CONTROL MICROBIOLÓGICO EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA, BEBIDAS Y FARMACÉUTICA.

Transcripción

1 CONTROL MICROBIOLÓGICO EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA, BEBIDAS Y FARMACÉUTICA. Descripción El Método de Filtración Por Membrana: Un filtro de membrana, del tamaño de poro adecuado, se pone en el porta filtro y se filtra la muestra. En este proceso, los microorganismos que contiene la muestra son retenidos en la superficie del filtro por la acción de la membrana del filtro. Para el Método de Monitor MF, el monitor está listo para usarse, debido a la membrana preensamblada y al cojín que trae dentro. Los inhibidores de crecimiento pueden ser removidos lavando el recipiente con agua estéril después de la filtración. Finalmente, el filtro de membrana se coloca sobre el medio de cultivo y se incuba. Para el método del monitor, se agrega el medio nutriente en la parte superior y se hace un vacío muy corto, de menos de un segundo. Los nutrientes y los metabolitos se intercambian por medio del sistema de poros del filtro de membrana. Las Colonias, mismas que se han desarrollado en la superficie del filtro de membrana durante la incubación, son contadas y relacionadas con el volumen de la muestra. Las Ventajas Seguridad probada. Comparada con el método directo, un número considerablemente más grande de volumen de muestra puede ser analizado. Este efecto de concentración incrementa la seguridad de la detección microbiana. Resultados Cuantitativos. Las Colonias visibles pueden ser relacionadas directamente con el volumen de la muestra. Documentación. El filtro de membrana con las colonias que crecieron, puede ser archivada como un registro permanente de la prueba una vez que los microorganismos han sido inactivados. Sin Inhibidores. Los inhibidores, como aceites esenciales o desinfectantes, pueden ser removidos del filtro de membrana después de la filtración, mediante un enjuague. Calidad BPM (GMP). Los filtros de membrana de Sartorius están fabricados bajo condiciones de Buenas Practicas de Manufactura, asegurando calidad consistente y alta reproducibilidad de un lote a otro y en cada lote. El Medio de Cultivo. Los microorganismos pueden ser detectados por diferentes métodos. Métodos que involucran técnicas de cultivo y Microscopio son utilizados para detectar microbios mientras que técnicas bioquímicas y serológicas son utilizadas comúnmente para diferencias entre tales microorganismos. Para detectar microorganismos en cultivos, se emplean medios de cultivo líquidos y sólidos. Los microorganismos son concentrados mediante su crecimiento en uno de estos medios de cultivo. 1

2 La detección cuantitativa es posible únicamente con un medio de cultivo sólido porque el desarrollo individual de colonias puede ser evaluado y contado en la superficie. El medio de cultivo puede ser usado para pruebas microbiológicas como sigue: NKS (NPS) Juego de almohadillas nutrientes. Los NKS definitivamente optimizan el método de filtración por membrana. Con este método, se estandariza el procedimiento para las pruebas microbiológicas, haciéndolas mucho más eficientes. El trabajo de laboratorio se simplifica ayudándonos a ahorrar tiempo y dinero. Estos sets de filtración se describen en las siguientes páginas y ciertamente, nos ofrecen el camino más conveniente para usar el método de filtración por membrana. Las almohadillas absorbentes serán humedecidas con el medio de cultivo. El medio de cultivo con agar o gelatina como agente solidificante Los requerimientos del cliente para la estabilidad del crecimiento para la calidad y un mayor tiempo de vida de anaquel de alimentos y bebidas debe ser definida por el fabricante. No podemos limitar al Aseguramiento de Calidad la inspección de un producto final, como una botella de bebidas o un alimento preparado. Al contrario, el fabricante debe inspeccionar continuamente la entrada de materia primas y establecer puntos de control de calidad en el proceso de la producción si la planta quiere evitar pérdidas de producto y quejas de sus clientes. Las pruebas microbiológicas y de asepsia, juegan un papel definitivo en el Aseguramiento de la Calidad. En la industria de bebidas, la calidad microbiológica e higiénica debe incluir la estabilidad biológica de los productos como un criterio de importancia para su producción. La razón: sólo alguno microbios son a menudo los que dañan grandes lotes de una bebida. Debido al acelerado desarrollo de tecnología, se ha reducido el riesgo de contaminación por microbios dañinos y el aspecto del tiempo de vida de anaquel ha tomado nuevas dimensiones como resultado de un alto nivel de producción que ahora es posible. El control de la calidad de llenado y embotellado, en términos químicos y sobre todo de estabilidad biológica, debe ser adaptado a este desarrollo mediante la habilidad para el manejo de los métodos de prueba. Los requerimientos para practicar la metodología de métodos de prueba microbiana son tales que deben permitir en forma cuantitativa y reproducible la detección y seguimiento de una contaminación y que estos puedan ser desarrollados eficiente y económicamente bajo condiciones de rutina. Estos requerimientos son óptimamente cumplidos por el método de filtración por membrana. El principio de este método está basado en la concentración de microorganismos de una muestra relativamente grande, en la superficie del filtro de membrana y su posterior desarrollo en una almohadilla nutriente o en un medio de cultivo con agar. 2

