5. SOLN TMB CROMÓGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO). Contiene colorante rojo.

Transcripción

1 LEER CAMBIOS SOMBREADOS bioelisa anti-hbs tests Test de ELISA para la detección y cuantificación de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (anti-hbs) en suero humano. Sumario La hepatitis B es una enfermedad causada por una infección vírica. A lo largo de una infección aparecen varios marcadores serológicos entre los cuales está el anti-hbs. La mayoría (> 80%) de los pacientes infectados por el virus de la hepatitis B (HBV) presenta una fase aguda, seguida de convalecencia con posterior recuperación. En estos pacientes suelen aparecer anticuerpos contra el antígeno de superficie (HBsAg) a las pocas semanas de la desaparición de éste de la circulación. El anti-hbs es, el principal marcador indicativo de recuperación y de inmunidad. 4 El uso de la vacuna contra la hepatitis B ha aumentado la utilidad de determinar anti-hbs, ya sea en el cribado pre-inmunización (los individuos deben ser negativos para HBsAg, anti-hbc y anti-hbs) o en la monitorización de una seroconversión después de una inmunización. Una concentración sérica de anti-hbs superior a 10 mui/ml se considera como protectora. 1,2,4,5,9 La cuantificación de anti-hbs también es muy importante en la selección de muestras de plasma para preparar inmunoglobulinas anti-hbs específicas para inmunización pasiva. Principio bioelisa anti-hbs es un método inmunoenzimático directo, de tipo "sandwich" en el que las muestras a analizar se incuban en pocillos de una microplaca que se han recubierto con HBsAg (subtipos ad y ay) altamente purificado. Si la muestra contiene anticuerpos anti-hbs, éstos se unirán específicamente al HBsAg que recubre el pocillo. Después de lavar para extraer la muestra residual, se añade HBsAg conjugado con peroxidasa, que reaccionará con el complejo antígeno-anticuerpo formado en la primera incubación. Después de esta segunda incubación y posterior lavado se añade una solución de sustrato enzimático y cromógeno. Esta solución desarrollará un color azul si la muestra contiene anti-hbs. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad de color es proporcional a la concentración de anti-hbs en la muestra. La concentración de anticuerpos en la muestra puede calcularse por interpolación en una curva de calibración. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocillos recubiertos con HBsAg (subtipos ad y ay) purificado de plasma humano e inactivado. Pocillos separables individualmente. 2. CONJ CONJUGADO: 1 x 12 ml de HBsAg (subtipos ad y ay) purificado de plasma humano e inactivado, conjugado con peroxidasa. Contiene colorante rojo, proteínas estabilizadoras y mertiolato sódico al 0.02%. Listo para usar. 3. WASH SOLN 10x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA: 2 x 50 ml de tampón fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sódico al 0,01%. A diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse. 4. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: 1 x 14 ml de tampón citrato-acetato que contiene peróxido de hidrógeno. 5. SOLN TMB CROMÓGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO). Contiene colorante rojo. 6. CAL + H CALIBRADOR POSITIVO ALTO: 1 x 1,7 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-hbs diluido en tampón fosfato. Contiene colorante verde, proteínas estabilizadoras y azida sódica al 0,02%. Listo para usar. Concentración = 100 mui/ml de anti-hbs. Calibrado frente a la 1ª preparación de referencia de la OMS para inmunoglobulina anti-hbs suministrada por el Laboratorio Central de Servicio de Transfusiones Sanguíneas (CLB) de Amsterdam, Holanda. 7. CAL + L CALIBRADOR POSITIVO BAJO: 1 x 1,7 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-hbs diluido en tampón fosfato. Contiene colorante verde, proteínas estabilizadoras y azida sódica al 0,02%. Listo para usar. Concentración = 10 mui/ml de anti-hbs. Calibrado frente a la 1ª preparación de referencia de la OMS para inmunoglobulina anti-hbs suministrada por el Laboratorio Central de Servicio de Transfusiones Sanguíneas (CLB) de Amsterdam, Holanda.

