Espectroscopia RMN 2D

Transcripción

1 Espectroscopia RMN 2D Hasta ahora hemos visto muchos pulsos pero una sola dimension (osea, espectros 1D), pero vimos como una secuencia de pulsos multiple nos da distintos espectros en funcion de los periodos t D que usemos entre pulsos. Un eperimento 2D basico seria repetir una secuencia de pulsos 1D con una vriacion sistematica del periodo de tiempo variable t D, luego graficar todo encimado (stacked plot). Un ejemplo seria variar el tiempo antes de tomar la FID (DE): t D1 t D2 t D3 t Dn Ahora tenemos dos dominios de tiempo, uno que aparece durante la adquisicion como siempre, otro que se origina a causa del periodo variable.

2 Las basicas de la RMN 2D Tenemos que renombrar algunos de los parametros para estar a tono con la literatura: A la primera perturbacion del sistema (pulso) se le llama la preparacion del sistema de espines. Al tiempo variable t D lo renombramos tiempo de evolucion,. Tenemos un evento de meclado, en el cual informacion de parte del sistema de espines pasa a otras partes. Finalmente, vamos a tener un periodo de adquisicion (t 2 ) como en todos los eperimentos 1D (la FID). Esquematicamente, lo podemos dibujar asi: Preparacion Evolucion Meclado Adquisicion t 2 es el periodo variable, t 2 es el periodo de adquisicion normal. Vemos que vamos a tener frecuencias f 1 f 2 Este formato es basicamente el mismo para todas las secuencias de pulsos 2D ( en realidad nd)...

3 Un eperimento 2D rudimentario Vamos a ver como esto con el esqueleto de lo que va a ser la secuencia de pulsos COSY. Imaginense estos pulsos, donde es el tiempo de preparacion: t 2 Lo analiamos para una singulete fuera de resonancia (ω o ), para un monton de s diferentes. Empeando luego del primer pulso π / 2: ω o ω o

4 El 2D rudimentario (continuado) ω o ω o El segundo pulso π / 2 actua solo sobre la componente de la magnetiacion que este en el eje del plano <>. La componente en el eje no es afectada, pero su amplitud va a depender de la frecuancia del pico. A( ) = A o * cos(ω o * )

5 El 2D rudimentario (mas ) Si hacemos un stacked plot, nos da: A( ) ω o f 2 (t 2 ) Ahora tenemos datos en frecuencia en un eje (f 2, que viene del tiempo t 2 ), datos en funcion del tiempo en el otro ( ). Como la variacion de intensidad en es tambien periodica, podemos hacer una seudo-fid mirando a los puntos para cada frequencia de los picos en f 2. Una cosa que no estamos considerando durante todos estos pulsos, esperas, puslos, etc., es que la señal tambien va a estar afectada por relajacion T 1 T 2.

6 El 2D rudimentario ( mas ) Ahora tenemos FIDs en, podemos hacer una segunda transformada de Fourier en el dominio de (la primera fue el dominio de t 2 ), obtenemos un espectro bi-dimensional: ω o f 1 ω o Tenemos cross-peaks donde las dos lineas se interceptan en el mapa 2D, en este caso en la diagonal. f 2 En un espectro real con un monton de señales mirar esto es imposible. Lo miramos desde arriba, tenemos un espectro de contornos. Rebanamos los picos distintas alturas. ω o ω o Cada rodaja tiene un codigo de color que depende de la altura del pico. f 1 f 2

7 Lo mismo con datos reales Esto es del COSY de la pulegona... tiempo-tiempo t 2 tiempo - frecuencia f 2 frecuencia - frecuencia f 1 f 2

8 Lo mismo con datos reales (continuado) El espectro de contornos con todos los cross-peaks: f 1 f 2 De donde salieron todos los picos fuera de la diagonal (off-diagonal), que quieren decir? Vo a tratar de eplicarlo, pero esto es algo para lo cual necesitariamos de un tratamiento matematico riguroso para entenderlo bien.

