ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN PRODUCTOS GERMICIDAS.
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- Luis Páez Olivera
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1 Simposio Metrología al 9 Octbre ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN PRODUCTOS GERMICIDAS. Olvera Ángeles, Jara Héctor *, Gómez Patricia * Facltad Qímica, Universidad Nacional Atónoma México Av. Universidad 3000 Colonia Copilco Universidad CP México DF Teléfono ext 108, correo electrónico: maot@servidor.nam.mx, * Lambda Científica. Resmen: La norma NMX-EC para acreditación laboratorios solicita na serie reqisitos para mostrar la exactitd y la confiabilidad las mediciones, en algnos métodos análisis qe sa la Farmacopea los Estados Unidos Mexicanos, como son los tipo microbiológico no se obtiene estrictamente n resltado cantitativo y se tiene dificltad para cmplir con dichos reqisitos, entre ellos se encentran los relacionados con el asegramiento la calidad las mediciones. El trabajo propone n proceso para cmplir con n programa asegramiento la calidad y hace recomendaciones en 7 pntos críticos en el proceso medición qe permita mostrar la confiabilidad. Como ejemplo esta propesta se sa el método: terminación la actividad antimicrobiana n germicida la Farmacopea los Estados Unidos Mexicanos. 1. INTRODUCCIÓN Los germicidas son prodctos qímicos qe stryen na amplia gama microorganismos sobre sperficies o tejidos. Cando se adicionan a los preparados farmacéticos para protegerlos la contaminación microorganismos se nominan preservativos. Para terminar la efectividad l sistema preservativo o la actividad germicida se verifica la actividad antimicrobiana l prodcto sando la NMX-BB-040-SFI-1999, norma qe se basa en terminar el porcentaje redcción n número terminado microorganismos, cando se ponen en contacto con n germicida, bajo condiciones preba especifica. Un prodcto etiqetado como germicida, be tener n por ciento redcción la centa viable 99,999% en 30 segndos contacto. La centa viable inicial se be encontrar entre UFC/mL y UFC/mL. Los resltados esta preba tienen n gran impacto en la sald y en la prodcción. Los prodctos críticos en na toma cisión errónea es en inyectables, oftálmicos, prodctos dérmicos y preparados orales. Para alcanzar los objetivos la calidad y por acreditar la preba ante la NMX-EC y gestionar el riesgo obtener resltados medición incorrectos es importante tener n sistema eficaz gestión las mediciones qe asegre qe el eqipo y los procesos medición sean acados para el so previsto. La obtención resltados segros en métodos microbiológicos pen principalmente la correcta aplicación las benas prácticas laboratorio, sin embargo es necesario encontrar na forma para por cmplir con los reqisitos qe la 1705 exige. Este trabajo es na propesta n sistema gestión las mediciones qe cmpla con los reqisitos qe solicita la norma acreditación NMX-EC para la preba específica: Medición la actividad microbiana en prodctos germicidas sada para terminar la efectividad n sistema preservativo..-metodología Una vez qe se ha finido el mensrando qe la preba exige, el método medición y las tolerancias se discte la forma controlar 7 factores qe este trabajo consira son necesarios para asegrar exactitd y confiabilidad. En el diagrama 1 se presentan los 7 factores y s relación con la incertidmbre medición. 1 SM010-Car-5
2 Simposio Metrología al 9 Octbre Mestreo.3 Método medición: Elementos la medición Método Se cantifica la centa viable inicial y las céllas sobrevivientes Centa viable inicial: Trazabili dad Instrmen tos y eqipo Incerti dmbre Factores ambienta les Factores hmanos En n medio cltivo líqido se inoclan dos tipos microorganismos diferentes, la norma recomienda Staphylococcs ares ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 11 9 y se hacen las dilciones acadas para obtener placas qe contengan entre 5 colonias y 50 colonias. Inoclar en cajas petri, incbar por 48 horas 35 0 C a 37 0 C y contar el número colonias en cada caja Céllas sobrevivientes: Diagrama 1. Relación factores con la incertidmbre medición..1. Intificaciónón l mensrando. El mensrando correspon al % redcción na centa microorganismos viable inicial entre UFC/mL y UFC/mL en n prodcto qe estvo en contacto con el germicida por 30 segndos. Interpretación: Un prodcto etiqetado como germicida be tener n por ciento redcción l 99,999%... Principio medición: La acción germicida se mi por medio l porcentaje redcción n número terminado microorganismos inicial con el sigiente molo matemático: % redcción Don: S Céllas sobrevivientes centa viable inicial ( S)( 100) ( UFC/mL) (1) La preba se efectúa sobre sspensiones microorganismos los microorganismos mencionados en el pnto.3.1, agregando el prodcto antigermicida y jándolo actar por 30 segndos y se hacen las dilciones acadas para obtener placas qe contengan entre 5 colonias y 50 colonias. Se inoclan en cajas petri, se incban por 48 horas 35 0 C a 37 0 C y se centa el número colonias en cada caja. Se promedian los resltados las placas la centa viable inicial y las céllas sobrevivientes y se calcla el porcentaje redcción.. 