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5 Cómo pedir los Medios NKS Un empaque estándar contiene 100 almohadillas nutrientes estériles, cada una, alojada previamente en una caja petri (cada bolsa ontiene 10 cajas petri) y 100 membrans empacadas individualmente en forma estéril. El juego de almohadillas nutrientes posee medio de cultivo deshidratado, con un diámetro de 50 mm. Una vez que se han humedecido con 3.5 ml de agua estéril y desmineralizada, están listos para ser utilizados inmediatamente. Las membranas filtrantes han sido fabricadas para cumplir los requerimientos de detección de microorganismos y están disponibles en 50 mm (ver la tabla más abajo) o 47 mm de diámetro (ordenar como 50 mm sustituyendo 50N por 47N). 5

6 Producto Detección / Determinación de Tipo de NKS Cerveza Lactobacilos VLB-S7-S Levadura Silvestre Lisina Hongos y Levaduras Wort, Extracto de Malta Alimentos Cuenta de Colonias total Estándar TTC, Estándar Caso Enterobacteria Endo, Teepol, M-MF, Tergitol TTC, ECD, MacConkey, Chromocult Bacterias mesofílicas y formadoras de esporas Glucasa-Tryptona termofílicas Pseudomonas aeruginosa Cetrimide Salmonella Sulfato de Bismuto Estafilococos Chapman Estreptococos Azida Hongos y Levaduras Wort y Extracto de Malta Leche E. coli y Coliformes Endo Salmonella Sulfato de Bismuto Estreptococos Azida Farmacéuticos y Candida albicans Saburaud Cosméticos Cuenta de Colonias total Caso, R2A Estreptococos fecales Azida Enterobacteria MacConkey Pseudomonas aurea Chapman Staphylococcus aureus Chapman Refrescos Microbios Acido-Tolerantes Suero de Naranja Cuenta de Colonias Estándar, Estándar TTC Bacterias Lácto-ácidas VLB-S7-S, Suero de Naranja Biocapa (Leuconostoc) Weiman Levaduras con membrana de 0.8 micras Wort, Schaufus-Pottinger, Extracto de Malta Azúcar Bacterias Mesofílicas y formadoras de esporas Glucose-Tryptone termofílicas Biocapa (Leuconostoc) Weman Hongos y Levaduras Wort, Schaufus-Pottinger, Extracto de Malta. Agua Cuenta de Colonias Estándar TTC, Estándar, R2A, Extracto de Levadura E. coli, y Coliformes Endo, Tergitol TTC, m-fc, ECD Estreptococos fecales Azida Psudomonas aeruginosa Cetrimida Vinos Acetobacterias Wort, Suero de Naranja, ambos humectados con 3% - 5% de Etanol Bacterias Ácido Lácticas Suero de Naranja Bacterias Ácido Lácticas (epecialmente Leuconostoc Jugo de Tomate Oenos) Hongos y Levaduras Wort, Schaufus-Pottinger, Extracto de Malta. 6

