Perspectivas de futuro del diagnóstico prenatal de las anomalías cromosómicas fetales Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales Antoni Borrell Hospital Clínic de Barcelona
Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PASADO
Tasa procedimientos invasivos (REDCBarcelona 1992-2009) 80 70 60 50 40 30 20 10 56 16 8 69 21 13 64 57 19 19 10 9 63 25 16 70 58 27 28 18 16 65 30 18 70 60 59 58 34 34 31 31 21 23 19 21 71 41 26 57 51 52 53 38 33 33 28 26 22 20 20 16 12 12 total Edat 35+ Edat<35 0 92 93 94 95 96 97 98 99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cribrado secuencial con interpretación independente ~ 8% edad materna avanzada ~ 5% TN aumentada ~10% screening bioquímico positivo ~ 6% angustia ~ 1% marcadores ecografía 20 semanas 30% procedimientos invasivos 85% detección T21
Evolución AC y BC HCB 1000 800 600 400 200 0 19 81 86 154 383 542 837 814 10 104 1033 958 965 921 264 316 188 815 720 736 724 731 657 661 620 621 606 501 531 530 560 509 491528 441 442 409 430 483 492 488 400 418 426 369 388 344 359 381372 411 385 312 318 267 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 0 2 4 6 8 10 154.
Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PRESENTE
Amniocentesis Biopsia Corial Obtención de líquido amniótico por punción transabdominal Obtención de vellosidades coriales por vía transcervical/transabdominal
Indicaciones Indicación AC BC Alto riesgo aneuploidia - edad materna avanzada - cribado bioquímico 2o trimestre - cribado combinado 1r trimestre - anomalía parental - anomalía previa - anomalía fetal 2t 1t Estudios moleculares/bioquímicos Infección fetal/amniótica
Edad gestacional AC < 14 s. nunca 14 s. excepcionalmente 15 s. si membranas coaptadas 16 s. idonea BC < 10 s. nunca 10-14 s. TC 11 s. TA Riesgo elevado RPM y malposición extremidades Nicolaides. Lancet, 1994 Asociado a defectos de reducción de extremidades e hipoplasia oromandibular Dolk. Lancet, 1992
Preprocedimiento Grupo y RhD Serologías víricas VIH VHB VHC si factores de riesgo Evaluar riesgobeneficio VIH: CV, HAART VHB: HBeAg,DNA VHC: DNA AC mejor BC? Lopez & Coll, Fetal Diagn Ther 2010
Técnica procedimiento: AC Técnica ambulatoria Control ecográfico: previo a punción punción ecoguiada aspiración ecoguiada Romero et al. Obstet Gynecol 1995 Aguja 22-20G - Punción transplacentaria si es el acceso más fàcil al pool de LA
Ventajas Amnio-Vacutainer Borrell et al.,prenat Diagn 2008 Aspiración más sencilla no se necesita un segundo operador o dejar la sonda ecográfica colocación de vacutainers por auxiliar Menor manipulación Mejor transporte
Técnica procedimiento BC Procedimiento ambulatorio Control ecográfico continuo TC Pinza Cánula TA aguja 18-20 G doble aguja cánula 18G +pinza
Dolor -Anestesia subcutánea AC: no diferencias RCOG 2010 -AC en zona más baja, más dolor -Scores de dolor Csaba,06 41 BC-TA 35 AC 26 BC-TC -BC: TA más dolorosa en obesas TC más dolorosa en nulíparas Wax,09
Postprocedimiento Gammaglobulina anti-d si RhD negativo VHB: IG específica (600UI) en: - HBeAg o DNA positivo - AC transplacentaria o en tercer trimestre Reposo 24 h. Dolor abdominal: AC, BC-TA Sangrado vaginal: BC-TC Riesgo de amniorrexis Riesgo de pérdida fetal
AC: riesgo de pérdida fetal Estudio Randomizado Tabor,1986 en 4606 mujeres bajo riesgo: 1% exceso (1.7% vs 0.7%) Cochrane Review Alfirevic & Mujezinovik, 2003 5 estudios con grupo control: 0,6% exceso de pérdida Centros con experiencia 0,13% exceso de pérdida (CI 0,07-0,20).Odibo,2007 Amniocentesis de tercer trimestre (Hodor, 2007 no aumenta riesgo de RPM, DPPNI, exitus fetal, cesarea urgente
