Foro de Estudios sobre Guerrero SALUD Mayo 2013 Abril 2014 Vol.1 No

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1 629 Prevalencia y actividad hemolítica de la Citotoxina K de Bacillus Cereus en cepas aisladas de productos alimenticios del estado de Guerrero RAMÍREZ- PERALTA, Arturo, LEYVA-VÁZQUEZ, Marco Antonio Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas - UAGro. Av. Lázaro Cárdenas s/n, Cd. Universitaria Sur. Chilpancingo de los Bravo, Guerrero. México. Recibido Junio 4, 2014; Aceptado Octubre 13, 2014 Resumen Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio facultativo, esporulado, lo que le confiere resistencia a condiciones ambientales extremas, tales como calentamiento, congelación, secado y radiación; capaz de provocar cuadros clínicos de diarrea y vómito vinculados a alimentos, dichos cuadros se relacionan con la capacidad de la bacteria para producir toxinas, la cual depende de la presencia del material genético codificante para estas. Las células vegetativas de B. cereus se destruyen rápidamente por el calor, pero las esporas se clasifican como moderadamente resistentes, la resistencia se ve incrementada en alimentos con alto contenido de grasa y se ha observado una alta resistencia en alimentos con baja actividad de agua. Abstract Bacillus cereus is a Gram positive bacillus, facultatively aerobic, spore-forming, which confers resistance to extreme environmental conditions such as heating, freezing, drying and radiation; able to cause clinical symptoms of diarrhea and vomiting associated with food, these tables are related to the ability of bacteria to produce toxins, which depends on the presence of genetic material coding for these. The vegetative cells of B. cereus are rapidly destroyed by heat, but the spores are classified as moderately resistant, resistance is increased in foods with high fat and high resistance observed in foods with low water activity. Hemolytic cytotoxin K, Bacillus cereus. Hemolítica, Citotoxina K, Bacillus Cereus. Citación: RAMÍREZ-PERALTA, Arturo, LEYVA-VÁZQUEZ, Marco Antonio. Prevalencia y actividad hemolítica de la Citotoxina K de Bacillus Cereus en cepas aisladas de productos alimenticios del estado de Guerrero.. Mayo 2013 Abril 2014, 1-1: * Correspondencia al Autor (Correo Electrónico: kizzirguez@gmail.com) Investigador contribuyendo como primer autor. COCYTIEG

2 630 Introducción Las esporas de B. cereus son resistentes a la sequedad y resisten más en alimentos con alto contenido de grasa; cocciones por debajo de los 100 C pueden permitir la sobrevivencia de esporas. Por otro lado, en cuanto a la estabilidad térmica de las toxinas producidas por B.cereus, se ha demostrado que la toxina emética permanece activa después de un tratamiento térmico a 100 C por 15 minutos (rangos de ph 8,7 a 10,6) y a 126 C por 90 minutos; y es más resistente en alimentos con baja humedad. A diferencia de las toxinas del síndrome emético, las toxinas diarreicas son termolábiles, se destruyen a 56 C en 5 minutos (Alippi and López, 2010). La acción diarreogénica de B. cereus se ha relacionado con un complejo de enterotoxinas compuesto por la enterotoxina T (BcET), el complejo de la hemolisina BL (HBL), la enterotoxina no hemolítica (NHE) y la Citotoxina enterotóxica K (CytK). La citotoxina K provoca síndrome diarreico debido a su acción necrótica, hemolítica y efectos citotóxicos sobre el epitelio intestinal. El mecanismo de acción de la CytK es a través de la formación de poros transmembranales y citotoxicidad en células del epitelio intestinal. Se han descrito dos tipos de CytK, CytK-1 y CytK-2, siendo la primera alrededor de 5 veces más toxica sobre células epiteliales que la segunda, pero en eritrocitos se ha observado una actividad similar (Michelet et al., 2006). La síntesis de citotoxina K depende de la presencia del gen monocistrónico cytk expresado bajo su promotor, y cuya actividad es estimulada por el regulador transcripcional PlcR (Phospholipase C Regulator). PlcR afecta positivamente la síntesis de enzimas extracelulares, toxinas, bacteriocinas, transportadores, autolisinas y proteínas que participan en sense del ambiente. La caja de unión de PlcR se encuentra pocos pares de bases antes del promotor de cytk y afecta positivamente a su actividad. Estudios de Gohar et al. (2008) acerca de la regulación de la virulencia por PlcR en Bacillus cereus demostró que la expresión de los genes en la citotoxina K, enterotoxina hemolítica BL, y la enterotoxina no hemolítica NHE fueron fuertemente inducidos por el regulador PlcR. La expresión del gen cytk y el nivel de síntesis de la toxina dependen fuertemente de la actividad del regulador transcripcional PlcR, así como la presencia de la caja de unión de PlcR muy cerca de la secuencia promotora del gen cytk (Oltuszak- Walczak E. & Walczak P., 2013). Objetivo Determinar la prevalencia y actividad hemolítica de cepas de Bacillus cereus productoras de la citotoxina K en un grupo de cepas de Bacillus cereus aisladas a partir de muestras de alimentos comercializados en el estado de Guerrero Metodología A partir de un banco de cepas de Bacillus cereus aisladas y caracterizadas de acuerdo a la norma internacional ISO7260, se realizó la búsqueda y determinación del gen de la citotoxina K (CytK) así como la secuencia de unión al regulador transcripción PlcR. Detección de los genes cytk, HBL y PlcR. Para la búsqueda del gen codificante de la citotoxina K y de las fracciones de la hemolisina BL (hbla/b, hblc/l2 y hbld/l1), se utilizó PCR en punto final. Con los iniciadores y las condiciones de amplificación descritos por Lee et al. Para la búsqueda de los genes codificantes del regulador transcripcional PlcR, se utilizó PCR en punto final con las condiciones establecidas por Huillet et al en el productos alimenticios del estado de Guerrero..

