β I β S ( ) α I α S ( )

Transcripción

1 Conecciones a travez del espacio Hasta ahora, todos los experimentos que analizamos funcionan por el acople escalar. COSY, HETCOR, HOMOy HETERODJ, etc., etc., nos dan informacion sobre la estructura covalente del sistema, pero poco acerca de su conformacion o su estereoquimica (esto no es del todo cierto pero denme un poco de vida...). Al principio del curso vimos que si saturamos un proton en la molecula, la relajacion ocurre por procesos de cero cuantos o cuantos dobles, transfiriendo energia a protones que esten acoplados dipolarmente a el (protones en las cercanias Esto era el efecto nuclear Overhauser (NOE): β I β S ( ) W 1I W 1S ( ) α I β S W 0IS W IS β I α S ( ) W 1S W 1I α I α S ( ) Habiamos visto que la relajacion, ya sea por W IS o W 0IS, va a ocurrir de acuerdo al tamaño de la molecula, o mas precisamente a su velocidad de reorientacion (i.e., su tiempo de correlacion, τ c ).

2 Caso en un sistema de dos espines Habiamos establecido una relacion entre las velocidades de las distintas probabilidades y la magnitud del NOE. limitando todo a 1 H- 1 H (γ I / γ S = 1), tendremos: η I = W IS - W 0IS W 1S + W IS + W 0IS = f I {S} f I {S} es el factor de NOE del nucleo I cuando saturamos al nucleo S. Esta ecuacion aparece de otra forma en muchos libros. Definimos la constante de ralajacion cruzada, σ IS, como el numerador, y el denominador como la relajacion dipolar longitudinal, ρ IS. σ IS = W IS - W 0IS ρ IS = W 1S + W IS + W 0IS η I = σ IS / ρ IS = f I {S} Ya vimos que el signo del NOE depende de la velocidad de reorientacion y el tamaño de la molecula. Habia dos casos limite, uno en que ω * τ c << 1 (el extreme narrowing limit ), y otro en que ω * τ c >> 1 (el limite por difusion).

3 Funciones de correlacion y densidad espectral Ya mencionamos que las rutas que el sistema tiene para liberar energia a la red dependen de las frecuencias de los distintos procesos que afectan al sistema. En solucion, esto significa rotacion de la molecula (τ c ). Los espines quedan alineados con el campo B o externo mientras la molecula rota, y esto genera campos magneticos (dipolos fluctuantes) a la frecuencia de la rotacion que permiten que el sistema libere energia magnetica: Tenemos que poder analizar como la molecula rota en solucion. Definimos la funcion de correlacion del sistema como el promedio de la orientacion de la molecula a cierto tiempo (t) y su orientacion un poquito mas tarde (t + τ) : g(τ) = R(t) * R(t + τ) Basicamente (cor)relaciona la orientacion de la molecula a dos tiempos. g(0) = 1, y g(τ) decae exponencialmente en funcion de τ / τ c, donde τ c es el tiempo de correlacion de la molecula.

4 Densidad espectral Como ya sabemos, una vez que tenemos una funcion en el tiempo podemos ver las frecuencias de los procesos en cuestion haciendo una TF. La TF de g(τ) se llama la funcion de densidad espectral, J(ω). Como g(τ) es una exponencial que decae en funcion de τ, J(ω) es una Lorentziana: J(ω) = τ c 1 + ω τ c Dependiendo de τ c (la modorra de la molecula), su movimiento esta compuesto por frecuencias mas lentas, comparables, o mas rapidas que ω o, que es la frecuencia de Larmor del sistema: J(ω) ω o ω o * τ c >> 1 ω o * τ c 1 ω o * τ c << 1 log(ω)

5 Todo junto Como la probablilidad de que una transicion ocurra depende de las distintas frecuencias que el sistema tenga (o densidad espectral), los terminos W son proporcionales a J(ω). Igualmente, como se necesitan dos dipolos magneticos para tener acople dipolar, el NOE depende de la intensidad de los dipolos. Como la intensidad de un dipolo es proporcional a r IS -3, las probabilidades W van a depender de r IS -6 : W 0IS γ I γ S r -6 IS τ c / [ 1 + (ω I - ω S ) τ c ] W IS γ I γ S r -6 IS τ c / [ 1 + (ω I + ω S ) τ c ] W 1S γ I γ S r -6 IS τ c / [ 1 + ω S τ c ] W 1I γ I γ S r -6 IS τ c / [ 1 + ω I τ c ] La relacion depende de la inversa de la sexta potencia de r IS, osea que el NOE va a decaer muy rapido a medida que los dos nucleos se separen. Para protones, esto quiere decir que podemos ver cosas que esten a lo sumo a 5 o 6 Å una de otra en la molecula (bajo condiciones ideales ).