BC: Riesgo de perdida fetal No estudios randomizados: BC vs Control Metaanálisis Alfirevic, 2007 AC BC antes 14 0.6 0.7 d. total 1.9 2.0 Cohorte Danesa: > 60000 gestantes. AC 1.4% - BC-1.9% (Tabor,2009) Grupo control: No exceso riesgo BC. No diferencias TC vs TA (Odibo, 2008) Randomización (US) TC (2.5%) vs. TA (2.3%) (Jackson, 1992)
Pèrdida < 24 s. (Caughey,06
Pérdida fetal: Experiencia operador AC Comparación ginecológo-perinatólogo (Blessed,01) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-ac Comparación con la experiencia anual (Stone,04) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-ac segun </> 50 AC anuales BC 40% más de riesgo de perdida fetal (OR 1,4) según <1000 />1500 proc ( periodo de estudio 11 años) (Tabor, 2009)
Borrell, 1999 Pérdida fetal Estudio randomizado HCB 301 BC vs. 335 AC Pérdida fetal espontanea hasta 1 s. post-parto : BC 2.3% (7/301) AC 2.4% (8/335) by intention to treat: 2.3% vs. 2.3% by actual treatment: 2.3% vs. 2.4% Pérdida fetal 2 s. post-procedimiento: BC 1.7% (5/301) AC 0.9% (3/335)
RIESGO AMNIOCENTESIS: 0.06%? 1% vs. 0.94% hasta 24 s.
RIESGO ABORTO: - edad materna - peso - etnicidad - pérdidas previas - diabetes mellitus - inducción ovulación - PAPP-A bajo - DV reverso - TN aumentada
No resultado en AC y BC RIESGO DE NO OBTENER MUESTRA (< 1%) AC: 2 punciones blancas BC-TC: Estenosis cervical BC-TA: No acceso al corion RIESGO DE NO OBTENER UN CARIOTIPO (<1%) AC: 0.5% fallo cultivo BC directo: no hay cultivo
Fiabilidad de AC y BC FALSOS POSITIVOS AC: Pseudo/mosaicos (0.9%) BC: Resultado no conclusivo: mosaico/ anomalía confinada placenta (2%) FALSOS NEGATIVOS AC: Contaminación materna (<1%) BC directo: 0.4% pero 9/10 anomalías ecográficas (van denberg,06) BC directo+cultivo 0.08%
QF-PCR en todas las amnios? No es necesario, sólo sirve per avanzar el resultado QF-PCR substituyendo el cariotipo? Quizas sí, en casos de edad materna avanzada y screening de 2 trimestre
En gemelos: AC o BC? RIESGO DE CONFUSION DE MUESTRAS EN DC DA - AC: NO (no fluoresceina) - BC: 1% en 2 placentas adyacentes RIESGO DE PERDIDA FETAL - AC: 2% Yukobowich,01 en 476 gemelares - BC: 1% PRECOCIDAD RESULTADO riesgo interrupción selectiva 1 gemelo DC: 5% < 16 s. 10% 16-20 s. 15% > 20 s.
Una o dos entradas? DICORIALES: SI MONOCORIALES DIAMNIOTICOS: NO, a no ser que exista una anomalía discordante MONOCORIALES MONOAMNIOTICOS NO es posible
Conclusiones 1) La edad materna no debería considerarse indicación de procedimiento invasivo 2) Los estudios genéticos y cromosómicos precisan de la extracción de material fetal mediante un procedimiento invasivo 3) Los procedimientos invasivos comportan un cierto riesgo de pérdida fetal Indicación clara 4) La AC se realiza a partir de la semana 15, idealmente en la semana 16 5) La BC es una técnica que se realiza precozmente Ventajas 6) En manos expertas, la biopsia corial y la amniocentesis tienen similar tasa de complicaciones. 7) Un programa de cribado precoz debe disponer de un método diagnóstico precoz
Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: FUTURO
Dos escenarios de futuro 1. Abandono: Diagnóstico prenatal no invasivo 2. Universalización: Estudio genómico masivo
Cell-free fetal DNA (cffdna) en circulación materna Descubrimiento del DNA fetal libre (cffdna) abrió nuevas perspectivas 1947: hallazgo DNA extracelular 1977: aumento DNA libre en pacientes cancer 1997: secuencias del cromosoma Y en sangre de gestantes portadoras de fetos masculinos (Lo,97)
Caracteristícas cffdna/rna Cuantificación cffdna en plasma: 3% en segundo trimestre 6% en tercer trimestre 10% estimaciones más recientes en T21 Persistencia cffdna: eliminación en 2h post-parto en 7/8 gestants y en todas en 2 d. (Lo,99). Vida media 16 min. Presencia RNA específico de la placenta (ZFY) en plasma materno (Poo,00).
