Re\!. Med. Hosp. Na!. Nií'\os Costa Rica 19 (1): 1-8,1984 BACTERIOLOGIA DE ANAEROBIOS EN EL HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS Dr. Marco L. Herrera* y Dr. Jaime Guavara* INTROOUCCION Muchas de las infecciones de etiología bacteriana son causadas por bacterias anaerobias y en algunas de ellas constituyen el principal agente etiológico. Las bacterias anaerobias para las cuales el oxígeno es tóxico, son los habitantes más comunes de la piel y superficies mucosas. Se encuentran en una relación de lo: 1 y de 1000: 1 con respecto a las bacterias aerobias, en cavidad oral y tracto gastrointestinal respectivamente (2), por esta razón, deben ser tomadas muy en cuenta en infecciones asociadas con estas regiones anatómicas y en infecciones profundas. Pueden ser encontradas en abscesos de cualquier órgano (cerebro, pulmón, hígado, genitales, etc), en colitis asociada a antibioticoterapia, apendicitis, bacteremia, otitis media y crónica, celulitis, infecciones orales o dentales, endocarditis, endometritis, necrosis de músculo, peritonitis, salpingitis, artritis séptica, sinucitis y muchas otras localizaciones (1), la mayoría de las infecciones anteriormente descritas son dadas por anaerobios de fuente endógena; sin embargo, de fuente exógena se pueden encontrar bolutismo, tétano, gangrena gaseosa, gastroenteritis, aborto séptico, etc (1), En los lugares en que se encuentran como flora normal, es difícil diferenciar si están causando enfermedad o no, tal es el caso de esputo, aspirado bronquial, secreción faríngea, heces o descargas vaginales (1,2). Por esta razón las muestras deben ser tomadas muy cuidadosamente y los resultados de estos cultivos tomados de esas fuentes deben ser interpretados clínicamente con mucha cautela. Esto no ocurre con otro tipo de muestras que generalmente son estériles como sangre, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, punción pulmonar, contenido de abscesos, timpanocentesis y líquido subcutáneo (2l. Hay ciertos signos clínicos que sugieren la presencia de una infección por anaerobios: 1) descarga pútrida, 2) infección asociada con una superficie mucosa, 3) infecciones caracterizadas por necrosis de tej ido, formación de.mscesos y producción de gas, 4) infección asociada a lugares con mala irrigación sangu(nea ~sultante de un trauma, tumor o shock. También lo sugieren en el Laboratorio la falla para recobrar patógenos con cultivos aerobios especialmente cuando la tinció" de Gram * Ilospltal Nacional de Ninos "Dr. Carlos Sáenz Herrera", CCSS. San José, CO$ta Rica.
2 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA muestra la presencia de bacterias (2, 7). MATERJAL Y METOOOS Programamos un estudio para un año aproximadamente. Así, en el período comprendido entre julio de 1981 y a90sto de 1982 analizamos 257 muestras, 253 de niños hospitalizldos y de la Consulta Externa del Hospital y 4 muestras referidas de otros Hospitales. La toma de la muestra se realizó desinfectando la piel con abundante agua y jabón, pasando luego una solución de alcohol yodado en forma centrífuga. Luego se puncionó con jeringa descartable, evitando la contaminación con aire o con organismos de la flora' normal. La aguja se selló con un tapón de hule, estéril (2, 7). La muestra se transportó en forma inmediata al Laboratorio y se inoculó de inmediato en un medio prereducido, "Chopped Meat Glucose" (CMG) yen los medios para el cultivo de aerobios. Se realizó una tinción de Gram y se dibujó cada una de las diferentes morfologías bacterianas observadas. El cultivo de aerobios se llevó a cabo siguiendo los procedimientos tradicionales y el CMG se incubó