RSV IgA E.W. REF K13RSA Σ 96. Español

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1 RSV IgA E.W. REF K13RSA Σ 96 Español M390.es Rev.2 07/2009

2 REACTIVOS DEL KIT Reactivos Cantidad MTP 1 x 96 Listo para usarse DIL 1 x 105 ml Listo para usarse STOP 1 x 15 ml Listo para usarse WASH 1 x 50 ml Conc. CONJ 1 x 20 ml Listo para usarse TMB SUBS 1 x 15 ml Listo para usarse CONTROL + 1 x 2 ml Listo para usarse C/O 1 x 2 ml Listo para usarse CONTROL 1 x 2 ml Listo para usarse M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 2/14

3 Test inmunoenzimático para la determinación cualitativa de los anticuerpos de la clase IgA para el Virus respiratorio sincitial en el suero o plasma humano Sólo para uso diagnóstico in vitro 1. INTRODUCCIÓN El virus respiratorio sincitial pertenece al grupo de los paramixovirus. Es un virus con ARN de un solo filamento y con envoltura. Provoca infecciones de las vías respiratorias de diversa gravedad. A menudo se presentan complicaciones severas en personas de alto riesgo, por ejemplo en recién nacidos, en niños pequeños, en personas ancianas y en personas con enfermedades crónicas del tracto respiratorio (bronquitis crónica). El virus respiratorio sincitial infecta los epitelios de las vías aéreas donde produce la necrosis de las células. En los tejidos en cultivo infectados con este virus las células se funden entre ellas dando lugar a un conglomerado (sincitio). El 50% de los niños de edad inferior al año está expuesto al virus, entre ellos aproximadamente el 40% presenta síntomas de pulmonía o de bronquitis. La mayor parte de los niños de más de tres años que ha contraido la infección resulta seropositiva. Sin embargo, la infección no determina una inmunidad absoluta que proteje toda la vida. Las recidivas de las infecciones en general son menos graves. El riesgo de infecciones hospitalarias, especialmente en el servicio de pediatría, es muy elevado. El virus es transmitido de una persona a otra a través de gotitas suspendidas en el aire. El virus es ubicuo y muy contagioso. Durante el otoño y el invierno las infecciones se manifiestan con mayor frecuencia. Especie Enfermedad Síntomas Modalidad de infección Virus respiratorio sincitial Rinitis, pulmonía, amigdalitis, faringitis Fiebre, tos, rinitis Transmisión: aérea; contacto directo con una persona infectada Diagnóstico Microscopía: inmunofluorescencia indirecta IFA Serología: detección de los anticuerpos con método ELISA 2. USO PREVISTO El RSV IgA E.W. es un kit para la determinación cualitativa de los anticuerpos específicos de la clase IgA para el Virus respiratorio sincitial en el suero o plasma (citrato) humano. 3. PRINCIPIO DEL TEST La determinación cualitativa de los anticuerpos IgA para el Virus respiratorio sincitial se basa en el principio ELISA. Los pocillos de la microplaca contienen una fase sólida con antígenos específicos del Virus respiratorio sincitial. Anticuerpos específicos en la muestra se unen a los antígenos inmovilizados en los pocillos. Los anticuerpos del conjugado (peroxidasa de rábano-anticuerpos anti- M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 3/14