9 Correlacion homonuclear - COSY COSY significa COrrelation SpectroscopY, en este caso en particular en que lidiamos con acoples homonucleares, espectroscopia de correlacion homonuclear. Cuando desarrollamos la idea del espectro 2D consideramos un espin aislado sin acoples a nada mas. Obviamente, esto no es mu util. El COSY es util para averiguar que espin esta acoplado con otros espines. Los picos fuera de la diagonal indican esto, osea, que los dos picos en la diagonal estan acoplados. Con esta idea basica vamos a tratar de ver el efecto de la secuencia de pulsos COSY t 2 en un par de espines acoplados. Si recordamos el diagrma de energia de este sistema: α I β S I S β I β S S I α I α S βi α S J (H) I S Si miramos al nucleo I aplicamos los dos pulsos π / 2 (un seudo-pulso π), invertimos parte de la poblacion del espin S, esto tiene un efecto en I (transferencia de polariacion ).

10 Correlacion homonuclear (continuado) Como la tranferencia de polariacion de I a S o de S a I es lo mismo, lo eplicamos de I a S asumimos que nos da lo mismo de S a I. Perturbamos I vemos lo que pasa con S. Despues del primer π / 2, tenemos dos vectores de I en el eje, uno moviendose a ω I + J / 2 el otro a ω I - J / 2. El del segundo pulso va a poner componentes de la magnetiacion alineada con + en el eje -, lo que quiere decir que tenemos una inversion parcial de las poblaciones de I. Para = 0, tenemos inversion completa de los espines I (es un pulso π) la intensidad de la señal de S no cambia. Para todos los otros tiempos va a haber un cambio en la inensidad de S que depende periodicamente de la frecuencia de resonancia de I. La variacion en la inversion de poblacion de I depende del coseno (o el seno) de su frecuencia de resonancia. Considerando que estamos en resonancia con una de las lineas que = 1 / 4 J: J / 2

11 Correlacion homonuclear (mas ) Para el caso general (nada en resonancia), llegariamos a esta relacion para el cambio de la intensidad de la señal de S (depues del pulso π / 2) en funcion de la frecuencia del espin I el acople J IS : A S (,t 2 ) = A o * sin( ω I * ) * sin (J IS * ) * sin( ω S * t 2 ) * sin (J IS * t 2 ) Despues de la transformada de Fourier en t 2, teniendo en cuenta tambien al espin I, nos da: ω S ω I ω I ω S f 1 f 2 Esta es la huella tipica de un doblete en un COSY con fase sensitiva (phase-sensitive COSY). Los senos hacen que las señales sean dispersivas en f 1 f 2.

12 Correlacion heteronuclear - HETCOR El COSY (o eperimento de Jenner) fue uno de los primeros 2D (1971), es una de las secuencias de pulso 2D mas utiles para elucidacion estructural. Tiene miles de variaciones mejoras (DQF-COSY, E-COSY, etc.). De manera similar podemos hacer un eperimento 2D para determinar conectividad heteronuclear, osea, que 1 H esta conectado a que 13 C. Se le llama espectroscopia de correlacion heteronuclear (HETeronuclear CORrelation spectroscop, o HETCOR). En este caso, la secuencia involucra tanto 13 C como 1 H, a que de alguna manera tenemos que marcar las intensidades de los 13 C con lo que le hacemos a las poblaciones de 1 H. La secuencia basica es: 13 C: 1 H: { 1 H}

13 HETCOR (continuado) Analiamos primero lo que le pasa a los 1 H s en un CH (osea, vamos a ver como afectamos a las poblaciones de 1 H), despues vemos como afectamos a la señal de 13 C. Para diferentes valores de tenemos:, = 0, = J / 4, = 3J / 4