hasta 5 días a 35 0 C. En los casos en que alcanzó alguna turbidez que indicaba crecimiento bac teriano. se procesó como a continuación describiremos; si no había turbidez después de esta incubación, la negatividad de la muestra se corroboró mediante tinción de Gram. Los cultivos de las muestras de sangre se mantuvieron por 15 días. El cultivo turbio se rayó sobre Agar CMG inclinado para separar colonias. Se practicó una tinción de Gram que se comparó con la original sirviendo esto como control. El Agar CMG se incubó por 48 horas a 35 0 C, de él se picó cada una de las diferentes colonias y se pasaron a un caldo CMG, haciéndose una tinción de Gram por cada colonia picada. En general se picaron de 10 a 15 colonias tratando de amo pliar las posibilidades de aislamiento. Estos platos con CMG inoculados a partir del Agar CMG. se incubaron a 35 0 C por 48 horas. Sabiendo la morfología bacteriana de cada tubo, los subcultivos obtenidos se sembraron en medios para aerobios y se sembró un agar sangre adicional que se incubó en atmósfera anaeróbica usando Gas-Pack, con la finalidad de observar la presencia de hemólisis y comprobar la pureza del caldo, lo cual no se logra con una simple tinción de Gram. Si había crecimiento en los platos incubados aeróbicamente se identificó el microorganismo; si no había crecimiento, se continuó con el culti va anaeróbico. Para identificar los anaerobios se realizó en primer lugar una cromatografía de gases usando un cromatógrafo SYGMA 3 de la casa Perkin-Elmer con columna de aluminio y soporte sólido de CHROM 6 DMCS 70/80 V una fase /(quida de FFAP al 5%,. La cromatografía de gases junto con la tinción de Gram y la movilidad nos dá una orientación muy acertada del organismo que estamos identificando. Luego, haciendo uso de tablas de clasificación y montando pruebas como fermentación de carbohidratos, catalasa, indol, crecimiento en bilis al 20';',hidrólisis de la esculina, reducción de nitratos, lipasas, lectinasas etc. se identificó el germen en forma específica (5, 6,8,10,12,13,15,16,17, 18). los medios de cultivo usados en este estudio son pre-reducidos antes de esterili zar (PRAS) y reforzados con hemina, vitamina K I Y l-cisteina. carne y glucosa como agentes reductores (10. 19); esta última también como fuentp. de energía.
Herrera. M. & Guevara. J.:BACTERIOLOGIA DE ANAEROBIOS 3 RESULTADOS Se obtuvo un total de 169 cepas de anaerobios,de las cuales se clasificaron 164. No fue posible clasificar 3 cocos Gram positivos y 2 bacilos Gram negativos. Con la introducción de las técnicas anaerobias, el porcentaje de muestras positivas subió de un 57,9% alcanzado por los aerobios, a un 70,9%. El 21,4% de las muestras positivas tuvieron infección mixta por anaerobios y aerobios, Cuadro 1. Cuadro 1 Porcentaje de aislamiento en 257 muestras Cultivos Positivos No. (fr, Aerobios y Anaerobios 55 21,4 Anaerobios 33 21,8 Aerobios 94 36,6 Negativos 75 29,2 los bacilos Gram negativos se encontraron en un 42,6 de los casos; los cocos Gram positivos se aislaron en un 24,8/Y,,; los bacilos Gram positivos no formadores de espora en un 13,6'); los cocos Gram negativos en un 11,2% y los bacilos Gram positivos formadores de espora en un 1,7%, Cuadro 2. Cuadro 2 Distribución según morfología y tinción de Gram Positivos No. (}11 Bacilos Gram negativos 72 42,6 Cocos Grarn positivos 42 24,8 Bacilos Gram positivos 23 13,6 no esporulados Cocos Gram negativos 19 11,2 Bacilos Gram positivos 13 7,7 esporujados los anaerobios más frecuentes fueron Bacteroldes sp., seguido por Peptococcus sp., Ve/f/o/lellél sp., FIIso/); cteríllm sp., Propíoníbacterium sp., y Clostridium sp. Cuadro 3.