2 8. CONTROL CONTROL NEGATIVO: 1 x 12 ml de suero humano diluido negativo para todos los marcadores del virus de la hepatitis B. Contiene colorante amarillo y azida sódica al 0,02%. Listo para usar. 9. H 2 SO 4 1N SOLUCIÓN DE PARADA: 1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Listo para usar. 10. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 11. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. 12. GRAPH HOJA DE PAPEL MILIMETRADO: Para realizar la determinación cuantitativa. Precauciones bioelisa anti-hbs es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial aprobado, excepto cuando necesariamente positivo. El HBsAg utilizado en el recubrimiento de los pocillos de la microplaca y en el conjugado, ha sido inactivado a 60 C durante 10 horas. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución: - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua. - Usar guantes. - No pipetear ningún reactivo con la boca. - No fumar. - Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121 C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico). - Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. - No usar los reactivos una vez hayan caducado. - No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre los reactivos. - Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. - Es muy importante preparar la solución de sustrato-tmb justo 5-10 minutos antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. - Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-tmb, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable.

3 Conservación y estabilidad Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8 C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8 C. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustrato-tmb una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilización. Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada. - Pipetas multicanal y micropipetas (50 µl, 100 µl, 1000 µl) y puntas desechables. - Incubador a 37 C 1 C. - Cronómetro. - Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 ó 630 nm. - Sistema de lavado manual o automático. Recolección de la muestra Usar suero fresco. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20 C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. Procesamiento automático Esta prueba permite su uso de modo automático o semiautomático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25 C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos. Diluir la solución de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de solución de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa, preparar el volumen proporcional de solución. Monitorización de la adición de muestra y de reactivos El hecho de que la muestra no requiere predilución y que todos los reactivos, el control negativo y los calibradores son coloreados permite la monitorización de su adición en la microplaca tanto visualmente como por medio de lectura espectrofotométrica. Para ello, después de dispensar una placa esta puede leerse a 450 nm (sin filtro de referencia). Los valores de absorbancia deben ser: SUERO / CONTROL / CALIBRADORES 0,100 CONJUGADO (color rojo) 0,500 SUSTRATO DE TRABAJO (color rosa) 0,050 Si la lectura de un pocillo no da un resultado dentro de lo esperado, ello indica que ha habido algún problema en la dispensación que debe ser investigado. Ensayo cualitativo (o cuantitativo hasta 100 mul/ml) Utilizar la muestra sin diluir. Ensayo cuantitativo Para la cuantificación de muestras con concentraciones superiores a 100 mui/ml, deben realizarse las siguientes diluciones:

4 1. Preparar 200 µl de las diluciones 1/10 y 1/100 de cada una de las muestras a valorar según el siguiente esquema: Dilución 1/10: Dilución 1/100: 20 µl de muestra. 180 µl de control negativo. 20 µl de la dilución 1/10 de la muestra correspondiente. 180 µl de control negativo. Si se sospecha que la concentración de alguna de las muestras es superior a mui/ml, se deben efectuar diluciones superiores a partir de la dilución 1/100 siguiendo el mismo protocolo de dilución (20 µl de muestra diluida µl de control negativo). Realización de la prueba 1. Utilizar sólo el número de tiras necesarias para cada ensayo. Reservar 8 pocillos para el blanco y los controles. Transferir 100 µl de control negativo a 2 pocillos, 100 µl de calibrador positivo alto a 2 pocillos y 100 µl de calibrador positivo bajo a 3 pocillos. Dejar vacío un pocillo para el blanco del substrato. 2. Ensayo cualitativo: Transferir 100 µl de cada una de las muestras a analizar al pocillo correspondiente. Ensayo cuantitativo: Transferir 100 µl de cada muestra sin diluir, diluida 1/10 y diluida 1/100 al pocillo correspondiente. Para cada muestra se requieren 3 pocillos. 3. Cubrir la placa con una lámina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37 C. 4. Quitar y desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 350 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración y lavado 3 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. 5. Añadir 100 µl de conjugado a cada pocillo, a excepción del pocillo para el blanco. Evitar la formación de burbujas. 6. Cubrir la placa con una lámina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 30 minutos a 37 C. 7. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una placa, añadir 280 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 1. La solución final debe ser de color rosa, descartar en caso de que se vuelva azul. TABLA 1 Tiras requeridas Tampón sustrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromógeno (TMB) µl NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18 C, el cromógeno debe alcanzar una temperatura de C y agitarse bien antes de usarlo. 8. Quitar y desechar la lámina adhesiva. Lavar la placa como en el paso Añadir 100 µl de sustrato-tmb a todos los pocillos, incluso el blanco. 10. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). 11. Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-tmb. 12. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de nm.

