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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. : A61K 3/74 A23K 1/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Detoxificación de ciertos productos declarados tóxicos por la agencia de medioambiente mediante el uso de organismos anaeróbicos de origen natural. kprioridad: US k Titular/es: State of Oregon Acting By and Through the Oregon State Board of Higher Education on Behalf of Oregon State University P.O. Box 317 Eugene, Oregon 973, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Craig, Albert Morrie k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Gómez-Acebo Pombo, J. Miguel Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Fundamento de la invención Uno de los problemas más importantes con los que se enfrenta actualmente la humanidad es la contaminación causada por subproductos de la sociedad moderna. De hecho, la agencia de medioambiente (AMA) ha ofrecido una lista de muchos subproductos químicos orgánicos considerados como contaminantes prioritarios por dicho organismo. Entre estos contaminantes prioritarios se encuentran muchos compuestos orgánicos tales como ciertos hidrocarburos clorados, ciertos ésteres ftalato, ciertos hidrocarburos aromáticos polinucleares, ciertas triazinas y muchos fenoles de origen común. Estos contaminantes, cuando están presentes en la tierra y en el agua, son difíciles de separar y causan muchos riesgos potenciales tales como riesgos carcinogénicos, riesgos para órganos humanos tales como hígado (necrosis), y riesgos para animales domésticos que de manera inadvertida puedan ingerir cantidades suficientes de los contaminantes para interferir con sus procesos metabólicos normales. A corto plazo, los riesgos potenciales no solo serán para la salud humana, sino también para la salud de algunas de las fuentes alimenticias del hombre. Una de las soluciones potenciales para la descontaminación del medio ambiente puede consistir en la degradación de los compuestos tóxicos por medio de microorganismos. En estos momentos, tanto ecologistas como microbiólogos están comenzando a desempolvar una serie de microorganismos con ciertas capacidades sorprendentes para biodegradar algunos de los productos químicosmedioambientalesmás tenaces y más recalcitrantes. Uno de tales grupos de productos químicos medioambientales muy peligrosos incluye los acaloides de pirrolizidina, los cuales contienen normalmente el anillo alcaloide de la siguiente estructura: Se sabe que los alcaloides de pirrolizidina (PA) son producidos por ciertas plantas que crecen en pastizales usados para animales domésticos, particularmente para ganados vacuno y ovino. Una de estas plantas de origen natural es la hierba de Santiago (Senecio Jacobaea). En particular, la hierba de Santiago cuando se concentra en el aporte alimenticio de ganado vacuno puede traducirse en la acumulación de alcaloides de pirrolizidina dentro de los órganos del animal, causando daños en el hígado. Durante la vida del animal puede disminuir su crecimiento y rendimiento global. Ya se han ofrecido datos en el pasado de que las plantas tóxicas dan lugar al 9,7% aproximadamente de todas las muertes del ganado en los Estados Unidos. Los forrajes que contienen plantas con alcaloides de pirrolizidina son comunes y se distribuyen por todo este país, así como por el resto del mundo. Los ganados vacuno y equino así como los humanos son altamente susceptibles a este principio tóxico, produciéndose una enfermedad crónica hepática terminal, después de consumir una cantidad tan pequeña como % de su peso corporal, del material vegetal. Por otro lado, se ha observado que el ganado ovino puede ingerir cantidades de muchas de estas plantas tóxicas, y en particular hierba de Santiago, en tasas tan elevadas como del 0% de su peso corporal, sin que hayan podido registrarse anormalidades. Esta propiedad inusual del ganado ovino en comparación con el ganado vacuno y ganado equino ha conducido a una investigación de los motivos por los cuales el ganado ovino tiene esta resistencia aparente. Se ha descubierto, sorprendentemente, que el fluido ruminal del ganado ovino contiene ciertos factores microbiales capaces de detoxificar ciertos contaminantes declarados prioritarios por la AMA, incluyendo alcaloides de pirrolizidina. Estas observaciones iniciales de la naturaleza ycarácter de los factores microbiales del rumen de las ovejas ha conducido a una investigación sobre el uso de factores bacteriales anaeróbicos similares para