4 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE N'f'; OS DR CARLOS SAEN2 HERRERA Cuadro 3 Clasificación de los anaerobios aislados Bacteria Bacteroides sp. Peptococcus sp. Veil/onella sp. Fusobacterium sp. Propionibacterium sp. Peptostreptococcus sp. Otros '1, 30,8 14,2 10,0 9,5 8,9 7,1 19,5 Bacteria Cuadro 4 Distribución de cultivos positivos Positivos No. Anaerobios y Aerobios 55 30,2 Anaerobios 33 18,1 Aerobios 94 51,7 Total cultivos positivos 182 100 Como se observa en l!l Cuadro 4, de las muestras positivas el 18,1 %tenían sólo anaerobios; el 51,7% sólo aerobios y el 30,2% tenían ambos. Se obtuvieron 6 hemocultivos positivos, uno de los cuales fue por Clostridium bifermentans, en un adulto internado en el Hospital n.1éxico, uno con Arachnia propionica, otro con Peptostreptococcus sp., otro con Eubacterium sp., otro con Fusobacterium sp. y uno con doble etiología: Peptostreptococcus sp. y Veillonella sp. La Arachnia sp. y el Peptostreptococcus sp. se aislaron de niños con problemas respiratorios, 81 Eubacterium sp. provenía de un neonato, el Fusobacterium sp. de un nlro con derrame pleural en el que se aisló el mismo germen, V la doble etiologla se presentó en un caso de autopsia de un paciente con meningitis por los mismos mi' croorganismos y que ten(a una derivación ventrículo-peritoneal infectada. La mayoría de 'as multstras proven(a de abscesos superficiales y profundos de muy diversa localización anatómica. En ellas se presentó el mayor número de negativos y el Staphvlococcus aureus fue el germen aislado con mayor frecuencia, seguido por Bacteroides Ip. y Peptococcus sp. Las muestras mil, ricas en anaerobios fueron las apendiculares y peritoneales, so los o con aerobios. Las infecciones mixtas fueron las ma~ IXlrrlentes. El microorga-
Herrera. M. & Guevara, J.: BACTERIOLOGIA OE ANAEROBIOS 5 nismo más frecuente fue el Bacteroides sp. con predominio del B. fragilis. Otros anaerobios aislados con frecuencia fueron Propionibacterium sp., Veillonella $p., Peptococcus sp., Peptostreptococcus sp., Fusobacterium sp. yen escasas oportunidades Clostridium sp. En muestras obtenidas por timpanocentesis se aisló en dos oportunidades Veillonella sp. (3,4,7). Tres derrames pleurales se reportaron positivos, uno por Bacteroides fragilis, uno por Fusobacterium,p. y otro con doble etiolog(a por FusobatteriuJiJ sp. y Peptostreptococcus sp. Se encontró Clostridium sp. en un caso de tétano neonatal y Clostridium perfringens en una gangrena gaseosa por mordedura de serpiente. Un líquido aschico (~utapsia) fue positivo por Peptococcus sp. También fueron positivos dos LCR, uno' con Bacteroides sp. y otro con Peptococcus sp. Se cultivó un Prop;on;bacterium avidum en un líquido peritoneal de un niño con diálisis peritoneal contim.la. DISCUSION Para un buen trabajo en bacteriología de anaerobios se deben cumplir 7 puntos: a) Una adecuada toma de muestra, usando la más estricta técnica de as~psia, para evitar aislar anaerobios de la flora normal, no involucrados en la infección. b) Proteger las muestras del aire, transportarlas y cultivarlas lo antes posible, sin usar medio de transporte. No refrigerar. e) Usar medios líquidos PRAS, preparados adecuadamente, con buena regulación del ph, reforzados, y bien reducidos (10). Usarlos bajo un flujo continuo de gas libre de 02' d) Usar medios sólidos en forma simultánea incubados en anaerobiosis (5,6). e) Tinción de G ram a todas las muestras originales, con dibujo de cada una de las formas bacterianas observadas. f) Identificar los aislamientos usando: 1) un adecuado número de pruebas bioquímicas y físicas. 2) apropiados criterios taxonómicos y tablas d,e clasificación de reconocido prestigio. Hay tres formas de procesar los cultivos por anaerobios: usando jarras enaeróbicas, con medios pre-reducidos PRAS o con la cámara anaeróbica. LO$ tres métodos son efectivos y cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas. Las jarras anaeróbicas son de fácil manejo, barato si se usa reemplazamiento gaseoso y pueden crecer la mayor parte de los anaerobios. La cámara anaeróbica es la más efectiva, pero es cara y voluminosa, s,,", ventaja está en la facilidad para trabajar y en la conservación de los medios (11). Este es el único método que da resultados confiables para la prueba de sensibilidad antimicrobiana. Los medios pre-reducidos son muy efectivos, baratos, ocupan poco. espacio y ' son fáciles de revisar. El equipo que se requiere es un dispositivo para pasar el gas (araña) y tanques de CO 2 y de N 2 libres de 02 (10). Este reporte es la recopilación de un año de trabajo rutinario CQn anaerobios. Concientes de la importancia de estos gérmenes para la pediatría y la med ~ine costarricense lo damos a conocer con el fin de discutir algunos aspectos del tema.