14 HETCOR (mas ) Como en el COSY, vemos que dependiendo del tiempo que usemos, tenemos una variacion periodica en la inversion de poblacion de los 1 H. Podemos ver claramente que la inversion depende del acople J CH. A pesar de que lo hicimos en resonancia para simplificar, podemos ver que esta variacion tambien va a depender de la frecuencia de los 1 H (δ). De lo que sabemos de IPS e INEPT, podemos predecir que la variacion en las poblaciones de 1 H va a tener el mismo efecto periodico en la transferencia de polariacion a 13 C. En este caso, el diagrama de energia para dos espines ( 1 H 13 C) seria: α C β H 2 13 C 4 β C β H 1 H 1,2 3,4 1 H α C α H 1 13 C 3 β C α H 1,3 2,4 I S Ahora, como la intesidad de la señal de 13 C que detectamos en t 2 esta modulada por la frecuencia del 1 H acoplado, la FID de 13 C tiene informacion sobre las frecuencias de 13 C de 1 H.

15 HETCOR ( mas ) De nuevo, la intensidad de las lineas de 13 C s va a depender de la inversion de poblacion de 1 H s, osea, de ω 1H. Si graficamos a distintos s, nos da: (ω 1H ) La intensidad de las dos lineas de 13 C va a variar con ω 1H J CH entre +5-3 como en el caso de la secuencia INEPT. ω 13C f 2 (t 2 ) Matematicamente, la intensidad de una de las lineas de 13 C del multiplete va a ser una ecuacion que depende de ω 13C en t 2, de ω 1H en, de J CH en las dos dimensiones: A 13C (, t 2 ) trig(ω 1H ) * trig(ω 13C t 2 ) * trig(j CH ) * trig(j CH t 2 )

16 HETCOR ( mas ) Una transformada de Fourier en las dos dimensiones nos da es espectro de correlacion 2D (como contornos): ω 13C J CH ω 1H f 1 f 2 La diferencia principal con el COSY es que el espectro 2D no es simetrico, porque un eje tiene frecuencias de 13 C el otro de 1 H. Barbaro, pero todavia tenemos acople J CH en todas las señales del espectro 2D que aparecen como cuadrados. El rango de J CH es H, por lo tanto vamos a tener un monton de superposicion de cross-peaks de distintos sistemas de espines CH. Vamos a ver como eliminamos esto sin desacoplar (si desacoplamos todo el tiempo eliminamos la transferencia de polariacion de 1 H a 13 C...).

17 HETCOR sin acople J CH La idea es basicamente hacer lo mismo que hicimos en el eperimento INEPT reenfocado. 180 / 2 / 2 13 C: 1 H: Δ 1 Δ 2 { 1 H} El pulso de π en 13 C es para reenfocar la magnetiacion de 1 H, los dos periodos variables estan para maimiar la transferencia de polariacion de 1 H a 13 C para tener reenfoque de los vectores de 13 C antes de desacoplar. Como en el INEPT, la efectividad de la transferencia va a depender del periodo Δ del tipo de carbono. Usamos un valor promedio. Analiamos el caso de un carbono CH...

18 HETCOR sin acople J CH (continuado) Para cierto valor de, el comportamiento de la magnetiacion de 1 H es: α (ω 1H - J / 2) β (ω 1H + J / 2) / 2 β α C / 2 α β β α Si hacemos que Δ 1 sea 1 / 2J, los dos vectores de 1 H van a desfasarse eactamente 180 grados. Aca es que tenemos la maor inversion de poblacion para este en particular, ningun efecto J CH : β Δ 1 β α α

19 HETCOR sin acople J CH (mas ) Que pasa con la magnetiacion de 13 C? Despues del π / 2 en 1 H vamos a tener dos vectores de 13 C separados en un radio 5 / 3 en el eje. Despues del segundo periodo Δ 2 (que lo hacemos 1 / 2J) se van a reenfocar: 5 Δ Ahora podemos desacoplar 1 H porque la magnetiacion de 13 C esta reenfocada. El espectro 2D no tiene acoples J CH (pero aun tiene informacion de corrimientos quimicos), lo vemos como un solo cross-peak centrado en los corrimientos quimicos de 1 H 13 C: ω 1H f 1 f 2 ω 13C