4 IgA humanas) se unen a los complejos antígenos (fase sólida)-anticuerpo (paciente) en las muestras positivas. Estos complejos se evidencian por una coloración azul después de la incubación con la solución TMB. La intensidad de esta coloración es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos ante el Virus respiratorio sincitial de clase IgA presentes en la muestra. Bloqueando la reacción enzimática con ácido sulfúrico se produce un cambio en el color de azul a amarillo que puede medirse fácilmente con un fotómetro para ELISA a 450 nm. 4. MATERIALES 4.1. Reactivos suministrados MTP Microplaca sensibilizada: 1 microplaca de 96 pocillos (12x8) divisibles, con antígenos inactivados del Virus Respiratorio Sincitial (RSV) adheridos; sellada al vacío, dentro de un sobre de aluminio que puede volver a cerrarse. DIL Diluyente de las muestras IgA***: 1 vial con 105 ml de tampón para diluir las muestras; ph 7.2 ± 0.2; color amarillo. Listo para usar. STOP Solución Stop: 1 vial con 15 ml de ácido sulfúrico, 0,2 mol/l, listo para usar. WASH Tampón de Lavado (20x)*: 1 vial con 50 ml de un tampón concentrado 20 veces para el lavado de los pocillos; ph 7.2 ± 0.2. CONJ Conjugado Enzimático**: 1 vial con 20 ml de anticuerpos de conejo anti- IgA humanas, conjugados con peroxidasa; color violeta; listo para usar. TMB SUBS Solución TMB-Substrato: 1 vial con 15 ml de 3,3`,5,5`-Tetrametilbencidina (TMB); listo para usar. CONTROL + Control Positivo ***: 1 vial con 2 ml de solución de control lista para usar; color amarillo. C/O Control Cut-off ***: 1 vial con 2 ml de solución de control lista para usar; color amarillo. CONTROL Control Negativo ***: 1 vial con 2 ml de solución de control lista para usar; color amarillo. * contiene: 2 % Bronidox L ** contiene: 0.2 % Bronidox L *** contiene: 0.1 % Kathon y 0.09% Azida Sódica 4.2. Accesorios suministrados 1 soporte para microplacas 1 película adhesiva 1 Manual para el uso 1 Esquema de distribución e identificación de muestras y controles 4.3. Materiales y equipos requeridos Ensayo Manual Fotómetro para microplacas con filtros de 450/620 nm Incubadora a 37 C Lavador de microplacas Micropipetas con puntas desechables (10, 100, 200, 1000 µl) M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 4/14

5 Vortex Mixer Probetas desechables Soporte para probetas Agua desionizada o destilada. Timer Ensayo Automático El dispositivo puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad sobre instrumentación RADIM y/o SEAC. Cuando se utilice instrumentación automática de otros proveedores, es responsabilidad del usario asegurarse que el kit haya sido oportunamente validado. 5. MODALIDAD DE CONSERVACIÓN Los reactivos se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, si se conservan a 2-8 C. 6. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Llevar todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25 C) antes de usarlos! 6.1. Microplaca sensibilizada Los pocillos, con los antígenos inactivados del Virus Respiratorio Sincitial adheridos, se pueden separar y son sellados al vacío. Los pocillos, listos para usar, deben conservarse a 2-8 C. Volver a colocar los pocillos no utilizados en la bolsa con el gel desecante de sílice. El producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C Conjugado Enzimático El vial contiene 20 ml de solución compuesta de anticuerpos anti-iga humanas conjugados con peroxidasa de rábano, tampón, estabilizantes, conservantes y un colorante inerte violeta. Una vez abierto, el producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C Controles Los viales del Control Positivo, Cut-off y Control Negativo contienen 2 ml de solución lista para usar. Una vez abierto, el producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C Diluyente de las muestras IgA: El vial contiene 105 ml de tampón de fosfato, estabilizantes, conservantes y un colorante amarillo inerte. La solución, lista para usar, se utiliza para diluir las muestras. Una vez abierto, el producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C Tampón de Lavado (20x) El vial contiene 50 ml de un tampón concentrado, detergentes y conservantes. Una vez abierto, el Tampón concentrado es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C. Diluir el contenido con agua desionizada o destilada (1 + 19), ej.: 10 ml de Tampón de Lavado ml de agua desionizada o destilada. Una vez diluido, el tampón es estable 5 días si se conserva a temperatura ambiente. Si se observan cristales, disolverlos a baño maría a 37 C antes de diluir. Nota: Preparar sólo el volumen de tampón de lavado necesario para la ejecución del ensayo. M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 5/14