5 Control de calidad Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios: 1. Blanco del sustrato. El valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0, Media del control negativo (CNx). Calcular el promedio de los valores de absorbancia obtenidos para el control negativo después de restar el blanco. El valor obtenido debe ser inferior a 0,100. CNx < 0, Media del calibrador positivo bajo (CPBx). Calcular el promedio de los valores de absorbancia obtenidos para el calibrador positivo bajo después de restar el blanco. El valor obtenido debe ser superior a 0,070 y además debe ser al menos el doble del control negativo. CPBx > 0,070 CPBx 2 x CNx 4. Media del calibrador positivo alto (CPAx). Calcular el promedio de los valores de absorbancia obtenidos para el calibrador positivo alto después de restar el blanco. El valor obtenido debe estar comprendido entre 0,800 y 2,100. 0,800 CPAx 2,100 Si alguno de los valores no está dentro de los límites, debe repetirse la prueba. Resultados Ensayo cualitativo 1. Calcular el promedio de absorbancia obtenidos para el calibrador positivo bajo. El valor que se obtiene es el valor umbral. Valor umbral = CPBx 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: ratio absorbancia/valor umbral 1,0 Negativo: ratio absorbancia/valor umbral 0,9 Dudoso: ratio absorbancia/valor umbral 0,9 1,0 Ensayo cuantitativo Efectuar una representación gráfica de coordinadas lineal-lineal colocando en la abscisa (eje de las x) las concentraciones de anti-hbs del control negativo (0 mui/ml), del calibrador positivo bajo (10 mui/ml) y del calibrador positivo alto (100 mui/ml) y en la ordenada (eje de las y) los correspondientes valores de absorbancia obtenidos para los mismos. Trazar una línea pasando por los tres puntos. La concentración de anti-hbs de cada muestra puede derivarse a partir de su absorbancia, por interpolación en la curva de calibración. Si la muestra se ha diluido, multiplicar la concentración hallada por el factor de dilución para obtener la concentración de anticuerpos anti-hbs en el suero. Ejemplo: mul/ml Absorbancia CNx 0 0,012 CPBx 10 0,141 CPAx 100 1,453 Muestra sin diluir >2,000 Muestra diluida 1/10 >2,000 Muestra diluida 1/100 1,210

6 Absorbancia 450 nm bioelisa 1,6 1,4 Muestra 1/100 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, mui/ml La concentración de anticuerpos anti-hbs en el suero es 83 x 100 = 8300 mul/ml. Interpretación de los resultados Un resultado positivo para anti-hbs indica una respuesta inmune frente a una infección por el virus de la hepatitis B, una respuesta inmune a la vacuna o la presencia de anticuerpos adquiridos pasivamente. Sin embargo, niveles bajos de anti-hbs no siempre suponen protección frente al HBV. Está aceptado en general que una concentración de anti-hbs igual o superior a 10 mui/ml es indicativa de recuperación de una infección pasada o de protección en individuos vacunados. 1,2,4,5,9 Limitaciones del procedimiento Como ocurre con otras pruebas serológicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-hbs sirven solamente como ayuda al diagnóstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clínica del paciente. Para el correcto funcionamiento del kit deben seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviación puede dar origen a resultados aberrantes. Aunque los resultados cuantitativos presenten una buena correlación con otros ensayos para la mayoría de las muestras, hay cierto grado de variación e incluso variaciones importantes para algunas muestras en particular. Esto se debe a varios factores tales como la variabilidad del HBsAg, que tiene muchos subtipos antigénicos diferentes, las características del anti-hbs contenido en la muestra (especificidad y afinidad con relación a distintos epítopos) y otros factores relacionados con el propio ensayo (métodos de producción, cálculo de los resultados, etc.). Resultados superiores a 100 mui/ml no deben ser extrapolados de la curva de calibración dado que hay una saturación del ensayo con consecuente pérdida de linealidad y el valor extrapolado sería incorrecto. En este caso la muestra debe ser diluida o el resultado debe informarse como superior a 100 mui/ml. Resultados esperados Cerca del 90% de los pacientes infectados por el HBV eliminan el virus, desarrollan anti-hbs y se recuperan completamente. La prevalencia de anti-hbs y de otros marcadores de la hepatitis B varía ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, p. ej., África, Asia y Pacifico Oeste) a intermedia (20-55%, ej., sur y este europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, América del Norte y partes de América del Sur). 1 Actualmente muchos países europeos incluyen la vacuna contra la hepatitis B en su programa de inmunización y varios otros administran la vacuna a adolescentes e individuos de alto riesgo. Por esa razón la prevalencia de portadores de HBsAg está bajando y la de anti-hbs, debido a la vacunación, está en aumento. Características funcionales Sensibilidad analítica El límite de detección del bioelisa anti-hbs es < 10 mui/ml utilizando la referencia de anti-hbs de la OMS (primera preparación, 1977). Evaluaciones El funcionamiento del bioelisa anti-hbs se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. - En una evaluación interna se analizaron 102 muestras de pacientes, hospitalizados previamente clasificadas como positivas con otro ensayo comercial. Todos los resultados fueron positivos, con una sensibilidad relativa del 100% (102/102).

