LEER CAMBIOS SOMBREADOS

Transcripción

1 LEER CAMBIOS SOMBREADOS bioblot HTLV tests Ensayo inmunoenzimático cualitativo para la detección de anticuerpos frente a los virus T-Linfotrópicos humanos tipo I (HTLV-I) y tipo II (HTLV-II) en suero o plasma humanos. Su uso previsto es como análisis complementario más específico para muestras de suero o plasma humanos que presentan reactividad repetida utilizando procedimientos de cribado como la técnica de ELISA. Sumario Estudios epidemiológicos recientes, realizados en Estados Unidos y Europa, confirman la presencia de prevalencia mixta de HTLV-I y HTLV-II en diferentes poblaciones de alto riesgo, tales como usuarios de drogas intravenosas. Existe actualmente una amplia disponibilidad de pruebas de cribado para determinar la presencia de anticuerpos frente al HTLV-I y HTLV-II. Las muestras que presentan reactividad repetida utilizando procedimientos de cribado, requieren análisis de confirmación de seropositividad de HTLV-I y HTLV-II más específicos. Dichos análisis deben ser capaces de identificar anticuerpos anti proteínas de la cápside (gag) y de la envuelta (env). Uno de los tests complementarios comúnmente usados son tiras de Western blot que incorporan antígenos nativos del virus HTLV-I. Sin embargo, debido a la falta de antígenos nativos de envelope en el test clásico de Western blot para HTLV-I, métodos de radioinmunoprecipitación son frecuentemente necesarios para confirmar la presencia de anticuerpos frente a HTLV-I/HTLV-II. La discriminación entre seropositividad frente a HTLV-I y HTLV-II requiere análisis complementarios (ej. péptidos específicos, ELISAs, PCR). El kit bioblot HTLV tiene alta sensibilidad y especificidad tanto para la confirmación como para la diferenciación de serorectividad frente a HTLV-I y HTLV-II. Eso es posible gracias a la incorporación de MTA-1, proteína recombinante de envuelta exclusiva del HTLV-I (rgp46-i), combinada con K55, proteína recombinante de envuelta exclusiva del HTLV-II (rgp46-ii) y de una proteína recombinante de envuelta específica de HTLV-I y de HTLV-II (rgp21). Cada tira incluye también un control interno de adición de muestras para reducir al mínimo el riesgo de falsos negativos debidos a errores operativos y para garantizar la adición de las muestras. El uso previsto del kit bioblot HTLV es como análisis serológico complementario para la caracterización de muestras que presentan reactividad repetida utilizando métodos de cribado. Los posibles perfiles serológicos definidos por el bioblot HTLV son los siguientes: positivo de HTLV, positivo de HTLV-I, positivo de HTLV-II, negativo e indeterminado. Principio Las tiras de nitrocelulosa incorporan proteínas del virus HTLV-I derivadas de partículas virales nativas lisadas inactivadas y proteínas obtenidas por ingeniería genética. Las tiras de nitrocelulosa individuales se incuban muestras diluidas de suero o plasma y controles. Si la muestra contiene anticuerpos específicos frente a HTLV-I/II, dichos anticuerpos se unirán a las proteínas del HTLV-I/II de las tiras. A continuación se lavan las tiras para eliminar el material no ligado. Los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas del HTLV se pueden detectar mediante una serie de reacciones con anticuerpos de cabra anti-igg humana conjugados con fosfatasa alcalina y el sustrato BCIP/NBT. La sensibilidad de este método permite detectar en el suero o plasma cantidades ínfimas de anticuerpos específicos frente al HTLV. Componentes 1. STRIPS TIRAS DE NITROCELULOSA: 18 tiras de nitrocelulosa que contienen lisado viral de HTLV-I, antígenos recombinantes de envuelta y una banda de control de adición de suero (anti-igg humana). Las tiras están numeradas consecutivamente del 1 al 18, o del 19 al 36. Mantener secas y al abrigo de la luz. 2. CONJ 1000x CONJUGADO CONCENTRADO: 1 x 120 µl de anticuerpos de cabra anti-igg humana conjugados con fosfatasa alcalina. Contiene azida sódica. 3. CONTROL CONTROL NEGATIVO: 1 x 80 µl de suero humano inactivado negativo en anticuerpos frente a HTLV-I/II, HIV-1, HIV-2, y HCV, y en antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Contiene azida sódica y mertiolato sódico. 4. CONTROL + I CONTROL POSITIVO FUERTE HTLV-I: 1 x 80 µl de suero humano inactivado conteniendo un elevado título de anticuerpos IgG frente al HTLV-I. Negativo en antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y en anticuerpos frente a HCV y HIV-1/2. Contiene azida sódica y mertiolato sódico.