7 Descripción y Ejemplos de Crecimiento y su Evaluación Estándar TTC NKS Tipo Medio nutriente de peptona, extracto de carne, para determinar el conteo de colonias (cuenta total CFU) formulada de acuerdo con los Métodos Estándar para la Evaluación de Agua y Agua Residual 1998 y modificaciones por la adición del TTC. Tipo de membrana filtrante: 0.45 um, Verde con cuadrícula Verde Condiciones de incubación 48 horas a 30 C El tiempo y temperatura de incubación puede variar de acuerdo con el tipo de muestra que cumpla las normas. Evaluación Predominantemente, las bacterias crecen en este medio. Las colonias se tiñen de rojo por la reducción del TTC 7

8 Ejemplos de Crecimiento y Descripción de Evaluaciones. ECD- NKS Tipo MacConkey-NKS Tipo Tergitol TTC-NKS Tipo Medio de cultivo selectivo para detectar e identificar Escherichia coli, de acuerdo con la ISO Para aislar y diferenciar enterobacterias. Cumple con las especificaciones de la DAB 10 (Farmacopea Alemana) EP II y Para la detección de bacterias coliformes y E. coli, de acuerdo con Pollard, modificaciones de acuerdo con Chapman, y de la USP 25 y 35 LMBG (Ley acuerdo con ISO Alemana para Alimentos y Drogas) Tipo de Membrana: 0.45 m, blanca con cuadrícula verde Tipo de Membrana: 0.45 m, blanca con cuadrícula verde Tipo de Membrana: 0.45 m, blanca con cuadrícula verde Condiciones de incubación: Condiciones de incubación: Condiciones de incubación: horas a 37 C 18 a 24 horas a 37 C 20 4 horas a 37 C Evaluación Evaluación Evaluación La sal biliosa inhibe la flora que acompaña a los microbios que no viven en el intestino. Si las colonias con azul claro florecen a la luz UV, son E. Coli, confirmar con un teñido subsecuente con el reactivo Kovacs La E. coli forma grandes colonias de coliformes color rojo o rojizo, de un rosa intenso, algunas veces, colonias muy delgadas de enterobacterias lactosa-negativas, de colonias descoloridas. Microbios Gram- Positivos son generalmente inhibidos o su crecimiento es muy pequeño. Bacterias Coliformes de colonias rojas. Colonias de E. coli y Enterobacter aerogenes son de color amarillo a naranja con una zona amarilla. 8

9 Ejemplos de Crecimiento y Descripción de Evaluaciones. Shaufus-Pottinger-NKS Sabouraud-NKS Tipo Tipo Para la detección y Para cultivar hongos y determinación de cuenta (UFC) levaduras, bacterias ácido de hongos y levaduras en tolerantes y acidófilas; también bebidas y azúcar de acuerdo para detectar hongos y levaduras con Schaufus y Pottinger en bebidas como jugos de frutas, pruebas estériles en farmacéuticos y para aislar levaduras patogénicas y moho, de acuerdo con la USP 25. Tipo de Membrana Filtrante: a) 0.8 m, gris con cuadrícula blanca Condiciones de incubación Tipo de Membrana Filtrante: 0.65 m, gris con cuadrícula blanca Condiciones de incubación 2 3 días a C 2-5 días a C Evaluación Evaluación Los hongos se desarrollan en Las colonias de levaduras se colonias levemente o totalmente desarrollan de color blanco tenue blancos o grises y se pueden o muy colorido. Los hongos tornar en varios colores. Las forman un leve o tupido colonias de levaduras y algodoncillo; las colonias en su bacterias tienen una superficie fase inicial de crecimiento muy suave. pueden tornarse en varios colores. 9

10 Ejemplos de Crecimiento y Descripción de Evaluaciones. Azida NKS Tipo Para la detección de enterococos, de acuerdo con Slanetz y Bartley. Los enterococos son indicadores de contaminación fecal. Son menos sensibles a los efectos químicos que la E. coli y por lo tanto son mayormente detectables, por ejemplo, en agua residual y en agua clorada. Tipo de Membrana Filtrante: 0.45 m, verde con cuadrícula verde Condiciones de incubación horas a 37 C Evaluación Los enterococos forman colonias pequeñas de color rojo a ocre, de aproximadamente 1 mm de diámetro y con una periferia muy suave 10