6 NOE estatico (steady-state) En moleculas rigidas chicas, las siguientes relaciones son validas: (ω I - ω S ) * τ c << 1 ω S * τ c << 1 ω I * τ c << 1 (ω I + ω S ) * τ c << 1 Basicamente se mueven rapido. Los terminos en las equaciones de probabilidad (los W s) se simplifican, y nos queda una relacion simple para el simple el NOE: η I = 0.5. Fenomeno, teniamos una dependencia con r IS -6 pero desaparecio. El problema es que tenemos solo dos espines en el ejemplo, y esto quiere decir que no hay geometria. Esto es tipico para 1 H- 13 C. En cambio, cuando miramos los NOE de 1 H en una molecula siempre tenemos mas de un proton. Osea, al saturar un 1 H vamos a tener acoples dipolares simultaneos con todos los 1 H que esten en los alrededores. b a c r ba r ac

7 NOE estatico (continuado) Lo que sucede es que tenemos competencia entre los mecanismos de relajacion para el 1 H que saturemos (dos o mas 1 H s en los alrededores). Las velocidades relativas de relajacion con respecto a distintos 1 H s son lo mportante en este caso (las respectivas W s). Las ecuaciones se complican mas, pero si aun estamos en el extreme narrowing limit, se simplifican un monton. Al final, podemos establecer una relacion simple entre el NOE y las distancias interatomicas ( 1 H s en este caso...): f I {S} = η max * r IS -6 - Σ X f X {S} * r IX -6 r IS -6 + Σ X r IX -6 Para estimar distancias entre protones en una molecula podemos saturar uno y analizar los NOE relativos a los otros protones. Esto se conoce como NOE estatico. Tomamos dos espectros. Uno con irradiacion fuera de resonancia, y el otro con irradiacion en la resonancia del 1 H. Los restamos, y la diferencia nos da los NOE a partir de los cuales podemos estimar distancias interatomicas...

8 Espectroscopia NOE de diferencia Si nuestra molecula tiene tres protones, dos de los cuales estan a una distancia fija (un CH ), tenemos: Ha Hb Hc Hb Ha C Hc _ = η ab η ac Como tenemos dos protones de referencia (Ha y Hb) para los cuales sabemos la distancia, podemos definir un NOE de referencia y calcular la distancia entre otros protones en la molecula (Ha y Hc en este ejemplo): η ab r ab -6 η ac r ac -6 r ac = r ab * ( η ab / η ac ) -1/6 El tamaño de los NOE se mide por integracion. Como el efecto no es simetrico, hacemos primero I S y despues el S I y tomamos el promedio de los dos NOE s.

9 NOE transitorio Uno de los problemas del NOE estatico es que le estamos dando energia al sistema continuamente (saturacion). Esto funciona bien para moleculas chicas, porque los procesos W (cuantos dobles) dominan (la molecula se mueve rapido). A medida que el tamaño y τ c aumentan, otros procesos se vuelven mas importantes, como ser relajacion espin-espin (un cuanto) y transiciones prohibidas (cero cuantos). Ademas, hay mas protones en la vuelta y empezamos a ver un efecto llamado difusion de espines: I S Basicamente, la energia transferida del espin I al S se difunde a otros espines de la molecula. Empezamos a ver NOE s a protones que estan muy lejos (>> 5 Å) del proton que estamos saturando, y los resultados son ambiguos. Por ende, tenemos que controlar la cantidad de tiempo por el cual saturamos a los espines del sistema. Cuanto mas irradiemos, mas difusion de espines

10 NOE transitorio (continuado) Ademas tenemos un monton de dificultades tecnicas cuando hacemos saturacion selectiva. Como lo que queremos es ver como el sistema vuelve al equilibrio por medio de ralajacion cruzada, podemos invertir selectivamente una transicion y observar como crece el NOE en funcion del tiempo: β I β S ( ) W 1I W 1S ( ) α I β S W 0IS W IS β I α S ( ) W 1S Esta secuencia nos sirve: W 1I α I α S ( ) 180 s 90 t m inversion selectiva Como siempre, el ultimo pulso π / es de lectura, y su funcion es convertir la magnetizacion que este en el eje z luego de t m en magnetizacion en el plano <xy> (detectable). Las ecuaciones son las mismas, pero el NOE va a depender tambien del tiempo de mezcla t m.