6 6.6. Solución TMB-Substrato 1 vial contiene 15 ml de 3,3`,5,5`-Tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno listo para usar. Conservar en la oscuridad. La solución es incolora o celeste clara. Si se volviera azul significa que está contaminada y no puede utilizarse. Una vez abierto, el producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C Solución Stop 1 vial contiene 15 ml de ácido sulfúrico, 0.2 mol/l, listo para usar. Una vez abierto, el producto es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conserva a 2-8 C. 7. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Usar muestras de suero o plasma (citrato) humano. Si el test se realiza dentro de los 5 días de la extracción, las muestras pueden conservarse a 2-8 C, de lo contrario deben ser alicuotadas y congeladas a C. Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento. No se recomienda la inactivación de las muestras por calor Dilución de las muestras Antes de la ejecución del test, diluir las muestras con el diluyente de las muestras IgA. Por ejemplo, pipetear en las probetas 10 µl de la muestra + 1 ml de diluyente y mezclar bien (Vortex). Los controles están listos para usar y no requieren dilución. 8. PROCEDIMIENTO 8.1. Preparación del test Leer bien las instrucciones antes de comenzar el ensayo. Para obtener resultados válidos es indispensable seguir las instrucciones con exactitud. El siguente procedimento deve emplearse para realizar el ensayo con método manual. Establecer ante todo el esquema de distribución e identificación de las muestras y controles en la hoja de trabajo suministrada con el kit. Insertar los pocillos necesarios en el soporte de microplacas. Utilizar por lo menos: 1 pocillo (ej. A1) para el blanco (blank) 1 pocillo (ej. B1) para el control negativo 2 pocillos (ej. C1+D1) para el control Cut-off 1 pocillo (ej. E1) para el control positivo. Se aconseja realizar el ensayo en duplicado. Efectuar el test en el orden establecido en las instrucciones, sin pausas. Utilizar puntales nuevos y limpios para cada muestra y control. Regular la incubadora a 37 ± 1 C 1. Dispensar 100 µl de cada control y de las muestras diluidas en los relativos pocillos. Usar el pocillo A1 para el Blanco. 2. Cubrir los pocillos con la película adhesiva. 3. Incubar 1 hora ± 5 min a 37 ± 1 C. M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 6/14

7 4. Al finalizar la incubación, quitar la película y aspirar el líquido de los pocillos. Posteriormente lavar los pocillos tres veces con 300 µl de tampón de lavado. Evitar que la solución se derrame de los pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser al menos de 5 seg. Tras el lavado golpetear delicadamente los pocillos con la abertura hacia abajo sobre un papel absorbente para quitar completamente el líquido. Atención: El lavado es una fase crítica. Un lavado poco cuidadoso determina una mala precisión del test y un aumento distorsionado de las densidades ópticas. 5. Dispensar 100µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos, excluyendo el del Blanco (blank). Cubrir los pocillos con la película adhesiva. 6. Incubar 30 min a temperatura ambiente ( C). No exponer a fuentes de luz directa. 7. Repetir el lavado como se indica en el punto Dispensar 100µl de Solución TMB-sustrato en todos los pocillos. 9. Incubar exactamente durante 15 min a temperatura ambiente ( C) al resguardo de la luz. 10. Dispensar 100µl de Solución Stop en todos los pocillos, en el mismo orden y tiempo de dispensación utilizada para la solución TMB-sustatro. Durante la incubación el color cambia de azul a amarillo. Atención: Muestras con un resultado altamente positivo pueden causar precipitados oscuros del cromógeno! Estos precipitados influyen en la lectura de la densidad óptica. Se aconseja diluir las muestras con solución fisiológica NaCl, ejemplo 1+1. Luego diluir normalmente con el diluyente de las muestras IgA. El resultado en UR debe multiplicarse por dos. 11. Medir la absorbancia de todos los pocillos a 450/620 nm dentro de los 30 min de la agregación de la solución stop. Si se utilizara en el procedimiento operativo un instrumento automático para microplacas RADIM/SEAC, ver el manual pertinente Medición Regular el fotómetro para las microplacas (ELISA-Reader) a cero usando el Blanco (blank) en A1. Si, por motivos técnicos, no sea posible regular el fotómetro, restar la absorbancia del Blanco de todos los valores de las otras absorbancias. Medir la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm y anotar todos los valores obtenidos en la hoja de trabajo. Se recomienda efectuar una medición de las densidades ópticas a doble longitud de onda utilizando los 620 nm como longitud de referencia. Donde sea aplicable, calcular la media de las absorbancias de todos los duplicados. En caso que se utilice un instrumento automático para microplaca RADIM y/o SEAC, la lectura espectrofotométrica se efectúa automáticamente a 3 longitudes de onda: 450, 405, 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura. M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 7/14