11 Ejemplos de Crecimiento y Descripción de Evaluaciones. Chapman NKS Tipo Cetrimida NKS Tipo Medio de Manitol Cloruro de Sodio Rojo Fenol para la detección de estafilococos patogénicos en alimentos y otros materiales de acuerdo con Chapman (1945) y Modificaciones. Recomendado por la USP y la APHA. Tipo de Membrana Filtrante: 0.45 m, blanca con cuadrícula verde. Condiciones de incubación Para la detección de cuenta de colonias UFC de Pseudomonas aeruginosa, de acuerdo con Lowburry (1951). Este medio de cultivo cumple con las recomendaciones de la USP y APHA. Tipo de Membrana Filtrante: 0.45 m, blanca con cuadrícula verde. Condiciones de incubación 48 horas a 37 C 48 horas a 37 C Evaluación Evaluación Pseudomonas aeruginosa forman colonias azules con diámetro de 1 a 2 mm y zonas azules. Ocasionalmente las colonias pueden también ser gris azulosas, verde amarillentas o descoloridas. Otras Pseudomonas desarrollan colonias blancuzcas. Los Staphylococcus aureus desarrollan colonias de color amarillo dorado a naranja con una zona amarilla (positivo a manitol). Los Staphylococcus epidermidis forman colonias blancuzcas sin cambiar de color. 11

12 Crecimiento Comparado Debido a la variedad de localización de los poros, toda la membrana no garantiza un contenido de nutriente suficiente El tamaño de poro en sí mismo no es un criterio suficiente. Una comparación de una membrana de nitrato de celulosa con una membrana con mezcla de esteres revela diferencias significantes en el crecimiento. E. coli no muestra brillo metálico en una membrana de mezcla de esteres. En este caso, es muy difícil diferenciar entre E. coli y coliformes sin una prueba posterior. El color rojo en una membrana de mezcla de esteres es conveniente para el crecimiento de colonias. Un resultado cuantitativa es difícil. Las Pseudomonas crecen en colonias azules con una zona azul que se muestra claramente en la membrana Sartorius de nitrato de celulosa. En la membrana de mezcla de esteres, crecen menos colonias y sin la zona azul. Debido a la variación en la distribución de los poros, aquí la membrana con mezcla de esteres no garantiza suficientes nutrientes. Esto puede causar como resultado, falsos negativos. 12

13 Guía Para la Solución de Problemas: Una falla en el seguimiento de las instrucciones puede llevar a resultados no satisfactorios listados a continuación: 1.- Crecimiento inhibido, colonias muy pequeñas. Medio demasiado seco, no se utilizó agua suficiente. 2.- Colonias perdidas. Se humedeció demasiado el medio, se formó una película da agua sobre la membrana filtrante: se utilizó demasiada agua. Colonias de microbios en movimiento como los Bacilos o Proteus, tiendes a salirse aún cuando la dosis de agua aplicada sea la correcta. Para prevenir, agregue NaCl u otro emulsificante similar. 3.- Contaminación bajo la membrana. Se inhibe el crecimiento de la colonia, el exceso de agua sobre la membrana conlleva una decoloración del medio cuando: a) La membrana se pone con la cuadrícula hacia abajo sobre el medio, en lugar de con la cuadrícula hacia arriba. b) Hay contaminación del agua usada para la rehidratación. c) Se contamina durante la preparación (por los microbios en el ambiente o por contacto) d) Durante el enjuague del filtro, hay contaminación por una remoción incompleta de la muestra o del líquido de enjuague o por sacudir la caja petri de preparación. e) El porta filtro está contaminado f) Las pinzas están contaminadas. 4.- Crecimiento únicamente en las orillas. La caja petri se ladeo en la incubadora 5.- Crecimiento muy esparcido. (un número óptimo de microorganismos es entre 20 y 200 por filtro). Se seleccionó una mala dilución o la muestra se mezcló mal con el diluyente. 6.- Crecimiento no uniforme El volumen de la muestra fue de un filtrado de menos de 5 ml sin adicionar agua estéril como diluyente o el volumen de la muestra fue de una mezcla inadecuada con el diluyente. 13

14 Filtros de Membrana para uso en Placas de Agar o en Almohadillas absorbentes 14

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