reducir los niveles de alcaloides de pirrolizidina en forrajes contaminados con plantas tóxicas, cuya investigación ha conducido al uso de composiciones que contienen estas bacterias de origen natural del fluido ruminal de las ovejas para utilizarse como detoxificadores generales de contaminantes prioritarios de la AMA. Por tanto, puede apreciarse que existe la clara posibilidad de construir genéticamente los factores protectores del fluido ruminal de las ovejas yañadirlos a los inoculantes de forrajes, o bien al rumen de las vacas, o bien cabe la posibilidad de utilizarlos simplemente en composiciones como agentes detoxificantes generales para contaminantes declarados prioritarios por la AMA. El resultado neto es que los contaminantes pueden oxidarse a compuestos menos dañinos, que los forrajes contaminados pueden ser protegidos y que los pastos pueden ser ingeridos de manera segura. En consecuencia, el principal objeto de la presente invención es preparar composiciones detoxificantes que pueden ser útiles para detoxificar contaminantes prioritarios, y en particular PA, y preparar composiciones detoxificantes que pueden ser usadas en inoculantes de forrajes y/o en la inoculación directa dentro del rumen de animales menos resistentes, tales como vacas y caballos. El método para conseguir éste y otros objetos de la presente invención será evidente a partir de la siguiente descripción detallada. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un gráfico que muestra la capacidad del fluido ruminal de las ovejas para metabolizar alcaloide de pirrolizidina (PA). LaFigura2esungráfico que muestra la detoxificación del fluido ruminal ovino de PA, después del preacondicionamiento de la hierba de Santiago. Resumen de la invención Se proporciona una composición de medios de cultivo que contiene cantidades eficaces detoxificantes de bacterias normalmente contenidas en

3 3 ES T3 4 el fluido ruminal de ovejas. Dicha composición se emplea como agente detoxificante, como inoculante de forrajes y para emplearse en el tratamiento directo de animales que normalmente no son resistentes a agentes tóxicos tales como alcaloides de pirrolizidina. Descripción detallada de la invención Esta invención implica el reciente descubrimiento de que ciertos organismos anaeróbicos biodegradan ciertos contaminantes declarados prioritarios por la AMA y más concretamente alcaloides de pirrolizidina. Estos microorganismos anaeróbicos de origen natural se derivan del fluido ruminal de las ovejas. La investigación se comenzó después de hacer la observación inicial de que las ovejas domésticas parecen ser desusualmente resistentes al envenenamiento por hierba de Santiago, mientras que las vacas y caballos que pacen sobre el mismo pasto no eran tan resistentes. Las vacas y caballos mostraron los síntomas clásicos de toxicidad por alcaloides de pirrolizidina, tales como necrosis hepática y endurecimiento de los vasos sanguíneos, junto con un rendimiento funcional del animal mucho menor en términos generales. Aunque el fluido ruminal de las ovejas contiene muchas bacterias diferentes, se ha descubierto que resulta crítico para las propiedades detoxificantes del fluido ruminal de las ovejas la necesidad de una combinación de bacterias de los siguientes géneros: Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., y Ruminococcus op. y preferentemente, pero no esencial, Veillonella sp. y Eubacterium sp. Las composiciones que contienen esta combinación de bacterias antes enumeradas, tienen la capacidad de degradar los alcaloides de pirrolizidina. No se conoce con seguridad como funciona esta biodegradación, pero se cree que metabolitos de los organismos oxidan los alcaloides de pirrolizidina al dividir el anillo alcaloide. Para los alcaloides de pirrolizidina es preferible que la composición contenga streptococcus sp. y peptococcus ymás preferentemente que contenga también al menos otras dos bacterias gram - positivas. De manera sorprendente, la combinación de los microorganismos anaeróbicos anteriormente especificados no solo es eficaz contra los alcaloides de pirrolizidina, sino que también es eficaz contra numerosos contaminantes declarados como prioritarios por la AMA. Estos contaminantes prioritarios de la AMA pertenecen a categorías principales: fenoles, triazinas, hidrocarburos aromáticos polinucleares, ésteres ftalato e hidrocarburos clorados. Entre los fenoles que pueden ser biodegradados por las composiciones bacteriales de la presente invención se encuentran los siguientes: 