2 5. CONTROL + II CONTROL POSITIVO FUERTE HTLV-II: 1 x 80 µl de suero humano inactivado conteniendo un elevado título de anticuerpos IgG frente al HTLV-II. Negativo en antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y en anticuerpos frente a HCV y HIV-1/2. Contiene azida sódica y mertiolato sódico. 6. WASH SOLN 20x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA: 1 x 70 ml de tampón Tris concentrado (20x). Contiene Tween 20 y mertiolato sódico. 7. BLOT BUF LYOPH TAMPÓN DE BLOTTING LIOFILIZADO: 1 x 100 ml de tampón Tris liofilizado. Cada frasco debe rehidratarse con 100 ml de agua de calidad reactivo. Contiene proteínas animales y no animales inactivadas por calor y mertiolato sódico. 8. SUBS SUSTRATO: 1 x 100 ml de solución de 5-bromo-4-chloro-3-indolil-fosfato (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT). Listo para usar. 9. BLOT POW POLVO DE BLOTTING: 10 x 1 g de leche descremada en polvo. 10. TRAYS BANDEJAS DE INCUBACIÓN: 2 bandejas de incubación de 9 pocillos. 11. FORCEPS PINZAS: 1 pinza. Precauciones bioblot HTLV es sólo para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. Consulte las etiquetas del producto para obtener información sobre los componentes potencialmente peligrosos. INFORMACIÓN SANITARIA Y DE SEGURIDAD PRECAUCIONES: Este kit contiene productos de origen humano. Ningún método de análisis permite ofrecer una garantía absoluta de que los hemoderivados humanos no transmitan una infección. MANIPULE LAS MUESTRAS, LOS CONTROLES POSITIVO FUERTE I, POSITIVO FUERTE II Y EL CONTROL NEGATIVO COMO SI FUERAN POTENCIALMENTE INFECCIOSOS. Se recomienda manipular los componentes del kit y las muestras, de conformidad con las buenas prácticas de laboratorio. Asimismo, deben desecharse siguiendo los procedimientos de seguridad establecidos. El control positivo fuerte I, el control positivo fuerte II y el control negativo contienen mertiolato y azida sódica; el tampón de blotting liofilizado y el tampón de lavado concentrado contienen mertiolato; el conjugado contiene azida sódica. La azida sódica puede reaccionar con el cobre y el plomo que se utilizan en ciertas tuberías y formar sales explosivas. Aunque las cantidades que se usan en este kit son pequeñas, los materiales que contienen azida deben eliminarse con volúmenes relativamente grandes de agua para evitar la acumulación de azidas metálicas en las tuberías. A continuación figuran las frases relativas a los riesgos (R) correspondientes. R20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. El sustrato contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y nitroazul de tetrazolio, clasificados como nocivos (Xn) por las directivas de la Comunidad Económica Europea (CEE) que son de aplicación. A continuación figuran las frases relativas a los riesgos (R) correspondientes. R20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. 1. Evite la contaminación microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes alícuotas de los viales o frascos originales. 2. No pipetee con la boca. 3. Manipule las muestras, las tiras de nitrocelulosa, los controles positivos fuerte I y II y el control negativo como si fueran potencialmente infecciosos.