20 HETCOR de larga distancia Los periodos Δ 1 Δ 2 estan seleccionados de forma de maimiar la magnetiacion en antifase de 13 C para acoples 1 J CH. Osea, Δ 1 Δ 2 estan en el rango de 2 a 5 ms (el 1 J CH promedio es ~ 150 H, los periodos Δ 1 Δ 2 eran 1 / 2J). Esto funciona para protones carbonos directamente enlaados ( 1 J CH ). Si tomamos como ejemplo parte de lo que seria el HETCOR del alcanfor: H 3 C CH 3 H a b H 3 C O Una epansion del espectro para los carbonos a b seria mas o menos asi : f 2 ( 13 C) H b f 1 ( 1 H) H a H c C a C b

21 HETCOR de larga distancia (continuado) El problema es que los carbonos a b son mu parecidos quimica magneticamente: Solo con esta informacion no podemos determinar cual es cual. Seria bueno poder determinar cual de los dos carbonos esta mas cerca al proton en C c, a que de esa forma podriamos asignar inequivocamente los dos carbonos en el alcanfor: H 3 C b c CH 3 H H b H a a H c H 3 C O C a C b Como podemos hacer esto? Ha, en principio, una eperimento mu simple que se basa en acoples C-H de larga distancia. Aparte de los acoples 1 J CH, los carbonos protones van a and tener acoples de larga distancia, que van a ser de dos o tres enlaces ( 2 J CH o 3 J CH ). Las magnitudes son mucho mas chicas que las de los acoples directos, pero igual son considerables, entre 5 20 H. Podemos modificar el HETCOR para que nos muestre nucleos correlacionados por acoples de larga distancia?

22 HETCOR de larga distancia (mas ) La clave esta en entender lo que hacen los periodos variables en la secuencia, en particular Δ 1 Δ 2. Estos se usaban para reenfocar magnetiacion de 13 C en antifase. Para la parte de la secuencia en 1 H: β Δ 1 β α α Para la parte en 13 C: 5 Δ Para reenfocar, osea, para obtener los vectores alineados, en el caso de un CH, los periodos Δ 1 Δ 2 tienen que ser 1 / 2 * 1 J CH. Que pasaria si cambiamos los periodos Δ 1 Δ 2 a 1 / 2 * 2 J CH?

23 HETCOR de larga distancia ( mas ) Para empear, Δ 1 Δ 2 van a ser ~50 ms, mucho mas largos que antes (~5 ms). Lo que va a pasar ahora es que la magnetiacion de 13 C que este en antifase debido a acoples 1 J CH no se va a reenfocar, va a tender a cancelarse. Para la parte del reenfoque de 1 H: β Δ 1 α β α Los periodos variables no tienen nada que ver con 1 J CH, no tenemos inversion completa de las poblaciones de 1 H. Ahora, para la parte de 13 C: < 5 < 5 Δ 2 < 3 < 3 Cuando desacoplemos 1 H, vamos a eliminar casi toda la señal de 13 C que evoluciono bajo efectos de 1 J CH

24 HETCOR de larga distancia ( mas ) Al final, vemos que la maor parte de la magnetiacion que eveoluciono bajo efectos de 1 J CH s (tanto 1 H o 13 C) va a desaparecer. En cambio, la magentiacion de 13 C en antifase que se origino debido a 2 J CH s a tener los Δ 1 and Δ 2 correctos, se va a comportar como vimos antes. Para 1 H: β Δ 1 (1 / 2 2 J CH ) β α α Para 13 C: Δ 2 (1 / 2 2 J CH ) 3 5 El resultado es que solo los 13 C con acoples 2 J CH van a dar correlaciones en el HETCOR podemos ver los enlaces de larga distancia.