3. RESULTADOS En esta sección se discten cada no los factores a controlar y se mestran en la tabla 1 Tabla 1 Factores qe afectan la calidad los resltados Factor Control herramientas Hmanos Precisión intermedia Desviaciones estándar Método validación Prebas hipótesis ambientales Validación Prebas hipótesis, error eqipo Calificacion, confirmación metrológica, verificación instrmentos Calificación, verificación, Prebas hipótesis, error, sviaciones estándar Incertidmbre SM010-Car-5
3 Simposio Metrología al 9 Octbre confirmación metrológica trazabilidad Validacion Stahypolococos ares ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 119 Manejo los elementos Verificación, vigilancia, 3.1 Los factores hmanos. Prebas hipótesis Son controlados a través estimar la sviación estándar entre analistas y cada analista. Cinco analistas hacen 10 lectras. Debido a qe no se tienen diferentes niveles para por hacer n estdio precisión intermedia se san las sviaciones estándar entre analistas y cada analista para dar segimiento al trabajo los analistas, a medida qe la sviación estándar sea más peqeña indica na menor dispersión lo qe significa na mayor confiabilidad en el trabajo experimental. 3. Controles ambientales. La incbación be llevarse a cabo a 37 0 C con na variación permitida ±1 0 C. Esta condición única ambiental be ser monitoreada en cada incbación y la evincia se recomienda cbrirla con cartas control don se grafiqe los valores la temperatra incbación a lo largo l período incbación. Inclir en la gráfica las incertidmbres y los valores límites permitidos, en este trabajo esos valores permitidos son los qe la norma indica, no be variar en ±1 0 C 3.3 l método medición. El método medición en conjnto es validado a través analizar n germicida previamente probado por otro laboratorio experto qe haya obtenido previamente el % redcción y s incertidmbre, y mostrando la evincia objetiva mediante na preba hipótesis medias y otra preba hipótesis sviaciones estándar. La preba medias lo qe indica es si hay diferencia significativa entre los valores obtenidos por el laboratorio experto y el laboratorio qe hace la preba. La preba hipótesis sviaciones estándar lo qe indica es si hay diferencia significativa entre las incertidmbres reportadas por el laboratorio experto y el laboratorio qe hace la preba. Si no existe diferencia significativa es la evincia objetiva qe se verificó qe los reqisitos especificados son para el so previsto. Es cir qe el método es acado para por evalar s acción germicida. 3.4 Eqipos e instrmentos El eqipo es calificado y los instrmentos calibrados y verificados periódicamente. Los instrmentos qe reqieren verificación y calibración: termómetro para incbadora qe evite variaciones mayores ± 1,0ºC, verificación l cronómetro. La forma qe se propone verificar es a través hacer na confirmación metrológica en el momento qe llega al laboratorio spés ser calibrado. La confirmación metrológica be hacerse en el pnto hielo frape colocado en n Dewar, a 37 0 C y en el pnto ebllición l aga. Posteriormente se hace esta preba en dos fechas intermedias al periodo calibración. Y la evincia objetiva qe se está cmpliendo y manteniendo el termómetro a las mismas condiciones qe se recibió es haciendo na preba hipótesis si hay diferencia significativa entre los valores obtenidos en el momento qe se recibió el termómetro al laboratorio spés ser calibrado y en el momento en qe fe verificado. Es my importante qe la acción l germicida sea por 30 segndos, por lo qe es necesario contar con n cronómetro calibrado. El eqipo qe reqiere ser calificado: incbadora, contador colonias campo obscro, con lz acada, lente amplificador y el registrador mecánico, microscopio. Los pntos críticos calificación eqipo son presentados en la tabla. Tabla Calificación en pntos críticos Especificación Eqipo CD CO CI CF Uniformidad Incbadora x x x x temperatra Uniformidad Contador x x x en el conteo por golpe mecánico Amplificación Microscopio x x x Microscopio Uniformidad x x x campo visal Amplificación Lente x x x amplificador Estabilidad Contador x x x 3 SM010-Car-5