2,4,6 - triclorofenol, 4 - cloro metilfenol, 2 - clorofenol, 2,4 - diclorofenol, 2,4 - dimetilfenol, 2 - nitrofenol, 4 - nitrofenol, 2,4 - dinitrofenol, 2 - metil - 4,6 - dinitrofenol, pentaclorofenol y fenol. Entre los hidrocarburos aromáticos polinucleares que pueden ser biodegradados por las composiciones bacteriales de la presente invención, se encuentran los siguientes: acenafteno, fluoranteno, naftaleno, benzo (a) antraceno, benzo (a) pireno, benzo (b) fluoranteno, benzo (k) fluoranteno, criseno (93%), acenafti leno, antraceno, benzo (ghi) perileno, fluoreno, fenantreno, dibenzo (a,h) antraceno, indeno (1,2,3 - cd) pireno, y pireno. Finalmente, entre los hidrocarburos clorados que pueden ser biodegradados por las composiciones de la presente invención se encuentran los siguientes: 1,2,4 - triclorobenceno, hexaclorobenceno, hexacloroetano, 2 - cloronaftaleno, 1,2 - diclorobenceno, 1,3 - diclorobenceno, 1,4 - diclorobenceno y hexaclorobutadieno. Para los fenoles, se ha observado que es preferible que la composición contenga Ruminococcus sp. y para las triazinas se ha comprobado que es preferible incluir otras bacterias formadoras de esporas tal como Clostridia sp. Sin embargo, todos estos microorganismos están presentes en cantidades suficientes en el fluido ruminal de las ovejas. El uso del metabolismo bacterial para degradar estos contaminantes de la AMA ofrece un medio natural e importante de limpieza medioambiental. Ofrece el potencial de eliminar muchos de los carcinógenos químicos de preocupación para la humanidad, así como el potencial de hacer que muchos de estos contaminantes sean menos persistentes y menos tóxicos para el medioambiente. La detoxificación del alcaloide de pirrolizidina de la hierba de Santiago en el fluido ruminal de las ovejas ha conducido directamente al descubrimiento de la presente invención. En términos generales, ha podido demostrarse de manera definitiva que la biodegradación de alcaloides de pirrolizidina (PA) de la planta hierba de Santiago puede reducirse o eliminarse por el fluido ruminal de las ovejas. Además, como queda demostrado por los ejemplos ofrecidos más adelante, este fluido ruminal se ha comprobado que biodegrada otros contaminantes prioritarios. Un hecho común a todos los fluidos ruminales de ovejas que demostraron exhibir esta propiedad reside en la combinación de bacterias de los siguientes géneros: Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp. y Ruminococcus sp. En general, cada una de estas bacterias deberá estar presente en concentraciones aproximadamente similares en el organismo. En particular, las concentraciones de cada una de ellas deberá serde 8 a 12.Enlacomposición preferida pueden existir también bacterias de los siguientes géneros adicionales: Veillonella sp. y Eubacterium sp. y algunas bacterias formadoras de esporas. Estos organismos preferidos, cuando están presentes, deberán estarlo en los mismos niveles de concentración anteriormente expresados. Las bacterias pueden estar contenidas en un sistema portador nutriente convencional. Preferentemente, el sistema deberá estar diseñado para simular y mantener las mismas condiciones ecológicas que en el rumen de las ovejas, en particular el ph dentro de la gama de 6,8 a 7,2 aproximadamente. Si bien el fluido ruminal de las ovejas funcionará deunmodoeficazcomodi- cho medio, también pueden utilizarse ciertos medios sintéticos en combinación con los organismos anteriormente indicados. En particular, pueden emplearse medios que simulan el habitat del rumen desde otros aspectos, así comoelph.en- tre los medios que simulan con éxito el habitat del rumen. se incluyen RCGA (fluido r uminal, c elobiosa, g lucosa y a uger, Bryant and Burkey, 3

4 ES T ) y 98. (una modificación de RCGA, Bryant and Robinson, 1961). Ambos medios contienen % de fluido ruminal esterilizado y son similares en cuanto a concentraciones de sal y minerales; sin embargo, el medio 98. contiene menos azúcares. otro medio de utilidad es el medio de enriquecimiento de alcaloides de pirrolizidina modificado respecto al registrado por Shelton and Tiedje, 1984, elcualcontieneunmedio basal de sales, trazas de minerales y vitaminas al cual se añade fluido ruminal (% de fracción sobrenadante). Cabe indicar que las bacterias detoxificantes son al parecer capaces de sobrevivir en diversos medios que funcionan de un modo eficaz como portadores - nutrientes, siendo los criterios más importantes el control con éxito del ph dentro de la gama anteriormente indicada. Un medio particular designado para simular la composición de la saliva de ovejas es el tampón de McDougall constituido en gramos/litro por lo siguiente: NaHCO 3-9,8;KCl-0,7;Na 2 HPO 4 :12 H 2 O9,3, NaCl - 0,47; MgCl 2 (anhid) - 0,06; CaCl 2 (anhid) 0,04. En adición, se añadió a la solución (NH 4 ) 2 SO 4 en una concentración de 2,64 g/l. Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no limitar, el proceso y composiciones de la presente invención. Ejemplo 1 Se llevó a cabo una serie de experimentos in vitro que comparan las capacidades y tasas de degradación del fluido ruminal ovino versus bovino utilizando una técnica de rumen artificial Hungates modificada con botellas de suero. En estos experimentos se extrajo por medios manuales fluido ruminal a través de una fístula permanente en el rumen de ovejas y vacas. El fluido ruminal fue inmediatamente filtradoatravés de una malla de nylon al interior de una botella termostatada previamente calentada (38 C) para su transporte hacia el laboratorio. El fluido ruminal fue cortado 0/0 con tampón de McDougall previamente calentado e inundado con dióxido de carbono y se añadió alcaloide de pirrolizidina cristalino a la solución en una concentración de mg/ml (alcaloide de pirrolizidina en tampón fosfato a ph 6,8). Una parte alícuota del fluido ruminal fue pasteurizada en cada experimento antes de la incubación. Todas las botellas fueron inundadas con dióxido de carbono e incubadas a 38 C en un incubador sacudidor. Se tomaron muestras en el tiempo 0, 12, 24 y 48 horas y el alcaloide de pirrolizidina fue extractado y cuantificado usando cromatografía en fase líquida de alto rendimiento (HPLC). En la Figura 1 se muestran los resultados. En resumen, como puede verse a partir de la Figura 1, en donde se utiliza un número de experimentos con ovejas (n = 1) y vacas () fue evidente que los microorganismos contenidos en el fluido ruminal de las ovejas metabolizaron el alcaloide de pirrolizidina en 1224 horas, mientras que únicamente se degradó una porción menor del alcaloide de pirrolizidina por parte del microorganismo bovino. La pasteurización eliminó lapoblación de microorganismos con el resultado de la persistencia de las concentraciones de alcaloide de pirrolizidina. En cada uno de los casos, el fluido ruminal de las ovejas fue examinado, encontrándose que contenía los siguientes géneros de bacterias: Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp. and Bacteroides sp. En algunos casos, contenían también Veillonella sp. y Eubacterium sp. Ejemplo 2 Se ha comprobado que los microorganismos del rumen de las ovejas pueden ser inducidos ambientalmente con un incremento resultante en la tasa de detoxificación de alcaloide de pirrolizidina. Esto se efectuó añadiendo % de hierba de Santiago a la dieta diaria de las ovejas. En estos experimentos, el tiempo de detoxificación disminuyó respecto de la media de aproximadamente 48 horas a valores comprendidos entre 12 y 24 horas, en función del animal particular evaluado. Esto se ilustra en la Figura 2 la cual muestra el efecto del acondicionamiento con hierba de Santiago sobre la conversión de PA. Otros ensayos in vitro han inducido a las bacterias a que disminuyan adicionalmente el tiempo de detoxificación. En particular, la reposición diaria del fluido ruminal in vitro, durante 4 días, con microgramos/ml de alcaloides de pirrolizidina, disminuyó lamediade48horasavalores comprendidos entre 6 y horas. Esto indica que puede inducirse, durante varios días, la bacteria y/o vía de acceso enzimática que metaboliza el alcaloide. Ejemplo 3 Una tercera serie de experimentos fue diseñada para aislar el tipo de microorganismos en el fluido ruminal de las ovejas que eran responsables de la detoxificación del alcaloide de pirrolizidina. Se llevó a cabo un centrifugado diferencial del fluido ruminal completo y los sobrenadantes resultantes se ensayaron respecto a su capacidad para metabolizar alcaloides de pirrolizidina, en comparación con su respectivo fluido de control sin centrifugar. Se analizaron las tasas de detoxificación de 1 experimentos realizados por separado. El análisis de los datos, junto con la evaluación microscópica de los sobrenadantes, determinaron que los principales microorganismos degradantes fueron un consorcio de bacterias de los siguientes géneros: Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., Ruminococcus sp. Los datos obtenidos por cromatografía en fase gaseosa - espectrofotometría de masas sobre el fluido ruminal entero, así como sobre las