25 HETCOR de larga distancia (... mas) Considerando que todo esta en nuestro favor, obtenemos: H 3 C b c CH 3 H H b H a a H c H 3 C O C a C b Barbaro. Ahora vemos el acople de larga distancia, podemos determinar cual CH 2 es cual en el alcanfor. La eplicacion la hicimos para CH s, pero eso lo mismo para CH 2 s CH 3 s. En realidad, nada funciona como queremos (Murph). Esta secuencia tiene varios problemas. Primero, seleccionar los Δ 1 Δ 2 para ver 2 J CH en ve de 1 J CH es un centro al area. Segundo, aparte del periodo de evolucion (que es del orden de 10 a 20 ms), los periodos Δ 1 Δ 2 son bastante mas largos. Vamos a tener un monton de relajacion de los 13 C s, las señales van a ser petias. Mas importante aun, como los 1 H s se relajan mucho mas que los 13 C s, la transferencia de polariacion va a ser minima, por lo tanto no vamos a ver correlaciones fuertes.

26 HETCOR-COLOC Como solucionamos esto? Si queremos usar la misma idea que hasta ahora, i.e., reenfocar la magnetiacion de 13 C asociada con 2 J CH, tenemos que mantener a Δ 1 Δ 2. El unico periodo que podemos acortar, en principio, es el periodo de evolucion variable,. Como hacemos esto si necesitamos que este periodo creca de eperimento a eperimento para obtener la segunda dimension? La solucion es hacer un eperimento de tiempo constante. Esto involucra tener un tiempo de evolucion que en total es constante e igual a Δ 1, pero poner pulsos de 180 dentro del periodo de evolucion que avanen durante este tiempo. Un ejemplo de este tipo de secuencia es llamado COrrelations via LOng-range Couplings, o COLOC: 180 / 2 Δ 1 - / 2 Δ 2 13 C: H: / 2 Δ 1 - / 2 Δ 2 { 1 H} Δ 1

27 HETCOR-COLOC (continuado) Como se ve en la secuencia, el periodo Δ 1 queda igual, asi como tambien el periodo total. En cambio, logramos la evolucion en avanando de forma constante los dos pulsos de 180 durante el periodo de eperimento a eperimento. Podemos analiar como funciona la secuencia de la misma forma en que analiamos el HETCOR comun. Hacemos el analisis para un C-C-H. El primer pulso de en 1 H pone a la magnetiacion de 1 H en el plano <>, donde evoluciona bajo el efecto de J CH ( 2 J CH en el caso de C-C-H) por un periodo / 2, que es variable. La combinacion de pulsos de 180 en 1 H 13 C invierte la magnetiacion de 1 H las marcas de los vectores de 1 H:... / 2 β α C 1801 H β α

28 HETCOR-COLOC (mas...) Despues de Δ 1 - / 2, la magnetiacion continua desfasandose. Pero como el tiempo total es Δ 1, vamos a tener inversion completa de la magnetiacion de 1 H, por lo el maimo de transferencia de polariacion de 1 H a 13 C. Ademas, marcamos la magnetiacion de 13 C con la frecuencia de 1 H (que nos da la correlacion ). Como siempre vamos a tener inversion completa de la magnetiacion de 1 H reenfoque, no tenemos acoples 2 J CH en la dimension de 13 C (f 1 ). Finalmente, en el periodo Δ 2 tenemos renfoque de la magnetiacion 13 C en antifase, de la misma forma que en el HETCOR reenfocado, podemos desacoplar durante la adquisicion para eliminar 2 J CH en la dimension f 2 : 5 Δ La ventaja de esta secuencia es que hacemos lo mismo que en un HETCOR pero en mucho menos tiempo porque el periodo Δ 1 esta incluido en la evolucion durante. Es mas, en ve de aumentar de eperimento a eperimento, movemos sistematicamente los pulsos de 180 para obtener transferencia de polariacion marcado por frecuencias.