4 Simposio Metrología al 9 Octbre lz Cadrícla Uniformidad campo visal colonias Contador colonias Contador colonias x x x x x x x 3.5 Elementos l método medida. Los elementos críticos para la preba son los relacionados con la conservación la cepa y los medios cltivo. Pero antes hacer la validación es necesario tener la segridad qe los medios cltivo qe se san tienen na calidad acada. Para ello se be controlar: 1.- Preparación l medio cltivo. Comprobación las propiedas ntritivas Para la preparación los medios cltivo con medios shidratados es necesario exigir el certificado analítico cada medio y sar aga la calidad Farmacopea Para comprobar las propiedas ntritivas se preparan sspensiones microorganismos qe contengan aproximadamente 10 UFC/mL se inocla con 1 ml sspensión (Staphylococcs ares ATCC 6538) se incba a (3, ±,5) 0 C por tres días y se compreba posteriormente el crecimiento con prebas bioqímicas. 3.6 Mestreo Para consirar el tamaño la mestra n pe sarse la relación: ( z + z ) σ n α β d z valor z correspondiente α al riesgoα fijado z β valor z correspondiente al riesgoβ fijado σ correspon a la varianza la preba d valor mínimo la diferencia o efecto qe se reqiere tectar Trazabilidad. Lograr la comparación a patrones reconocimiento internacional es cir la trazabilidad en esta preba es smamente difícil porqe be lograrse tanto con los instrmentos como con los materiales referencia. El caso los instrmentos se logra mediante la calibración a patrones primarios nacionales pero los materiales referencia en esta preba son cepas microorganismos las qe pen contaminarse en el transcrso la preba y perr la trazabilidad, por lo qe este trabajo recomienda qe la trazabilidad sea cmplida a través la calibración cada instrmento y con na cepa control, la norma indica sar Staphylococcs ares ATCC 6538 y Escherichia coli ATCC 119. La trazabilidad se logra a través la conservación la cepa a partir cltivos trabajos y resiembras congeladas. La cepa referencia be ser confirmada a través prebas bioqímicas. Se be asegrar n sistema para obtener el número microorganismos inicial para por evalar la efectividad la acción germicida. La norma indica qe la centa inicial be ser UFC/mL a UFC/mL. La propesta l sistema es la sigiente: Preparar 10 sspensiones l microorganismo, en esta preba Staphylococcs ares ATCC 6538 en aga peptonada 0,1% y dilir hasta obtener na sspensión qe leía a na longitd onda 580 nm, dé na lectra entre 3% y 5% transmitancia. Sembrar estas dilciones y hacer na centa las céllas viables presentes. El número centa corresponrá al promedio y la incertidmbre ( ) a la sviación estándar la media. ATC Incertidmbre La incertidmbre es n parámetro cantitativo la calidad qe calqier proceso medición be ir acompañado, en este proceso en el qe se mi pero no bajo las nidas l Sistema Internacional, se cantifican nidas formadoras colonias, pero bido a la natraleza la forma como se contabilizan este conteo no es n número exacto como se podría esperar, se observan inconsistencias en las repeticiones l conteo por lo qe este número lleva na incertidmbre qe este trabajo consira qe se encentra propagada la sigiente forma: 3.7 Trazabilidad e incertidmbre. 4 SM010-Car-5
5 Simposio Metrología al 9 Octbre % % % S + S % 100 S % ( S)( 100) incertidmbre las céllas sobrevivientes S incertidmbre centa viable inicial La incertidmbre l conteo las céllas sobrevivientes y la centa viable inicial es estimada a través dos componentes: los estdios repetibilidad y reprodcibilidad hechos previamente para controlar los factores hmanos y la incertidmbre tipo A. S Ryr Ryr + + tipoa tipoa + ATC correcta aplicación las benas prácticas laboratorio, sin embargo es posible encontrar na forma para por cmplir con los reqisitos qe la 1705 exige y bido a qe el mensrando correspon a n valor nmérico es posible estimar na incertidmbre qe se interpreta como na forma cantitativa expresar la calidad la medición la actividad antimicrobiana en prodctos germicidas. REFERENCIAS [1] NMX-CC-1001-IMNC-004. Sistemas gestión las mediciones Reqisitos para los procesos medición y los eqipos medición. [] NMX-BB-040-SCFI-1999 Métodos Generales Análisis- Determinación la actividad antimicrobiana en prodctos germicidas. [3] Farmacopea los Estados nidos Mexicanos. Vol [4] Asociación Española Farmacéticos la indstria. Validación Métodos Analíticos España 5. CONCLUSIONES La obtención resltados segros en métodos microbiológicos pen principalmente la ESPECIFICACIÓN EQUIPO CD CO CI CF Uniformidad Incbadora x x x x temperatra Uniformidad en el Contador x x x conteo por golpe mecánico Amplificación Microscopio x x x Uniformidad l campo visal Amplificación Lente x x x amplificador Estabilidad lz Contador x x x x colonias Cadricla Uniformidad campo visal 5 SM010-Car-5
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