8 9. RESULTADOS 9.1 Validación del test El test es válido si responde a los siguientes criterios: Blanco en A1: Valor de absorbancia < Control Negativo en B1: Valor de absorbancia < y < Cut-off Control Cut-off en C1 y D1: Valor de absorbancia Control Positivo en E1: Valor de absorbancia > Cut-off Si los antedichos criterios no se cumplen, la prueba no es válida y deberá repetirse Cálculo de los resultados El Cut-off es la media de los valores de absorbancia de los controles Cut-off. Ejemplo: Valor de absorbancia del control Cut-off valor de absorbancia del control Cut-off 0.42 = 0.86/2= 0.43 Cut-Off = Interpretación de los resultados Las muestras con valor de absorbancia superior al Cut-Off + 10% deben considerarse Positivas. Las muestras con valor de absorbancia comprendida en el rango del Cut-off ± 10% no son indentificables como positivas o negativas, por lo tanto el resultado debe considerarse Dudoso. En este caso se recomienda repetir el test después de 2 o 4 semanas con una muestra fresca. Si el resultado todavía es incierto, la muestra debe considerarse Negativa. Las muestras con valor de absorbancia superior al Cut-Off - 10% deben considerarse Negativas Resultados en unidades Radim [UR] Absorbancia media de la muestra x 10 = [Unidad RADIM = UR] Cut-Off Ejemplo: x 10 = 47 UR ( Unidad RADIM) 0.43 Cut-Off 10 UR Dudoso: 9-11 UR Negativo: <9 UR Positivo: >11 UR M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 8/14

9 10. CARACTERÍSTICAS DEL TEST Precisión Reproducibilidad: Inter-ensayo n Media CV (%) Suero pos Repetibilidad: Intra-ensayo n Media CV (%) Suero pos Especificidad diagnóstica La especificidad diagnóstica es la probabilidad del test de dar un resultado negativo en ausencia de anticuerpos específicos. La especificidad diagnóstica es >90% Sensibilidad diagnóstica La sensibilidad diagnóstica es la probabilidad del test de dar un resultado positivo en presencia de anticuerpos específicos. La sensibilidad diagnóstica es > 90% Posibles interferencias Muestras hemolíticas, lipémicas e ictéricas con hasta 10 mg/ml de hemoglobina, 5 mg/ml de triglicéridos y 0,2 mg/ml de bilirrubina no han presentado fenómenos de inteferencia en el presente test. 11. LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO Una contaminación por microorganismos o ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento pueden alterar los valores de las absorbancias. El diagnóstico de una enfermedad infecciosa no debe hacerse solamente en base a los resultados de un único test. Es importante considerar también la anamnesis y los síntomas del paciente. Los resultados del test realizado en pacientes inmunosuprimidos y en recién nacidos tienen un valor limitado. 12. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS Observando la Directiva Europea 98/79/CE el uso de dispositivos médicos-diagnósticos in vitro está destinado por parte del fabricante a asegurar la congruencia, las prestaciones y la seguridad del producto. En consecuencia el procedimiento analítico, las informaciones, las precauciones y advertencias contenidas en las instrucciones para el uso deben ser seguidas atentamente. El uso de kits con analizadores y equipos similares debe ser convalidado previamente. Cambios en el proyecto, en la composición o estructura y en el procedimiento analítico, así como el uso del kit asociado con otros productos no aprobados por el fabricante no es autorizado; el mismo usuario es responsable de estos eventuales cambios. El fabricante no es responsable de los resultados falsos e incidentes que pueden causarse por estos motivos. El fabricante no es responsable de ningún resultado obtenido a través del examen visual de las muestras de los pacientes. El dispositivo está destinado solamente al uso diagnóstico in vitro. Todos los componentes de origen humano empleados en la producción de los reactivos contenidos en el kit son resultados no reactivos a Anti-HIV-Ab, Anti-HCV-Ab y HBsAg. No obstante esto todos los materiales deben ser considerados potencialmente contagiosos e infecciosos. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos puede reaccionar con el plomo y el cobre de las cañerías formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 9/14