6 r.. EvISTA MEOICA HOSPITAL NACIONAL DE NIKlOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA Creemos necesario hacer conciencia en todo el personal ligado a la salud, de que deben tomar en cuenta los signos clínicos V los hallazgos de laboratorio que indiquen una posible infección por anaerobios, para una atención más rápida V adecuada de este problema. RESUMEN Se presenta la experiencia de un año de trabajo en bacteriología de anaerobios. Se procesaron 257 muestras en las que se aislaron 169 diferentes anaerobios, para un porcentaje de positividad de 48,4%. Se discuten aspectos relacionados COn el aislamiento e identificación de anaerobios, así como pautas clínicas y de laborato rio que pueden ayudar a la detección de un problema por este tipo de bacterias. SUMMARY We report one vear of experience in the isolation of anaerobic bacteria at the National Children's Hospital of Costa Rica. We work with 257 samples from wich we isolate 169 different anaerobic bacteria strains (48,4(1,.). We discuss several aspects related with the isolations and clasification of anaerobes and we emphasize in the laboratory techniques and colection of samples wich must be consider in this kind of bacteriological work. 31BLlOGRAFIA 1. Allen S. & J. Siders.: Procedures for isolation and characterization of anaero bic bacteria. In: lenntte E. Balovws A. Hausler W. J. & Truant J. P. Eds. Manual Of Clinical Microbiology. 3th Ed. Washingtoll, D. C. American Societv for MicrobiologV, p. 397, 1980. 2. Brook 1.: Anaerobic bacteria in pediatric infections. Currents Problems in Pediatrics 11 :2, 1980. 3. Brook l.: Bacteriologyofchronicotitismedia. JAMA. 241: 487, 1979. 4. Brook 1. et al.: Aerobic and anaerobic bacteriology of acute otitis media in children. J. Pediat. 92:13,1978. 5. Dowell V. & lombard G.: Presumptive identifícation of anaerobic nonsporeforming Gram negative bacilli. Center for Disease Control Atlanta, Georgia. 30333,1977. 6. Dowell V. & Hawkins T.: laboratory Methods in Anaerobic Bacteriology CDC laboratory Manual. Atlanta, Georgia, 30333, p. 96, 1977 7. Finegold S.: Anaerobic Bacteria in Human Disp.aSl~ Academic Press, New York, 1977_
Herrera, M. & Gucvara. J.: BACTERIOLOGIA DE ANAEROBIOS 7 8. Finegold S. & D. Citron.: Gram Negative nonsporeforming bacilli. In: lennette E. Balows A. Hausler, W. J. Truant J. P. Eds. Manual of Clinical Microbiology. 3th Ed. Washington D. C., American Society for Microbiology pp. 431-439, 1980. 9. George W. et al.: Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile J. Clin. Microbio!. 9: 214, 1979. 10. Holdeman V. et al.: Anaerobe Laboratorv Manual. 4th edic. Virginia PolVO. technical Institute and State Universitv, Blacksburg Virginia, 1977. 11. Jones J. et al.: Use of Flexibe Anaerobe Globe Box. Center for Disease Control. Atlanta, Georgia. 30333 pp: 29, 1977. 12. Lombard G.: Gas 'iquid chromatography. Center for Disease Control. Atlanta, Georgia. 30333, p. 7, 1977. 13. Lombard G.: Characteristic of Anaerobic Sacteria. Center for Disease Control. Atlanta, Georgia. 30333, p. 13, 1977. 14. Lombard G. & Dowell V.: Quality Control in Anaerobic Bacteriology. Center for Disease Control. Atlanta, Georgia. 30333, p. 12, 1977. 15. MacFaddin J.: Biochemical Test for Identification nf Medical Ba~eria Second Edition. Williams and Wilkins, 1980. 16. Rosemblatt J.: Anaerobic Cocó. In: Lennette, E. Balows, A. Hausler, W. J. Truant. J.P. eds. Manual ot Clinical Microbiology. 3th edic. Washington, D. C., American Socíety for Microbiology, pp. 426 430,1980. 17. Smith D. & Dowell V.: Clostridium In: Lennette, E. Balows, A. Hausler, W. J. & Truant. J. P. eds Manual of Clinical Microbiology. 3th edic. Washington, D. C. American Society for Microbiology, pp. 418-425, 1980. 18. Sonnervirth A. & Dowell V.: Gram positive, nonsporeforming Anaerobic BacilIi. In: Lennette E, Balows A. Hausler W. J. jr., Truat, J. P. eds. Manualof Clinical Microbiology. 3th edic., Washington, D. C., American Society for Mícrobiology. pp. 440-445,1980. 19. Trevor A. Anaerobic Baeteriology: Clinical and Laboratory Practice. 3th edic. Butterworth London, 1977. 20. Whaley D. & Gorman G.: An inexpensive device for evacuationand Gassing Anaerobic System with in-house vacum. J. Clin. Microbiol, 5: 668, 1977.