7 - En un estudio de sensibilidad se probaron 100 muestras de suero de personas vacunadas contra la hepatitis B y 100 muestras de personas que habían pasado la infección natural. La sensibilidad obtenida fue del 98,5% (197/200). - En otra evaluación se probaron 434 muestras de donantes de sangre con el bioelisa anti-hbs y con otro ensayo comercial. Las muestras discrepantes se probaron de nuevo para anti-hbs con un tercer ensayo comercial. De acuerdo al resultado de consenso, la especificidad obtenida fue del 99,5% (364/366) y la sensibilidad fue del 100% (68/68). - En un estudio de especificidad se probaron 173 muestras previamente clasificadas como negativas con otro método comercial. La especificidad obtenida fue del 100% (173/173). - En una evaluación interna de especificidad se probaron 150 muestras de pacientes hospitalizados previamente clasificadas como negativas con otro método comercial. La especificidad obtenida fue del 99,3% (149/150). - Un panel de seroconversión de 10 parejas de muestras consecutivas previamente analizadas con otro método comercial fueron probadas con el bioelisa anti-hbs. En todas las parejas, la segunda muestra presentó una seroconversión en comparación con la primera. Precisión Reproducibilidad intra-ensayo: Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 32 replicados de una muestra positiva fueron del 3,1%, 2,6% y 4,3% en tres lotes estudiados. Reproducibilidad inter-ensayo: Tres muestras positivas de distintos niveles se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos para los ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 2,6%, 1,3% y 1,9%. Interferencias Con el objeto de estudiar posibles interferencias se han analizado muestras con riesgo potencial de producir reacciones cruzadas. Tales muestras incluían sueros positivos de factor reumatoide (RF), de anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos heterófilos, IgM anti-hav y de mujeres embarazadas. No se han observado evidencias de interferencias.

8 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrectos. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. 1c. Contaminación cruzada entre controles. 1d. Filtro de lectura incorrecto. 1e. Interferencia en el camino óptico. Comprobar procedimiento. Comprobar procedimiento. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Comprobar que el filtro de lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620 o 630 nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades. Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura. 1f. Se han utilizado No utilizar componentes de componentes de lotes lotes diferentes puesto que diferentes. están ajustados para cada lote en particular. 1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del 2a. Uno o más reactivos no añadidos o añadidos en secuencia equivocada. 2b. Conjugado inactivo: conservación incorrecta. 2c. Microplaca inactiva: conservación incorrecta. 2d. Sustrato inactivo: conservación o dilución incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminación cruzada con la solución de parada. kit. No utilizar kits caducados. Comprobar el procedimiento. Comprobar si ha habido contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa minigrip, bien cerrada, con el desecante dentro. Repetir el ensayo. Utilizar siempre una dilución fresca de TMB en tampón sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol y enjuagados con agua desionizada. Comprobar el procedimiento.

9 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 4. Reproducibilidad pobre o elevado número de muestras reactivas que no se repiten. 3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente. 3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente. 3c. Solución de lavado (1x) contaminada. 3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro fabricante. Comprobar que el sustrato de trabajo sea color rosa, descártelo si está azul. Asegúrese que el TMB está completamente líquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampón sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solución ácida o etanol. Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo. Utilizar sólo la solución de lavado de biokit. 4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas o Utilizar pipetas calibradas con puntas mal encajadas. puntas bien ajustadas. Técnica de pipeteo Pipetear cuidadosamente sin incorrecta. burbujas ni salpicaduras. 4c. Reactivos y/o muestras no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar. 4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones. 4e. Demasiado tiempo en la adición de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire. 4f. Interferencia en el camino óptico. Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos. Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire. Desarrollar una técnica uniforme y consistente. Ver 1e.