11 Noe transitorio (mas ) Si lo hacemos a distintos valores de t m, nos dan curvas de crecimiento de NOE (NOE build-up curves), que en el caso de dos espines aislados y condiciones ideales nos da un crecimiento exponencial hasta llegar a η max. < η max η max Si tomamos en cuanta la relajacion T 1 y T, el NOE crece y despues decae a cero (toda la magnetizacion retorna al eje z ): t m t m

12 Ejemplo de NOESY-1D Estructura del acetato de trimetilpurpurogalina: O MeO OMe O O O Me b) Me MeO O O OMe (c H MeO Esta... a) MeO H...o esta? c) b) a) Es sin duda la de la derecha. En Synlett publican cualquier bagayo (pero frances...).

13 NOE transitorio y NOESY Si tenemos mas espines y difusion de espines, la curva (para tres espines, I, S, y X) tendria esta apariencia: η max Difusion a X Si queremos medir distancias con cierta precision, hay que que encontrar un compromiso entre el tiempo de mezcla t m que usemos y la difusion de espines que podamos tener. Hacer todo un proton por vez lleva una vida, y obviamente tenemos un experimento D en el que vemos todos los NOE de todos los protones a la vez. La secuencia se llama NOESY (NOE SpectroscopY): t m t 1 t m inversion

14 NOESY (continuado) Los primeros dos pulsos (con el tiempo t 1 variable) son una inversion para todos los protones en que marcamos todo con corrimientos quimicos y acoples (no hay reenfoque). Lo que termine en el eje -z evoluciona durante el periodo de mezcla t m, y los espines acoplados dipolarmente sufren relajacion cruzada (NOE) de acuerdo a las equaciones que vimos antes. El espectro despues del la TF D tiene corrimientos quimicos y acoples en f 1 y en f, y cross-peaks entre espines que esten dipolarmente acoplados: δ (f 1 ) Hb Ha C Hc Hb Ha Hc δ (f ) El tamaño de los cross-peaks depende de la distancia entre nucleos. Los medimos usando los volumenes y en relacion a un cross-peak para el cual conozcamos la distancia (un CH ).

15 NOESY (mas ) Otra cosa que hay que considerar es el signo de los crosspeaks. Va a depender del tiempo de correlacion τ c de la misma forma que los NOE en un 1D. Por lo tanto vamos a tener cross-peaks positivos para ω * τ c << 1 y negativos para ω * τ c >> 1. Como vimos antes, hay un rango de valores de ω * τ c para el cual el NOE puede ser cero. Si expresamos el NOE en funcion de ω * τ c obtenemos una sigmoide, y si resolvemos para η I = 0: η I = 5 + ω τ c - 4ω 4 τ 4 c η I = 0 para ω * τ c = ω τ c + 4ω 4 τ 4 c Dependiendo del tamaño/rigidez de la molecula (τ c ), hay que usar experimentos de NOE estatico o transitorio para obtener resultados mas precisos: Compuestos organicos chicos: NOE estatico. Proteinas, polisacaridos, etc.: NOE transitorio, NOESY Las opciones cuando η I = 0 incluyen cambiar τ c (visocidad), ω (el iman es dificl de cambiar), o hacer que el sistema se comporte como si estuviesemos a campos bajos, de modo que siempre tengamos ω * τ c << 1...

16 Trabajo a campos bajos - Spin-locking Hasta ahora, todos los experimentos han sido al campo magnetico del iman. Cuanto mas grande, mejor, ya que aumenta la sesibilidad y la resolucion. Hay algunos casos en que un campo mas chico (mucho mas chico) seria muy util. Por ejemplo, vimos que en ciertos casos tener un cierto campo B o y una molecula con un τ c en particular no nos permite usar NOESY (es cero). Idealmente querriamos tener la sensibilidad y resolucion que nos da B o, pero estudiar el comportamiento del sistema de espines (transferencia de polarizacion, acoples, correlacion y relajacion cruzada, etc.) a otro campo. En un experimento D esto significa que los periodos de preparacion, evolucion, y adquisicion se llevan a cabo a B o, pero el mezclado lo hacemos a un campo mas bajo. La tecnica que usamos para lograr esto se llama spinlocking. La idea es mover a los espines (a la magnetizacion) fuera de los efectos de B o enganchandolos a un campo magnetico distinto. Osea, los hacemos precesionar alrededor de un campo B que no esta alineado con el eje z.