3 4. Use bata de laboratorio y guantes desechables mientras realiza el ensayo. Deseche los guantes en bolsas para residuos biopeligrosos. Lávese bien las manos al finalizar. 5. Es muy recomendable que este ensayo se lleve a cabo en una cámara de bioseguridad. 6. Mantenga el material alejado de bebidas y alimentos. 7. En caso de accidente o contacto con los ojos, lávese inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. 8. Acuda a un médico de inmediato si ingiere material contaminado o si éste entra en contacto con heridas abiertas u otras lesiones de la piel. 9. Limpie de inmediato los vertidos de material potencialmente peligroso con un papel absorbente y lave la zona contaminada con una solución de hipoclorito sódico al 1% antes de reanudar el trabajo. El hipoclorito sódico no debe utilizarse para vertidos que contengan ácido, a menos que se seque la zona previamente con un papel absorbente. Para su eliminación, el material utilizado (incluidos los guantes desechables) debe tratarse como material de riesgo biológico. No utilice el autoclave para el material que contenga hipoclorito sódico. 10. Esterilice en autoclave todos los materiales usados y contaminados a 121 C y 15 psi durante 30 minutos antes de desecharlos. Otra opción consiste en descontaminar los materiales con una solución de hipoclorito sódico al 5% durante minutos antes de desecharlos en una bolsa para residuos de riesgo biológico. 11. Descontamine todos los productos químicos y reactivos usados añadiéndoles un volumen de hipoclorito sódico suficiente como para conseguir una concentración final de al menos el 1%. Déjelos en reposo durante 30 minutos para lograr una descontaminación eficaz. 12. No recomendamos la reutilización de las bandejas de incubación. PRECAUCIONES ANALÍTICAS 1. Para obtener un rendimiento óptimo del ensayo es necesario un CUMPLIMIENTO ESTRICTO del procedimiento descrito en el presente Manual de instrucciones. Cualquier modificación del procedimiento puede provocar resultados anómalos. 2. NO CAMBIE NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE UN LOTE DEL KIT POR LOS DE OTRO. Los controles, el conjugado y las tiras de Western Blot están ajustados para un funcionamiento óptimo. Use sólo los reactivos que se suministran con el kit. 3. No utilice los componentes del kit después de la fecha de caducidad que figura en la caja. 4. Evite la contaminación microbiana de los reactivos al abrirlos y al extraer partes alícuotas de los viales o frascos originales, ya que ello reduciría de forma prematura el periodo de validez de los kits y daría lugar a resultados erróneos. Al extraer partes alícuotas de los viales utilice técnicas asépticas, como pipetas o puntas de pipeta desechables. 5. Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo que las muestras clínicas en cada serie de análisis. 6. Para evitar la contaminación cruzada, use una punta de pipeta nueva para cada alícuota de la muestra. 7. Para obtener resultados óptimos, dispense todos los reactivos mientras todavía estén fríos y vuélvalos a guardar a 2 C - 8 C lo antes posible. 8. Se aconseja lavar el material de vidrio que se vaya a utilizar para los reactivos con ácido clorhídrico 2M y aclararlo bien con agua destilada o desionizada antes de usarlo. 9. Utilice sólo agua destilada o desionizada de calidad reactivo para diluir los reactivos. 10. Todos los reactivos deben mezclarse bien antes de su uso. 11. La solución del conjugado de trabajo, el tampón de lavado diluido y el tampón de blotting deben estar recién preparados.

4 12. La solución del conjugado de trabajo debe prepararse en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno. 13. No exponga los reactivos ni realice el análisis en un área en la que exista un nivel elevado de vapores de desinfectantes químicos (p. ej., vapores de hipoclorito) durante las etapas de almacenamiento y de incubación: el contacto inhibe la reacción de color. Los reactivos tampoco deben exponerse a la luz intensa. 14. Es preferible efectuar el ensayo a temperatura ambiente (25 C ± 3 C). 15. Asegúrese de colocar las tiras con los números hacia arriba. 16. En los ensayos de Western Blot es importante utilizar un agitador con plato basculante; el uso de un agitador rotativo podría poner en peligro el rendimiento del kit. La velocidad de agitación y el ángulo de inclinación recomendados son, respectivamente, de 12 a 16 ciclos por minuto y de 5 a 10 grados. 17. Si se utiliza equipo automatizado, debe verificarse que haya sido validado antes de su uso. 18. Asegúrese de añadir las muestras sin que toquen la tira. Para ello, puede inclinar la bandeja y añadir la muestra en la parte baja donde se acumula el tampón. De este modo se evitará la formación de puntos negros debidos a la adición de muestra a la tira. 19. No utilice congeladores con función de descongelación automática para conservar los reactivos y las muestras. Instrucciones de conservación 1. Conserve el bioblot HTLV y sus componentes a 2 C - 8 C cuando no se estén utilizando. 2. Todos los reactivos y tiras de análisis, si se conservan a 2 C - 8 C, son estables hasta la fecha de caducidad que figura en el kit. No congele los reactivos. A. Tiras de antígenos - Evite las exposiciones innecesarias de las tiras de antígenos a la luz. B. Reactivos - Conserve los reactivos en sus viales o frascos originales, que deben permanecer tapados. - Dispense todos los reactivos cuando aún estén fríos y vuélvalos a guardar a 2 C - 8 C lo antes posible. - Cuando el sustrato se conserva a 2 C - 8 C puede precipitar, sin que ello afecte al funcionamiento del kit. PRECAUCIÓN: Evite las exposiciones innecesarias del sustrato a la luz. Recolección de las muestras Se pueden utilizar muestras de suero o plasma con EDTA, heparina o citrato sódico. Antes de guardar las muestras, verifique que se hayan separado por centrifugación los coágulos o las células sanguíneas. Las muestras deben conservarse a 2 C - 8 C si el análisis se va a llevar a cabo en los 7 días posteriores a la extracción, o congelarse a una temperatura de al menos -20 C si el análisis se va a retrasar más de 7 días. Es preferible utilizar muestras transparentes y no hemolizadas. Las muestras lipémicas, ictéricas o contaminadas (por partículas o bacterias) deben filtrarse (0,45 μm) o centrifugarse antes del ensayo. El suero de los pacientes puede estar inactivado, pero no es un requisito indispensable para el funcionamiento óptimo del análisis. Para efectuar la inactivación: 1. Afloje las tapas de los recipientes con el suero. 2. Caliente el suero a 56 C durante 30 minutos al baño de agua. 3. Deje enfriar el suero antes de volver a ajustar las tapas. 4. El suero puede conservarse congelado hasta el análisis. Recomendamos que el suero de los pacientes no se someta a ciclos repetidos de congelación y descongelación antes del ensayo.