fracciones sobrenadantes de la centrifugación, indicaron que el anillo pirrol, que es la espina dorsal de los alcaloides de pirrolizidina, se rompió durante el proceso de degradación. En el caso de que se efectúen experimentos similares sobre otros contaminantes declarados prioritarios por la AMA, en particular fenoles y triazinas y quizá hidrocarburos aromáticos polinucleares, ésteres ftalato e hidrocarburos clorados, podrán obtenerse resultados similares. En particular, para fenoles y triazinas, se observaron en cada uno de los casos disminuciones similares en el nivel de productos tóxicos en el uso de fluido ruminal entero de ovejas. Concretamente, el análisis GC/MS del fluido ruminal revela la ausencia de estructura de compuestos de anillo característicos de los picos de productos tóxicos. 4

5 7 ES T3 8 La capacidad de esta combinación de bacterias para degradar ciertos contaminantes declarados prioritarios por la AMA ofrece la oportunidad de muchos usos. En particular, la combinación de bacterias en un medio portador - nutriente convencional puede utilizarse por sí misma como composición detoxificante. Alternativamente, se puede emplear como inoculante para productos de forrajes o ensilados. Igualmente, se puede combinar con fluido ruminal de otros animales, generalmente en una proporción de 0/0 aproximadamente, y utilizarse entonces para tratar, por ejemplo, vacas y caballos, al objeto de dotarlos de la misma resistencia tóxica única que proporciona 1 de forma natural el fluido ruminal de las ovejas. En el caso de que se utilice como probiótico, la composición puede contener 70% de fluido ruminal de oveja y % de fluido ruminal de vaca, para utilizarse con ganado bovino. Los niveles de fluido ruminal de 0:0 oveja/vaca pueden oscilar entre 0:0 y 70:. Igualmente, puede ser posible añadir simplemente los organismos aislados directamente al rumen bovino y conseguir así resultados similares. Puede apreciarse que la invención logra al menos todos sus objetivos anteriormente establecidos

6 9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Una composición bacterial para detoxificar ciertos productos tóxicos declarados prioritarios por la AMA y seleccionados del grupo consistente en fenoles, triazinas, hidrocarburos aromáticos polinucleares e hidrocarburos clorados, y constituida como una composición de medio de cultivo - portador nutriente, caracterizada porque contiene una cantidad eficaz detoxificante de un consorcio bacterial contenido normalmente en el fluido ruminal de ovejas y que incluye al menos los siguientes géneros de bacterias: Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., y Ruminococcus sp. 2. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada porque contiene además Veillonella sp. y Eubacterium sp. 3. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende bacterias formadoras de esporas. 4. Una composición según la reivindicación 2, caracterizada porque el medio de cultivo se encuentra a un ph de 6,8 a 7,2.. Una composición según la reivindicación 4, caracterizada porque el medio de cultivo simula la composición nutriente del fluido ruminal de las ovejas. 6. Una composición según la reivindicación 1 2, caracterizada porque el medio de cultivo es tampón de McDougall. 7. Una composición inoculante para productos ensilados, que contiene un consorcio de origen natural de bacterias capaces detoxificar alcaloides de pirrolizidina (PA) que aparecen de forma natural en ciertos pastizales, caracterizada porque comprende una composición de medio de cultivo - portador nutriente que contiene una cantidad eficaz detoxificante de un consorcio de bacterias normalmente contenidas en el fluido ruminal de las ovejas, incluyendo Streptococcus sp., Peptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., y Ruminococcus sp. 8. Un método para detoxificar productos tóxicos declarados prioritarios por la AMA, en particular aquellos seleccionados del grupo consistente en fenoles, triazinas, hidrocarburos aromáticos polinucleares e hidrocarburos clorados, caracterizado porque comprende degradar dichos productos tóxicos con una cantidad eficaz de un consorcio de bacterias derivadas del fluido ruminal de las ovejas, empleándose dicho consorcio de bacterias en forma de una composición como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, con la condición de que dicho método no es practicado sobre el cuerpo humano odeanimales NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 6

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