3 631 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR La electroforesis de los productos amplificados se realizó en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio a una concentración de 0,0005 mg/ml. El gel se cargó con 10 μl de mezcla de carga (10 μl de las muestras amplificadas con 1 μl de buffer de carga) y se corrió a 85 V durante 45 minutos aproximadamente. Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pares de bases. Determinación de la capacidad hemolítica La capacidad para lisar eritrocitos se determinó incubando durante 5 minutos 1 ml de solución eritrocitaria de carnero al 1% con 1 ml de sobrenadante de cultivos bacterianos en fase logarítmica de las cepas de B. cereus, posteriormente se midió la hemoglobina liberada en los sobrenadantes en un espectrómetro a una longitud de onda de 545 nm. Como control positivo se utilizó la cepa ATCC de B. cereus, la cual presenta los genes de la toxina Hbl. Resultados y discusión De 74 cepas de B. cereus analizadas, se obtuvo una prevalencia del 20%(15/74) de cepas CytK positivas; el 67%(10/15) de estas mostró presencia de la región de reconocimiento del regulador transcripcional PlcR (figura 1), el cual se ha descrito influencia la actividad citoenterotóxica de CytK. Para ambos casos la determinación se realizó a partir de PCR en punto final (Fig.2 y 3). Figura 1 Frecuencia de cepas de B. cereus que presentan genes codificantes para CytK y PLCR Figura 2 Electroforesis en gel de agarosa (2%) de los productos de PCR para la identificación de la región codificante del gen cytk en 36 de 74 cepas del banco de muestras de B. cereus. Se utilizaron los primers Cyt K F y Cyt K R de A. Hernandez Muñoz, cuyo producto de aplicación esperado es de 525pb. Los carriles 2(B.c 119), 7(B.c 122), 9(B.c 144), 10(B.c 260), 16(B.c 265), 27(B.c 266), 29(B.c 287), 31((B.c 316), 32(B.c 321), 33(B.c 323), 37(B.c 324) y 38(B.c 396) muestran cepas con genes codificantes para la Citotoxina K. Figura 3 Electroforesis en gel de agarosa (2%) de los productos de PCR para la identificación de la región codificante y promotora del gen cytk que incluye la región de unión a PlcR en 8 cepas seleccionadas a partir del grupo de cepas de B. cereus Cyt K positiva con los cebadores P1-CytK, P2 y P3-CytK-CytK. Los cebadores P2 y P3-CytK-CytK son alelo específicos del gen Cyt K por lo que amplifican 238 pb (bandas inferiores) para todas las cepas Cyt K positivas independientemente de la presencia o no de PlcR, por lo que constituye un control interno de la reacción; y solamente en las cepas que presentan la región promotora del gen cytk y vinculate del regulador transcripcional PlcR se obtiene un producto de 369 pb (bandas superiores) utilizando los cebadores P1-CytK y P3-CytK-CytK. Los carriles 2(B.c 122), 5(B.c 144) y 6(B.c 260), muestran cepas con genes codificantes para la Citotoxina K totalmente funcionales ya que poseen la región PlcR. productos alimenticios del estado de Guerrero..