5 Material necesario no incluido en el kit - Agua destilada o desionizada. - Guantes desechables. - Plato basculante (con velocidad de balanceo de oscilaciones por minuto e inclinación de 5-10 para lavar las tiras uniformemente). - Pipetas y puntas del volumen adecuado. - Aspirador con depósito de hipoclorito sódico. - Baño de agua a 56 C (optativo). - Hipoclorito sódico para la descontaminación. Operaciones previas 1. SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA (a) La SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA debe estar recién preparada. (b) Diluya 1 volumen de SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA (20X) con 19 volúmenes de agua de calidad reactivo. Mezcle bien. 2. TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO (a) Reconstituir cada vial de TAMPÓN DE BLOTTING LIOFILIZADO con 100 ml de agua de calidad reactivo. Mezclar bien. El TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO es estable durante 6 semanas si se conserva a 2 C - 8 C. (b) El TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO debe estar recién preparado. (c) Añada 1 g de POLVO DE BLOTTING (1 paquete) por cada 20 ml del TAMPÓN DE BLOTTING reconstituido preparado en el paso 2(a) anterior. Agite hasta que el polvo se disuelva por completo. (d) Agite de nuevo antes de dispensar la mezcla. 3. SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO NOTA: prepare la solución en un recipiente o vaso de precipitado de polipropileno. (a) LA SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO debe estar recién preparada. (b) Prepare la SOLUCIÓN DECONJUGADO DE TRABAJO diluyendo CONJUGADO en TAMPÓN DE BLOTTING DE TRABAJO en proporción de 1:1000; p. ej., 10 µl de CONJUGADO en 10 ml de TAMPÓN DE BLOTTING DE TRABAJO. 4. SOLUCIÓN SUSTRATO (lista para su uso) (a) Dispense el volumen necesario directamente del frasco. Use una pipeta limpia. Cierre bien el frasco después de usarlo. Realización del ensayo NOTA: a) Aspire todos los productos químicos y reactivos utilizados con un aspirador provisto de depósito con hipoclorito sódico. b) Todas las incubaciones deben efectuarse en un plato basculante. PRECAUCIONES: Algunas muestras pueden causar manchas oscuras en el punto de la tira en el que se añadieron. Para evitar este problema, proceda de la forma siguiente: I. Añada siempre la muestra después de haber dispensado el TAMPÓN DE BLOTTING. II. Incline ligeramente la bandeja elevando su extremo superior o su fondo. El tampón de blotting se desplazará hacia la zona más baja de la bandeja. Añada la muestra en la zona en la que se haya acumulado el tampón de blotting. Cuando haya dispensado todas las muestras, devuelva la bandeja a su posición plana inicial. Asegúrese siempre de que las tiras se mantengan húmedas durante el proceso. III. Otra opción, si no desea inclinar la bandeja, es dispensar las muestras en el extremo superior o en el fondo del pocillo. De esta forma, si aparecen manchas oscuras, la lectura de los resultados de la tira no se verá afectada. Procedimiento: 1. Utilizando unas pinzas, extraiga con cuidado del tubo la cantidad de TIRAS necesaria y coloque cada tira en su pocillo con el número hacia arriba. Incluya tiras para los controles positivo fuerte I, positivo fuerte II y negativo. 2. Añada 2 ml de SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA a cada pocillo. 2 ml

6 3. Incube las tiras durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente (25 ± 3 C) en un plato basculante (velocidad 12 a 16 oscilaciones por minuto). Extraiga el tampón por aspiración. 5 minutos 4. Añada 2 ml de TAMPÓN DE BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo. 2 ml 5. Añada 20 μl de suero de los pacientes o de controles, según corresponda, en cada uno de los pocillos. Debe tomar precauciones para evitar añadir las muestras directamente en las tiras. 6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura ambiente (25 ± 3 C) en el plato basculante. 20 μl 60 minutos 7. Destape la bandeja con cuidado para evitar salpicaduras y el mezclado de las muestras. Incline la bandeja para aspirar la mezcla de los pocillos. Cambie las puntas del aspirador entre muestras para evitar la contaminación cruzada. 8. Lave 3 veces cada tira con 2 ml de SOLUCIÓN DE LAVADO DILUIDA, dejando en remojo durante 5 minutos en el plato basculante entre los lavados. 3 x 2 ml 9. Añada 2 ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo. 2 ml 10. