La Biología Molecular y el diagnóstico de portadores crónicos de Trypanosoma cruzi Un enfoque desde el banco de sangre

Transcripción

1 La Biología Molecular y el diagnóstico de portadores crónicos de Trypanosoma cruzi Un enfoque desde el banco de sangre Analía Toledano Bioq. Especialista en Hemoterapia e Inmunohematologia Departamento de Hemoterapia e Inmunohematología Hospital de Clínicas - Universidad de Buenos Aires Servicio de Infectologia -Hospital de niños Ricardo Gutierrez Cátedra de Microbiologia Clinica- Departamento de Bioquimica Clínica-FFyB-UBA

2 Enfermedad de Chagas Mazza También denominada Tripanosomiasis Americana o Mal de Chagas Es una PARASITOSIS Es una ZOONOSIS zoo(animal) nosis (enfermedad) Es ENDEMICA desde México hasta el sur de la República Argentina y Chile

3 Interés de la profundización en en el estudio de la Enfermedad de Chagas de el Banco de sangre MUERTES/AÑO Wkly Epidemiol Rec 2000;10-2. Lancet 03;362: Según cifras estimadas por La Organización Mundial de la Salud de 16 a 18 millones de personas están infectadas y alrededor de 90 a 100 millones se encuentran en riesgo de adquirir la enfermedad, mientras que el 30% de los infectados desarrollara manifestaciones cardiacas y el 10 % manifestara sintomatología digestiva. World Health Organization. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases. First WHO report on neglected tropical diseases. Ginebra: WHO; Afecta de forma endémica a 21 países de América. WHO Technical report series; 905.Control of Chagas Disease: Second report of the WHO expert committee En Argentina hay regiones denominadas de alto bajo y mediano riesgo vectorial, como asi tambien de riesgo no vectorial: congénito, transplantes de órganos, transfusiones En nuestro Hospital se atienden pacientes provenientes de zonas de riesgo de trasmisión vectorial. El banco de sangre sirve como un catastro epidemiolágico y como un punto estratégico para el estudio y caracterización poblacional.

4 METODOLOGÍAS diagnósticas DISPONIBLES MÉTODOS DIRECTOS gota gruesa Strout micrométodo INP Hemocultivo PCR (en vías de estandarización) METODOS INDIRECTOS (serológicos) De Tamizaje (ELISA-HAI-IFI-AP) Suplementarios (no disponibles)

5 Fundamento del par serológico Normas para el diagnóstico de la infección chagásica Res MSAL 532/97 Los antígenos son de composición muy variable y ninguno alcanza por sí solo el 100% de efectividad diagnóstica con 2 reacciones serológicas se puede alcanzar un rango de sensibilidad del % Estrategia de 2 métodos en paralelo HAI/ELISA IFI/ELISA HAI/IFI

6 Normativas y recomendaciones OMS 1991: Par serológico (sensibilidad %) Normas MT Mercosur (Res 42/00): Par serológico OMS 2002 (WHO-TRS 905; 2002: pp30): Tamizaje: 1 método de alta sensibilidad (>99%) Diagnóstico: Par serológico Argentina: Tamizaje y diagnóstico por Par serológico Brasil: Hasta 2002: Tamizaje y diagnóstico por Par serológico Desde 2003: Tamizaje por 1 ELISA 2005: Diagnóstico con par serológico

7 El problema del par serológico en paralelo: Los resultados indeterminados 3% en diagnóstico (Gomes YM y col. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009; 104 (Suppl. I): ) 4% en donantes (Otani MM y col. Transfusion. 2009;49(6): ) 5% en diagnóstico (WHO Tech Report Series 905, año 2002) Estudio multicéntrico del Programa de Calidad de la Provincia de BsAs (año 2004; N = 493): 6 reactivos en simultáneo Criterio de positividad >3 reactivos positivos: Muestras indeterminadas por par serológico de rutina (Screening inicial en los centros): 8.9% ELISA R + ELISA L: 5.2% ELISA L + AP: 6.4% ELISA R + AP: 7.8% ELISA L + HAI: 7.4%-13.6% ELISA R + HAI: 8.7%-14.6%

8 BIOLOGIA MOLECULAR Utilidades Detección precoz en neonatos de madres con serologías reactivas para T. cruzi. Detección precoz de reactivaciones en pacientes chagásicos inmunosuprimidos. Definición de casos de donantes de sangre con serologías discordantes. Herramienta de epidemiología. Monitoreo de tratamientos.