Diagnóstico Prenatal no invasivo Al haber mucho más DNA libre materno que fetal, sólo es factible identificar las secuencias de origen paterno ausentes en la madre: 1) determinación sexo: cromosoma Y 2) RhD en gestantes RhD negativas 3) mutaciones paternas
DPNI aneuploidías 1) Selección ácidos nucleicos específicos fetales: - mrna: RNA-SNP allelic ratio - DNA metilado: epigenetic allelic ratio 2) Dosificación cromosómica relativa - Massively Parallel Sequencing (MPS)
RNA Allelic Ratio Localización selectiva ácidos nucleicos fetales: DNA: gen maspin (c18) imprintado en madre y no metilado en placenta RNA: transcrits PLAC4 (c21): cffrna de un gen que sólo se expresa en la placenta Dosificación cromosómica Allelic ratio : analisis de unos locus heterozigotos de SNPs (diferencia único oligonucleotido entre genomas paterno y materno) localizados en el gen estudiado.
Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (heterozygote) G G A 2:1 transcription release into circulation Normal Fetus (heterozygote) G A 1:1 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio
Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP 1:2 (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (heterozygote) G A A 1:2 transcription release into circulation Normal Fetus (heterozygote) G A 1:1 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio
Testing strategy for Down syndrome homozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus (homozygous) A A A? transcription release into circulation Normal Fetus (homozygous) A A? 1. Transcribed SNP locus on 21 st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating placental RNA in maternal plasma 4. Measure G/A ratio
The RNA Study (RNA-based Non-invasive testing for Aneuploidy) Jacob A. Canick & Glenn E. Palomaki Co- Principal Investigators Women & Infants Hospital Alpert Medical School of Brown University BROWN Women & Infants V4.1 An independent observational study funded by Sequenom, Inc.
Regiones diferentemente metiladas (DMR) en el cromosoma 21 Enriquecimiento de regiones hipermetiladas (DMR) del cromosoma 21 fetal Analisis discriminante muestra 8 DMR útiles
The Concept Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Normal Fetus Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Down syndrome Fetus 18 copies + 2 copies 20 copies 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfdna is fetal)
But fetal and maternal DNA are not distinguishable in MPS Relative amount of chromosome 21 Relative amount of chromosome 21 18 copies + 2 copies 20 copies 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfdna is fetal)
Schematic illustration of the procedural framework for using massively parallel genomic sequencing for the noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy. Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
Schematic illustration (cont) %chr21 = 1 / 51 = 2% Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
Schematic illustration (cont) ` 2.01 2.00 1.98 2.11 2.02 2.03 1.99 ------ 2.01 (sd=0.02) (2.11 2.01) Z = ---------------- = 5.0 0.02 Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
% of all unique reads Percent unique reads and corresponding z-score for chromosome 21, on 28 maternal plasma samples Black genomic representation Blue normal male Orange normal female Green T21 male Red T21 female Z-score Normal range Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458
Consideraciones finales DPNI Cuando estará a punto? Screening o diagnóstico? Sólo para T21?
Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica
Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural
Síndromes microdelecionals
Alteraciones DNA A. genómica: anomalía cromosómica numérica A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural A. génica: cambio de un par de bases
Resolución técnicas de citogenética CITOGENETICA CONVENCIONAL CITOGENETICA MOLECULAR ~10 Mb FISH ~130 Kb (sonda-específica) CGH-array 10Kb-1Mb 3.000 Mb
CGH-array
CGH-array
CGH-array
CGH-array
CGH-array
Procedimentos invasivos? 1) ABANDONO: El DPNI de la trisomia 21 fetal está en fase de estudio y su futuro inmediato dependerá en gran medida de los resultados de los proyectos en marcha basados en MPS. 2) UNIVERSALIZACIÓN: es una posibilidad futura, cuando un estudio exhaustivo de anomalías genéticas no comporte ni tantas dudas en su interpretación (CNV), ni unos costos tan altos.