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura ambiente (25 ± 3 C) en el plato basculante. 60 minutos 11. Aspire el CONJUGADO de los pocillos. Lave como en el paso 8. 3 x 2 ml 12. Añada 2 ml de SOLUCIÓN SUSTRATO a cada pocillo. 2 ml 13. Cubra la bandeja e incube durante 15 minutos en el plato basculante. 15 minutos 14. Aspire el SUSTRATO y aclare las tiras un mínimo de tres veces con agua de calidad reactivo para detener la reacción (el lavado insuficiente durante esta etapa puede provocar la aparición de un fondo oscuro). 3 x 2 ml 15. Utilizando unas pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel. Cúbralas con los paños de papel y séquelas. Otra posibilidad es dejar que las tiras se sequen en los pocillos de la bandeja. 16. Coloque las tiras en una hoja de trabajo (papel blanco no absorbente). No aplique cinta adhesiva sobre las bandas reveladas. Observe las bandas (véase Interpretación de los resultados) y califique los resultados. Para el almacenamiento, mantenga las tiras en la oscuridad. RESUMEN DE LOS PROTOCOLOS DE ENSAYO Reactivos Cantidad Tiempo Tiras de nitrocelulosa 1 - Solución de lavado 2 ml 5 min Tampón de blotting 2 ml - Muestra 20 μl 60 min Solución de lavado 3 x 2 ml 3 x 5 min Conjugado 2 ml 60 min Solución de lavado 3 x 2 ml 3 x 5 min Sustrato (listo para usar) 2 ml 15 min Agua destilada 3 x 2 ml -

7 CANTIDAD DE REACTIVOS NECESARIA PARA DIVERSOS NÚMEROS DE TIRAS Reactivos Número de tiras a utilizar Solución de lavado diluida (ml) Tampón de blotting de trabajo (ml) Conjugado de trabajo (ml) Sustrato (ml) Polvo de blotting (g) Control de calidad Recomendamos que se analicen en todos los ensayos los controles negativo y ambos controles positivos fuertes, independientemente del número de muestras que se analicen. Para que los resultados obtenidos en cualquier ensayo se consideren válidos se deben cumplir las siguientes condiciones: 1. CONTROL NEGATIVO No deben observarse bandas específicas del HTLV-I/II, rgp46-i, rgp46-ii o rgp21 en las tiras de control negativo. La banda de control de suero (anti-igg humana) debe ser visible. 2. CONTROL POSITIVO FUERTE I Todas las bandas del peso molecular relevante deben ser evidentes. En la Figura 1 se muestra una guía de las posiciones relativas de las bandas visualizadas con el ensayo bioblot HTLV que permite identificar las bandas que se observan para el CONTROL POSITIVO FUERTE I. Las bandas son p19, p24, gp46, rgp46-i, rgp21 y posiblemente otras como se ve en la figura 1. Observar que la banda gp46 es difusa. La banda del control de suero debe ser visible. 3. CONTROL POSITIVO FUERTE II Todas las bandas del peso molecular relevante deben ser evidentes. En la Figura 1 se muestra una guía de las posiciones relativas de las bandas visualizadas con el ensayo bioblot HTLV que permite identificar las bandas que se observan para el CONTROL POSITIVO FUERTE II. Las bandas son p24, rgp21 y rgp46-ii y posiblemente otras como se ve en la figura 1. La banda del control de suero debe ser visible. Interpretación de los resultados NOTA: las tiras reveladas deben estar completamente secas para evitar errores en la interpretación. La presencia o ausencia de anticuerpos frente al HTLV-I/II en la muestra se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tiras de control del ensayo con los controles NEGATIVO y ambos CONTROLES POSITIVOS FUERTES. La Figura 1 (vea la última página de este inserto) puede servir de ayuda para la identificación de las diversas bandas que aparecen en la tira que se ha hecho reaccionar con los dos controles POSITIVOS FUERTES. El proceso de interpretación consta de los siguientes pasos: 1. Verificación de que la banda del control de suero es visible. Si el control es negativo, los resultados deben considerarse no válidos, ya que ello indica un error técnico, como por ejemplo la falta de adición de muestra, de conjugado o de sustrato. 2. Identificación del peso molecular de cada banda de la tira de análisis utilizando como guía las tiras del control POSITIVO FUERTE I, del control POSITIVO FUERTE II o de ambos. 3. La interpretación posterior de la tira de análisis se basa en la detección de patrones específicos de las bandas según las recomendaciones de las autoridades pertinentes (Ministerio de Sanidad, Organización Mundial de la Salud, etc.). Recomendamos las siguientes directrices para la interpretación del bioblot HTLV. Deben registrarse los resultados de todas las bandas detectadas, e interpretarse como NEGATIVO, POSITIVO o INDETERMINADO.