17 Teoria del Spin-locking Para tener spin-lock de la magnetizacion lo primero es sacarla del eje z (lejos de B o ). Esto quiere decir que la ponemos en los ejes x o y (i. e., un pulso π / ). Ahora viene la parte del enganche. Despues de que M este en el plano <xy>, hay que mantenerla alli. Como dijimos, esto involucra hacerla precesionar alrededor de une nuevo campo magnetico alineado con el eje x o y. Esto lo hacemos con un campo de banda continua (BC) o con un campo generado por pulsos compuestos ( tren de pulsos) que tiene el mismo efecto que la irradiacion de BC: z z y x 90 B SL (x) y B SL x Cuando logramos esta condicion (llamada la condicion de Hartmann-Hahn), las frecuencias de todas las transiciones del sistema son proporcionales a B SL : antes del SL: ω o = γ B o despues del SL: ω SL = γ B SL

18 Teoria del Spin-locking (continuado) Tenemos que tener en cuenta que B SL es un campo magnetico variable aplicado en (o cerca de) la resonancia de los espines de nuestra muestra. Como es estatico en el sistema rotatorio, solo nos preocupa su intensidad. Por eso es que estos experimentos se conocen como experimentos de sistema rotatorio. Hay distintas formas de generar el B SL. Una es basicamente usar un campo de BC que prendemos y dejamos prendido por el tiempo que queramos los espines enganchados. El problema de esto es el ancho espectral que logramos con excitacion de BC. Solo los espines con ω o similar a ω SL van a estar bien enganchados. Para cubrir cosas a los costados hay que aumentar mucho la potencia. ω SL La desventaja de esto es el calor. Necesitamos un B SL muy fuerte, la bobina transmisora se va a calentar, y esto va a terminar calentando a la muestra (a lo menos).

19 Spin-locking con M LEVM Podemos usar pulsos de RF cortos y obtener los mismos resultados. Los llamamos pulsos compuestos, ya que son una coleccion de pulsos cortos (µs) esparcidos por todo el periodo de mezcla (o todo el periodo del spin-lock) y tienen el mismo efecto que irradiacion de BC. El mas comun es llamado MLEV, o ciclo de desacople de Malcom LEVitt. Una variacion es llamada DIPSI (Decoupling In the Presence of Scalar Interactions). Estas secuencias son esquemas de desacople (despues de todo, un B SL de BC es como un desacoplador), y tenemos que entender como funcionan los pulsos compuestos (PC s) para entender como logran el spin-lock. Un PC es basicmente un monton de pulsos juntos que usamos repetidas veces. PC s tipicos son R = (π/) x (π) y (π/) x o R = (π/) x (3π/) y (π/) x. Veremos lo que hacen con espines que esten ligeramente no alineados en el plano <xy>: z z x R x y y

20 Spin-locking con MLEV (continuado) La cosa no termina aca. Tenemos que usar mas PC s para lograr el spin-lock. Si aplicamos el mismo pulso R: z z x R x y y Lo que hacen, basicamente, es mantener a la magnetication en el plano <xy> tumbandola de un lado a otro a de los ejes. Si ponemos muchos en sucesion podemos mantener el spin-lock por el tiempo que queramos. Normalmente las fases de los distintos PC s del spin-lock se alternan (R): MLEV-16: R R R R R R R R R R R R R R R R No importa que la magnetizacion apunte en +x o -x. Mientras la mantengamos en el plano <xy>, se va a mezclar de acuerdo al campo B SL generado por los pulsos de la secuencia usada en el spin-lock.

21 TOCSY El largo y el tipo del spin-lock va a depender de lo que queramos hacer. La primera tecnica que vamos a analizar se llama HOHAHA (HOmonuclear HArtmann-HAhn experiment) o TOCSY (Total Correlation SpectroscopY). La utilidad de esta secuencia es identificar todos los epines en un sistema. Generalmente estudiamos acoples (en un 1D o en un COSY) bajo los efectos de B o. Por lo tanto, Δδ (Hz) >> J (Hz). Esto significa que los efectos en la energia del sistema debidos a los acoples (J) van a ser mucho menores que los efectos debidos a corrimientos quimicos (δ), y la transferencia de energia entre distintos estados (coherencia) va a estar dominada por δ. El sistema es de primer orden: H = H δ + H J + con H δ >> H J + H es el Hamiltoniano, un operador que nos da la energia del sistema (de los espines en este caso). Las cosas cambian en un sistema bajo spin-lock. Como mas o menos eliminamos a Δδ (B 1 << B o ) pero no los acoples, tendremos que H J >> H δ.

