 1997: secuencias del cromosoma Y en sangre de gestantes portadoras de fetos masculinos (Lo,97)

34 Caracteristícas cffdna/rna Cuantificación cffdna en plasma: 3% en segundo trimestre 6% en tercer trimestre 10% estimaciones más recientes en T21 Persistencia cffdna: eliminación en 2h post-parto en 7/8 gestants y en todas en 2 d. (Lo,99). Vida media 16 min. Presencia RNA específico de la placenta (ZFY) en plasma materno (Poo,00).

35 Diagnóstico Prenatal no invasivo Al haber mucho más DNA libre materno que fetal, sólo es factible identificar las secuencias de origen paterno ausentes en la madre: 1) determinación sexo: cromosoma Y 2) RhD en gestantes RhD negativas 3) mutaciones paternas

36 DPNI aneuploidías 1) Selección ácidos nucleicos específicos fetales: - mrna: RNA-SNP allelic ratio - DNA metilado: epigenetic allelic ratio 2) Dosificación cromosómica relativa - Massively Parallel Sequencing (MPS)

37 RNA Allelic Ratio Localización selectiva ácidos nucleicos fetales: DNA: gen maspin (c18) imprintado en madre y no metilado en placenta RNA: transcrits PLAC4 (c21): cffrna de un gen que sólo se expresa en la placenta Dosificación cromosómica Allelic ratio : analisis de unos locus heterozigotos de SNPs (diferencia único oligonucleotido entre genomas paterno y materno) localizados en el gen estudiado.

38 Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (heterozygote) G G A 2:1 transcription release into circulation Normal Fetus (heterozygote) G A 1:1 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio

39 Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP 1:2 (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (heterozygote) G A A 1:2 transcription release into circulation Normal Fetus (heterozygote) G A 1:1 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio

40 Testing strategy for Down syndrome homozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (homozygous) A A A? transcription release into circulation Normal Fetus (homozygous) A A? 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio

41 The RNA Study (RNA-based Non-invasive testing for Aneuploidy) Jacob A. Canick & Glenn E. Palomaki Co- Principal Investigators Women & Infants Hospital Alpert Medical School of Brown University BROWN Women & Infants V4.1 An independent observational study funded by Sequenom, Inc.

42 Regiones diferentemente metiladas (DMR) en el cromosoma 21 Enriquecimiento de regiones hipermetiladas (DMR) del cromosoma 21 fetal Analisis discriminante muestra 8 DMR útiles

43

44 The Concept Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Normal Fetus Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Down syndrome Fetus 18 copies + 2 copies 20 copies 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfdna is fetal)

45 But fetal and maternal DNA are not distinguishable in MPS Relative amount of chromosome 21 Relative amount of chromosome copies + 2 copies 20 copies 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfdna is fetal)

46 Schematic illustration of the procedural framework for using massively parallel genomic sequencing for the noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy. Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

47 Schematic illustration (cont) %chr21 = 1 / 51 = 2% Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

48 Schematic illustration (cont) ` (sd=0.02) ( ) Z = = Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

49 % of all unique reads Percent unique reads and corresponding z-score for chromosome 21, on 28 maternal plasma samples Black genomic representation Blue normal male Orange normal female Green T21 male Red T21 female Z-score Normal range Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458

50 Consideraciones finales DPNI Cuando estará a punto? Screening o diagnóstico? Sólo para T21?

51

52 Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica

53

54

55 Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural

56 Síndromes microdelecionals

57

58 Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural A. génica: cambio de un par de bases

59

60 Resolución técnicas de citogenética CITOGENETICA CONVENCIONAL CITOGENETICA MOLECULAR ~10 Mb FISH ~130 Kb (sonda-específica) CGH-array 10Kb-1Mb Mb

61 CGH-array

62 CGH-array

63 CGH-array

64 CGH-array

65 CGH-array

66

67 Procedimentos invasivos? 1) ABANDONO: El DPNI de la trisomia 21 fetal está en fase de estudio y su futuro inmediato dependerá en gran medida de los resultados de los proyectos en marcha basados en MPS. 2) UNIVERSALIZACIÓN: es una posibilidad futura, cuando un estudio exhaustivo de anomalías genéticas no comporte ni tantas dudas en su interpretación (CNV), ni unos costos tan altos.