8 PERFIL No aparecen bandas específicas del HTLV. Positividad en bandas GAG (p19 con o sin p24) y dos bandas ENV (rgp46-i y rgp21). Positividad en bandas GAG (p24 con o sin p19) y dos ENV (rgp46-ii y rgp21). Positividad en bandas GAG (p19 y p24) y en ENV (rgp21). HTLV-I POSITIVO si p19 p24 HTLV-II POSITIVO si p19 < p24 INTERPRETACIÓN NEGATIVO POSITIVO DE HTLV-I POSITIVO DE HTLV-II POSITIVO DE HTLV (1) Una o más bandas específicas de HTLV presentes, pero su patrón no cumple con los criterios de positividad. No obstante, los siguientes patrones indeterminados pueden interpretarse como SERONEGATIVOS: - HTLV-I GAG patrones indeterminados de Western blot (HGIP): Presencia de p19, p26, p28, p32, p36, p53 pero ausencia de p24 y de cualquier banda de proteína ENV. - Cualquier combinación de proteínas GAG (p19, p26, p28, p32, p36, p53) pero ausencia de p24 y de cualquier proteína ENV. - Una única de las proteínas GAG (p19, p24, p26, p28, p32 p36, p53). INDETERMINADO (2) (1) Muestras seropositivas para HTLV de tipo no identificable pueden ser resueltas utilizándose el algoritmo de Wiktor et al en ausencia de rgp46-i y de rgp46-ii Este algoritmo, que utiliza la reactividad relativa a la p19 y a la p24 se ha demostrado efectivo en la diferenciación de los dos serotipos. 7,11,12,13,14 (2) La interpretación de indeterminado se basa en las pautas de la OMS de Sin embargo, varios estudios han sugerido que algunos patrones indeterminados de bandas (listados arriba) pueden interpretarse como seronegativos especialmente con donantes sanos Por ejemplo, un estudio con donantes sanos, confirmó que HGIP puede ser interpretado con seguridad como seronegativo. 26 Con todo, hay que tener cautela cuando patrones indeterminados se obtienen con usuarios de drogas inyectables o con donantes de sangre de áreas endémicas e con pacientes de enfermedades neurológicas. 26,27 Es posible encontrar sueros de personas infectadas con ambos los tipos de HTLV, aunque sea raro. Tales individuos presentarán un perfil de bandas que indicará positividad tanto para HTLV-I como para HTLV-II. Los datos disponibles demuestran que la seroreactividad a rgp46-i es específica para HTLV-I mientras que la seroreactividad a rgp46-ii es específica para HTLV-II. Por lo tanto, los sueros reactivos a rpg46-i, rgp46-ii, gp21, p19 y p24 presentan un perfil característico de doble infección. Limitaciones del método Para conseguir unos resultados óptimos con este método, deben seguirse de forma estricta los pasos descritos en el procedimiento. Cualquier desviación puede dar lugar a resultados aberrantes. Un resultado NEGATIVO no excluye la posibilidad de exposición o infección por HTLV-I o HTLV-II. Los resultados de blot INDETERMINADOS no deben utilizarse como base para el diagnóstico de infección por HTLV-I/II. Se han descrito algunos casos de seroreactividad a la p19 o a la p24 en poblaciones no infectadas de bajo riesgo, aunque indeterminados de p24 sean relativamente raros. Los datos disponibles de sensibilidad de la rgp46-i son de 95% en Francia, 100% de las muestras confirmadas por PCR en Estados Unidos y Jamaica y más del 98% con muestras de donantes de sangre seropositivos para HTLV-I. La rgp46-ii demostró una sensibilidad superior al 98% con muestras confirmadas por PCR en Estados Unidos.