4 632 El grado de actividad de CytK se evidencio indirectamente con la prueba indirecta de hemolisinas. 67%(10/15) de las cepas presento PlcR positivo y variabilidad hemolítica, el 33%(5/15) restante con ausencia de PlcR mostró baja/nula actividad (Fig.4). Debido a que CytK no es la unica toxina con actividad hemolitica frente a eritrocitos de carnero; se determino la presencia del complejo hblacd por PCR en punto final (Fig.5) y de esta manera establecer, si la actividad hemolitica es solo por CytK o una combinación de ambas. Al contrastar resultados, se encontraron dos cepas que no poseen operón HBL, presentan cytk y mostraron un 96 y 12% de hemolisis según la presencia y ausencia de PlcR respectivamente, lo que reafirma que el grado de expresión y acción de la Citotoxina enterotóxica K es influenciado positivamente por acción de PlcR. Figura 4 Comportamiento hemolítico de cepas de B. cereus CytK positivas en presencia del regulador transcripcional PlcR. Figura 5 Electroforesis en gel de agarosa (2%) de los productos de PCR para la detección del complejo de la enterotoxina HBL en cepas de B. cereus. A) hbl A/B: Los carriles 2-6, 8, 9, 11-13, 15-19, 24, 27, 30-33, muestran cepas con el gen codificante para la proteína B del complejo de la Hemolisina BL. B) hbl C/L2: Los carriles 1, 5, 7, 8, 10, 13, 16, 19, 20, 22, 23, 28-30, 32 y 33 muestran cepas con el gen codificante para la proteína L2 de HBL. C) hbl D/L1: Los carriles 3, 6-8, 11, 15, 16, 19, 20, 23, 25-28, 31, corresponden a cepas con el gen codificante de la proteína L1 de HBL. Los resultados en conjunto permiten agrupar las cepas de los carriles 8(B.c 194), 16(B.c 144), 19(B.c 206) y 30(B.c 287) en un perfil de HBL completo, es decir, que poseen los tres genes del operón HBL. Por otro lado, las cepas de los carriles 14(B.c 122) y 21(B.c 119) evidencian la ausencia de los genes codificantes del complejo HBL. El resto de las cepas muestran un patrón discontinuo a la presencia de genes para el mismo complejo. Conclusión La presencia de CytK en cepas de Bacillus cereus aisladas a partir de muestras de alimentos comercializados en el estado de Guerrero plantea que dichos alimentos son un riesgo biológico potencial para los consumidores, mismo que incrementa en cepas cuya actividad del promotor del gen cytk es estimulada por presencia de PlcR. productos alimenticios del estado de Guerrero..

5 633 Referencias Alippi A.M. and López A.C. (2010). Enterotoxigenic gene profiles of Bacillus cereus and Bacillus megaterium isolates recovered from honey. Revista Argentina de Microbiología. 42: Huillet E, Tempelaars MH, André-Leroux G, Wanapaisan P, Bridoux L, Makhzami S, Panbangred W, Martin-Verstraete I, Abee T, Lereclus D (2012). PlcR a, a new quorumsensing regulator from Bacillus cereus, plays a role in oxidative stress responses and cysteine metabolism in stationary phase. PLoS One. 2012;7(12) Lee N., Sun J. M, Kwon K. Y., Kim H. J., Koo M., Chun H. S. (2012). Genetic diversity, antimicrobial resistance, and toxigenic profiles of Bacillus cereus strains isolated from Sunsik. J Food Prot. 75: Michelet, N., Granum, P.E. y Mahillon, J. (2006). Bacillus cereus enterotoxins, bi- and tri-component cytolysins, and other hemolysins. The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, 3 ed. Boston, Estados Unidos, Academic Press. pp Oltuszak-Walczak E. and Walczak P. (2013). PCR detection of cytk gene in Bacillus cereus group strains isolated from food samples. Journal of Microbiological Methods. 95: productos alimenticios del estado de Guerrero..