9 Optimización de un sistema de detección de la infección por Trypanosoma cruzi para diagnóstico precoz en neonatos, inmunosuprimidos y donantes de sangre. Hospital de Clínicas. U.B.A. UBACYT CM20

10 Implementación de una prueba de biología molecular para Trypanosoma cruzi en donantes de sangre con serología reactiva Métodos serológicos Hemoaglutinación indirecta, ELISA ag lisado y ELISA ag recombinante Métodos moleculares A la muestras con al menos un resultado de serología reactivo se les realizaron métodos moleculares (PCR real time y convencional) Blancos moleculares: sat DNA (primers Tcruzi1y Tcruzi2) kdna (primers 32f y 148r) Tipo de muestras; Sangre entera con EDTA como anticoagulante Población en estudio Desde 07/2012 hasta 07/2016 se estudiaron muestras de candidatos a donantes de sangre

11 Gel de poliacrilamida 10% Blanco sat DNA Banda 180 bp Calle 1: 1 par/ml Calle 2: 0,1 par/ml Calle 3: 0.01 par/ml Calee4: par/ml Calle 5 : par/ml Calle 6 : CN Calle 7: PM PM

12 Gel de poliacrilamida 10% Blanco K DNA 120bp 1 2 PM Calle 1: 10 par /ml Calle 2: 1 par /ml Calle 3: 0,1 par/ml Calle 5: 0.01 para/ml Calle 6: CN

13 Curvas real time

14 Resultados Sensibilidad analítica 0,1 parásitos/ml 0,1 fg de ADN /ml Se detectaron 122 donantes(ds) con al menos un resultado de serología reactivo (0,7%) 94 de 122 fueron reactivos pos dos o más métodos serológicos (0,53%) Positivo por 1 TS Positivo por 2 TS Pos por 3 TS DS (n 122) % ser reactiva 16,39 21,31 55,7

15 Resultados La prevalencia de ADN de T.cruzi fue de 13,11%( 16/122) 12/16 fueron detectables por los dos test de biología molecular( sat ADN y KADN) 4/16 fueron detectables por un solo test de biología molecular ( sat ADN o KADN) BLANCOs moleculares ADN T CRUZI solo sat + 1 solo kdna + 3 los dos blancos + 12 Total de muestras con pcr pos 16

16 Resultados 87,5%(14/16) de los resultados detectables para ADN de T.cruzi presentaban serología reactiva por tres métodos. Donantes con serología Rva PCR T. cruzi + Test N % N % HAI+ELIS+EREC 68 55, ,58 HAI+ELIS 3 2, HAI+EREC ELIS+EREC 23 18, HAI 12 9,83 0 REC 9 7, ,11 LIS 7 5, ,28 total ,11

17 Resultados Tabla de resultados de marcadores de Biología molecular según test serológicos reactivos Test N ADN sat + solo ADN sat+ ADN kdna + solo Kadn + ADN sat+kdna + HAI+ELIS+EREC HAI+ELIS HAI+EREC ELIS+EREC HAI REC LIS total

18 Según el lugar de procedencia Resultados País 1 sero pos 2 sero pos 3 sero pos total pcr pos % pcr pos Argentina ,89 Paraguay ,29 Bolivia ,33 Brasil Uruguay Paraguay Bolivia Brasil y Uruguay Argentina Procedencia 1 sero pos 2 sero pos 3 sero pos total pcr pos % pcr pos Sgo del Estero ,,52 Misiones Buenos aires Chaco ,09 Santa fe Jujuy CABA Tucuman Salta Cordoba Entre Rios Formosa Mendoza La Rioja desconocido Corrientes La pampa San Juan total

19 Resultados Según procedencia CON RIESGO VECTORIAL O SIN RIESGO VECTORIAL procedencia SRV CRV n= % PCRPOS 1 15 SAT 1 12 KDNA 1 14 sat+k 1 11 % PCR + 3,12 17,24 P<