9 La sensibilidad total estimada de cada antígeno tipo específico, rgp46-i y rgp46-ii, es más del 97%. El pequeño porcentaje de muestras de HTLV-I y HTLV-II que no reaccionan con rgp46-i ni con rgp46-ii son reactivas por lo menos con rgp21 y una o más bandas GAG, p19 o p24, cumpliendo el criterio de seropositivo para HTLV o indeterminado. No hay registros de interpretaciones falso negativas. Ensayos suplementales como el PCR pueden ayudar en la discriminación de muestras seropositivas para HTLV que no pueden ser identificadas como HTLV-I o HTLV-II con el bioblot HTLV. Características funcionales Las características funcionales del bioblot HTLV para la detección de anticuerpos anti HTLV-I y HTLV-II se evaluaron utilizando muestras seronegativas y seropositivas de HTLV-I/II, por comparación con dos inmunoensayos de línea (inmunoblots) que incorporan antígenos HTLV-I o HTLV-II (proteínas recombinantes o péptidos). Sensibilidad: La sensibilidad del bioblot HTLV se determinó utilizando muestras positivas de anticuerpos anti-htlv-i o/y anti-htlv-ii confirmadas por ELISAs comerciales. A. Comparación con el Inmunoblot 1 Los resultados de la comparación entre el bioblot HTLV y el inmunoblot 1 para muestras positivas suministradas por Boston Biomedica, Inc., USA (BBI) y ProMedDx son los siguientes: Método Inmunoblot 1 NEG / IND POS Total NEG / IND 3* 0 3 bioblot HTLV POS Total * bioblot HTLV dio 2 resultados indeterminados y 1 negativo, que resultó también negativo con el inmunoblot 1. El inmunoblot 1 dio 3 resultados negativos. La discriminación de las 102 muestras positivas de HTLV entre ambos blots es la siguiente: Interpretación Método HTLV-I & Total HTLV-I HTLV-II No-tipable*** HTLV-II** bioblot HTLV Inmunoblot ** Aparecen marcadores específicos de HTLV-I y HTLV-II que indican co-infección. ***No es posible tipar las clases de HTLV debido a la ausencia de marcadores específicos. Ambos métodos, bioblot HTLV e inmunoblot 1 reportan resultados similares. Los escasos resultados discrepantes son debidos a los diferentes antígenos inmovilizados en el blot y a la diferencia de métodos usados. El bioblot HTLV presenta una sensibilidad de 97,1% equivalente a la obtenida con el inmunoblot 1. B. Comparación con el inmunoblot 2 Se estudiaron las siguientes muestras: Panel anti-htlv-i/ii de la Sociedad Francesa de Transfusión de Sangre, SFTS-94 compuesto por 26 HTLV-I y 6 HTLV-II. Los resultados del bioblot HTLV comparados con los del Inmunoblot 2 son los siguientes: Método Interpretación HTLV-I HTLV-II No-tipable Falso NEG Total bioblot HTLV Inmunoblot El bioblot HTLV identifica correctamente las muestras positivas de HTLV mostrando una sensibilidad > 99,9% en este panel. Utilizando el mismo panel, el kit de comparación (inmunoblot 2) dio una sensibilidad de 96,9%.

10 Especificidad: Se analizó un total de 200 muestras de donantes de sangre resultando una especificidad de 92,5%. 15 muestras fueron indeterminadas y no se detectaron resultados falsos positivos. Si se incluyen las siguientes muestras: 150 de procedencia clínica, 50 de embarazadas, 50 potencialmente interferentes (10 de ictericia, 10 hemolizados,10 triglicéridos, 10 lipémicos y 10 de proteína total) y 73 con posible reacción cruzada (TB, Helicobactor pylori, HEV, Dengue, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2), la especificidad global es de 89,2% (461/517). 56 muestras fueron indeterminadas y no se detectaron resultados falsos positivos. 6 muestras fueron positivos reales confirmados por otro test confirmatorio. Cláusula de exención de responsabilidad El fabricante garantiza exclusivamente que el kit de análisis funcionará como ensayo diagnóstico in vitro, de acuerdo con las especificaciones y limitaciones descritas en el Manual de instrucciones del producto, cuando se use de conformidad con las instrucciones citadas en el mismo. El fabricante rehusa cualquier garantía, explícita o implícita, incluida la garantía explícita o implícita relativa a la comercialización, adecuación para el uso o supuesta utilidad para cualquier fin. El fabricante sólo se obliga a la sustitución del producto o al reembolso del precio de compra del mismo. El fabricante no será responsable ante el comprador ni ante terceros, de cualesquiera daños, perjuicios o pérdidas económicas provocados por la utilización o la aplicación del producto. Problemas técnicos En caso de problemas técnicos o si desea presentar una reclamación, proceda de la siguiente manera: 1. Anote el número de lote del kit y su fecha de caducidad y el número de lote de la tira. 2. Conserve los kits y los resultados obtenidos. 3. Póngase en contacto con su distribuidor local.