10 formación y acumulación de tales compuestos dejar correr abundante agua sobre los reactivos eliminados. No intercambiar reactivos y microplacas de lotes diferentes. No utilizar reactivos de otros fabricantes junto con los reactivos de este kit. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Utilizar solamente equipo (puntales, dispensadores) y material de laboratorio limpios. No intercambiar las tapas de los viales para evitar contaminaciones cruzadas. Cerrar bien los viales inmediatamente después del uso para evitar la evaporación y la contaminación microbiana de los reactivos. Una vez abiertos y después del relativo almacenamiento verificar, antes del uso, los reactivos para excluir una eventual contaminación microbiana. Para evitar contaminaciones cruzadas y resultados erróneamente altos pipetear muestras y reactivos con mucha precisión en el fondo de los pocillos, evitando que se salpiquen. El kit está destinado para ser exclusivamente utilizado por personal cualificado que conozca perfectamente las técnicas de trabajo ATENCIÓN: Bronidox L, en la concentración utilizada, difícilmente presenta riesgos de toxicidad si entra en contacto con la piel y las mucosas. ATENCIÓN: El ácido sulfúrico irrita los ojos y la piel! En caso de contacto enjuagar cuidadosamente con agua y consultar al médico. Mantener lejos del alcance de los niños Eliminación En general todos los residuos de las sustancias químicas y preparaciones se consideran residuos peligrosos. La eliminación de este tipo de material es regulado por leyes nacionales y reglamentaciones regionales. Para más informaciones contactar a las autoridades locales o a las compañías autorizadas para la eliminación de los residuos. M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 10/14

11 ESQUEMA DEL ENSAYO RSV IgA E.W. Preparación Preparar muestras, controles y reactivos como se indica. Establecer el esquema de distribución e identificación de las muestras y controles en la hoja suministrada con el kit. Insertar la cantidad de pocillos necesarios para la ejecución del test en el soporte para microplacas. Procedimiento Blanco (A1) CONTROL ONTROL + C/O Muestra (diluida 1+100) CONTROL - 100µl CONTROL µl - - C/O µl - Muestra (diluida 1+100) µl Cubrir la microplaca con la película adhesiva Incubar durante 1 hora ± 5 min. a 37 C ± 1 C Lavar 3 veces con 300µl de tampón de lavado CONJ - 100µl 100µl 100µl 100µl Cubrir la microplaca con la película adhesiva Incubar durante 30 min. a temperatura ambiente Lavar 3 veces con 300µl de tampón de lavado TMB SUBS 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Incubar durante 15 min. a temperatura ambiente en la oscuridad STOP 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Medición fotométrica a 450 nm (longitud de onda de referencia: 620 nm) M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 11/14

12 SÍMBOLOS EN 980 EDMA REF Referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in-vitro Marcado CE según la directiva IVD 98/79/CE Conservar a 2-8 C Produzido por Riesgo Biológico Consultar las instrucciones de uso Σ 96 Suficiente para 96 determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 12/14

13 BIBLIOGRAFÍA Wiegand, R.: Respiratory Syncytial Virus (RSV). In: Brandis, H., W. Köhler, H. J. Eggers, G. Pulverer (ed.): Med. Mikrobiologie 1994.Gustav Fischer Verlag Stuttgart, Jena, New York (1994) Hall, C.B., et Immunity to and frequency of reinfection with Respiratory Syncytial Virus. J. Infect. Dis. 163 (1991) Hohlberg, C.J., et al.: Risk factors for Respiratory Syncytial Virus associated lower respiratory illness in the year of life. Am. J. Epidemiol. 133 (1991) Meurmann, O., et al.: Diagnosis of Respiratory Syncytial Virus infection in children: comparison of viral antigen detection and serology. J. Med. Virol. 14 (1984) Parrot, R.H., et al.: Respiratory Syncytial Virus II. Serologic studies over a 34 month period of children with bronchiolitis, pneumonia, and minor respiratory disease. J. Am. Med. Ass. 176 (1961) Schumacher, R. F.: Die RSV-Infektion des Frühgeborenen: Nosologie und nosokomiale Epidemiologien. Diss., Freiburg (1990) M390.es Rev.2 07/2009- Pag. 13/14

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