20 Resultados En un grupo de 58 muestras se realizo Inmunofluorescencia indirecta(ifi) IFI NEG IFI POS TOTAL ANALIZADOS POR IFI PCR POS O 8 8 % PCR POS 0 25% 13,79

21 Estudio de prevalencia de ADN de Trypanosoma cruzi en residentes de áreas con riesgo vectorial y sin riesgo vectorial Objetivos: Estudiar marcadores moleculares para Trypanosoma cruzi (TC) en poblaciones con diferente riesgo de trasmisión vectorial (RTV) y serología reactiva para la infección. Resultados Tabla 1: resultados e DS Anti TC+ 1 método n=17 Anti TC+ 2 métodos o más n=62 TOTAL Anti TC + n=79 PCR + (ambas técnicas) PCR + sólo kdna TOTAL PCR % PCR Anti TC+ Anti TC+ TOTAL Tabla 2: 1 método 2 métodos o más Anti TC + resultados en IR n=2 n=20 n=22 PCR + (ambas técnicas) PCR + sólo kdna PCR+ sólo sat TOTAL PCR %PCR ,4 Toledano AP, Rey R, Gallo Vaulet ML, Fernández Toscano M, Mestre M, Tomeo AJ 1, Albornoz, Tapia A, Plebani N, Vellicce AF, Rodríguez Fermepín M, Rey JA.

22 Estudio de prevalencia de ADN de Trypanosoma cruzi en residentes de áreas con riesgo vectorial y sin riesgo vectorial La prevalencia de ADN de T.cruzi fue estadísticamente mayor en residentes del área con riesgo de transmisión vectorial y podría deberse a la posibilidad de reinfección a diferencia de los que migraron a otras áreas sin vector. Las discordancias encontradas entre las dos técnicas de BM justificarían la necesidad de implementar más de un blanco molecular en la detección. Toledano AP, Rey R, Gallo Vaulet ML, Fernández Toscano M, Mestre M, Tomeo AJ 1, Albornoz, Tapia A, Plebani N, Vellicce AF, Rodríguez Fermepín M, Rey JA.

23 Conclusiones generales La presencia de ADN detectada en muestras de donantes con un solo resultado de serología reactiva justifica y afianza el doble testeo de anticuerpos anti T.cruzi en los bancos de sangre. Las discordancias encontradas entre las dos técnicas de BM justificarían la necesidad de implementar más de un blanco molecular en la detección en estas poblaciones. La posibilidad de detectar ADN en portadores crónicos permite también la caracterización molecular en unidades discretas de tipificación (UDT) La posibilidad de transmisión de infección por transfusión depende de factores de riesgo como la carga parasitaria en el momento de la donación, la cepa de T.cruzi involucrada y la cantidad y tipo de hemocomponente recibido por el paciente. Estos estudios aportan herramientas para una mejor estimación de probabilidad de infección por T.cruzi. Nos permite plantear nuevas hipótesis acerca de la infectividad de los hemocomponentes que no presentan pruebas de Biología molecular reactivas para T.cruzi.

24 Detección de ADN de T. cruzi en pacientes Inmunosuprimidos Población en estudio: Se estudiaron muestras de 20 pacientes que presentaban distintos tipos de inmunosupresión y marcadores serológicos reactivos por al menos dos técnicas diferentes Resultados: Se pudo detectar la presencia de ADN de T. cruzi en un 20 % (4/20) de los pacientes estudiados. Ninguno presento manifestaciones clínicas de reactivación. Paciente inmunosuprimido debido a aplasia medular paciente PA M1 M2 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Fecha 06/10/ /10/ /01/ /04/ /04/ /05/ /05/ /06/ /06/2016 Ac anti T.cruzi reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo ADN de T.cruzi detectable no detectable no detectable no detectable no detectable detectable detectable no detectable no detectable PARASITOS/ML 5 p/ml N/A N/A N/A N/A 233 p/ml 1806 p/ml N/A N/A strout no realizado no realizado no realizado no realizado no realizado no realizado positivo negativo negativo

25 GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!! 25