11 bioblot: Guía de problemas Problema Posibles causas Problema Posibles causas 1. Aparecen manchas oscuras en las tiras 1a. Contaminación bacteriana o fúngica de la muestra de ensayo. 4. Aparece un fuerte fondo oscuro en la tira en ausencia o presencia de bandas positivas. 4a. Tiras excesivamente desarrolladas (detener la reacción antes). 1b. Precipitación de inmuno complejos en muestra de ensayo envejecida. 1c. Contaminación bacteriana o fúngica de las tiras debido a almacenaje incorrecto. 1d. Tiras físicamente dañadas, rotas o rayadas. 1e. Lavado inadecuado de las tiras entre etapas del ensayo. 5. Ausencia de la banda Control de Suero 4b. Lavado incompleto. 5a. Suero no añadido. 5b. Tiras volteadas durante el ensayo 5c. Conjugado no añadido. 2. Aparecen manchas blancas en las tiras 2a. Tiras volteadas durante el ensayo. 5d. Sustrato no añadido. 2b. Lavado inadecuado de la bandeja antes de su uso. 2c. Disolución deficiente del polvo de Blotting. 6. Las tiras son defectuosas 6a. Están rotas. 6b. Contienen burbujas de aire que provocan la aparición de manchas blancas en las zonas reactivas suficientemente grandes como para evitar cualquier detección. 3. Aparecen otras bandas además de la banda Control de Suero en el control negativo. 2d. Interferencias electrotransblot durante la fabricación. 3a. Puede haber contaminación cruzada en los pocillos de la bandeja o los controles. 6c. Muestran manchas oscuras, debido al crecimiento de hongos después de la apertura inicial de los tubos. Sin embargo, si las manchas oscuras se desarrollan después de la apertura inicial del tubo, el problema es debido al inadecuado almacenamiento de las tiras por el usuario.

12 bioblot: Guía de problemas Problem Possible causes Problem Possible causes 7.1. Las bandas esperadas no aparecen o son de intensidad débil. 7.1a. Reactivos no preparados adecuadamente. 8a. Muestra o dilución del conjugado incorrecta. Y control positivo débil. 7.1b.Dilución incorrecta del conjugado. 8. No hay bandas específicas y/o aparece fondo oscuro en las tiras. 8b. Muestra o incubación de los reactivos demasiado larga. El problema es causado probablemente por los reactivos. 7.2 Las bandas esperadas no aparecen o son de intensidad débil. Y control positivo OK. El problema es causado probablemente por la muestra. 7.1c. Reactivos inestables debido a una temperatura de exposición inadecuada. 7.1d. Conjugado contaminado con IgG humana. 7.1e. ph del sustrato incorrecto debido su exposición a una fuerte luz UV o a un agente reductor. 7.1f. Bandejas, reactivo(s) o agua tiene alta concentración de fosfato. 7.1g. Plataforma rotatoria utilizada en lugar de la plataforma oscilante. 7.2a. Dilución incorrecta de la muestra. 7.2b. Muestra contaminada con conjugado. 7.2c. Muestra con gran cantidad de inmuno complejos. 7.2d. IgGs de la muestra deterioradas o desnaturalizadas debido al almacenamiento inapropiado o a repetidos ciclos de congelacióndescongelación. 7.2e. Plataforma rotatoria utilizada en lugar de la plataforma oscilante. 7.2f. La muestra puede ser un falso positivo de ELISA. 9. Bandas específicas de HTLV detectadas en el control negativo y/o en muestras negativas conocidas. 10. Marcas acuosas desarrolladas en las tiras. 8c. Lavado incompleto durante el ensayo. 8d. Temperatura de incubación superior a 30 C. 8e. Muestra reactiva con proteinas no virales. 9a. Bandeja contaminada con una muestra postiva o con el control positivo. 9b. Control negativo/muestra contaminados con control positivo/muestra. 9c. Misma punta de la pipeta utilizada para dosificación y/o eliminación de las muestras/control. 9d. La muestra puede ser un falso negativo de ELISA. 10a.Las tiras se dejan secar antes de la adición de tampón Blotting.

13 FIGURA 1 Control de suero rgp46-i rgp46-ii p53 gp46 p36 p32 p28 p26 p24 p19 rgp21 a b c d Bandas víricas específicas tal y como se ven con: a. Un suero con infección doble HTLV-I/II. b. Control positivo fuerte I (reactivo sólo para el HTLV-I) c. Control positivo fuerte II (reactivo sólo para el HTLV-II) d. Control negativo.