22 TOCSY (continuado) Ahora el acople domina la energia del sistema, y la transferencia de coherencia ocurre debido al acople escalar. Para hacerla corta, vamos a tener un mezclado completo de los estados del sistema, y la coherencia de un espin en un sistema acoplado se transfiere a todos los otros espines. En otra palabras, un espin se correlaciona con todos los demas en el sistema: A B C D X La mayor transferencia entre dos espines con un acople de J Hz es optima cuando el periodo del spin-lock, t m, es 1 / J. t m s mas largos nos dejan transferir coherencia en sistemas debilmente acoplados: Vamos mas profundo en el sistema de espines. El TOCSY-1D necesita un pulso π / selectivo para afectar solo al espin que queremos enganchar : t m 90 s Durante t m, coherencia de el espin enganchado pasa a todos los epines del sistema

23 TOCSY (mas ) Si hacemos el spin-lock en nucleos de distintos sistemas de espines en una molecular como esta nos daria: * * A B C * Espin bajo spin-lock: B A C

24 Ejemplo de TOCSY-1D Me H CH OH O OMe OH O OH CH OH OH O H Soforolipido en estudio en el FDA de PA. Haciendo el spin-lock en los anomericos logramos identificar las dos glucosas... OH OH H Anomerico naranja Anomerico verde Al lipido lo podemos identificar haciendo spin-locks en el metileno α al metilester, en el metilo, y en los olefinicos...

25 TOCSY (y mas ) Esto funciona bien para una molecula con pocos espines. El otro problema es que usamos pulsos selectvos, que nunca son tan selectivos como queremos. Usamos excitacion no selectiva (un pulso π / duro) en una tecnica D. La secuencia tiene esta apariencia: t 1 t m Los dos pulsos antes y despues del mezclado son llamados pulsos de recorte (trimming pulses), y son necesarion para que el spin-lock funcione cuando usamos PC s con pulsos duros como el MLEV o el DISPI Como en el NOESY (y como en todos los experimentos D) todo esta modulado por acoples y corrimientos quimicos en el periodo variable t 1, osea que los tenemos en f 1. Durante t m tenemos mezclado de todos los espines que pertenezcan al mismo sistema en la molecula, osea que surgen cross-peaks de un espin a todos los demas. En t (f ) tambien detectamos δ y J, osea que el D es simetrico

26 TOCSY (...y mas) SI graficamos el D vemos que todos los espines de un sistema en particular estan todos en una linea. Para el ejemplo anterior: δ Hacer un TOCSY es rutina en proteinas y polisacaridos, porque los espines de los monomeros son independientes.

27 ROESY El otro experimento que usa un spin-lock es el ROESY (ROtating frame SperctroscopY), y es el equivalente en el sistema rotatorio del NOESY. Como vimos antes, el signo del NOE varia en funcion de ω * τ c, y es cero para ω * τ c = 1.1. Si pudiesemos estudiar los acoples dipolares a campos mucho mas bajos que B o no tenemos este problema porque ω va a ser chiquita, y siempre estamos en el extreme narrowing limit donde todos los NOE son positivos: B o a 800 MHz B SL - a 5 KHz ω SL << ω o ω * τ c << 1 El ROESY no usa MLEV o DIPSI para el spin-lock porque la potencia y el diseño de estos PC s es para sistemas acoplados escalarmente (conecciones a travez de enlaces). Originalmente se usaba un spin-lock de BC, y los ROESY nunca daban bien y eran irreproducibles de un equipo a otro. Ahoa se usa un spin-lock con pulsos duros que tiene el mismo efecto que un PC, pero que minimiza transferencia de coherencia por acoples escalares.

28 ROESY (continuado) Como para todas las secuencias, hay un 1D y un D. En el 1D usamos un pulso selectivo para afectar solo al espin para el que queremos medir efectos NOE: 90 s t m Usando un pulso π / no selectivo y agregando el tiempo de evolucion t 1 nos da la segunda dmiension: 90 t 1 t m El analisis de un ROESY es muy similar al de un NOESY D, con la excepcion que todos los cross-peaks tienen el mismo signo (opuesto al signo de los picos en la diagonal). La integracion de los volumenes de los cross-peaks no es muy exacta en el caso del ROESY