1 PRACTICA Nº 5 DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMETRICAS EN ALIMENTOS. Carotenoides totales y nitritos. I. INTRODUCCIÓN: En espectrofotometría se usa como fuente luminosa la luz blanca natural o artificial (espectro continuo entre el rojo y el ultra violeta). Las mediciones se realizan por medio de un espectrofotómetro. La ventaja principal de los métodos espectrofotométricos consiste en que se pueda determinar con mayor exactitud y de una manera simple, trazas de sustancias en cuyo caso los procedimientos gravimétricos y volumétricos darían errores relativamente mayores puesto que las cantidades absolutas de las sustancias que se van a determinar son demasiado pequeñas. Por lo tanto, el método espectrofotométrico es especialmente adecuado para la determinación de micro y semimicro cantidades de componentes. En caso contrario se prefieren los procedimientos gravimétricos y volumétricos, por cuanto son más exactos. Se debe tener muy presente que aún en los casos más favorables, la espectrofotometría común no da una exactitud mayor del 1%, aproximadamente. II. PIGMENTOS NATURALES: CAROTENOIDES TOTALES. A. Fundamento: El método se fundamenta en la medición de la absorbancia de un extracto de los carotenoides presentes en el alimento y luego mediante el uso de una curva de calibración o la aplicación contenido de carotenoides en la muestra. 1% E 1cm se calcula el B. Reactivos: 1. Éter de petróleo 2. Sulfato de sodio anhidro (Na 2 SO 4 ) 3. Solución concentrada de beta-caroteno en alcohol isopropilico/ 24
2 cloroformo (25:75) (80mg/ ml). 4. Solución diluida de beta-caroteno (10 ml de solución concentrada + éter de petróleo en cantidad suficiente para 100 ml) 4. Acetona. NOTA: RECUERDE QUE DURANTE LA PRACTICA SE TRABAJA CON SOLVENTES VOLATILES MUY INFLAMABLES Y QUE POR LO TANTO NO DEBE FUMAR, NI ENCENDER MECHEROS, ETC. C. PROCEDIMIENTO: 1. Curva patrón: Tomar 5 tubos de ensayo y enumerar del 1 al 5. Colocar en cada uno de ellos las cantidades de reactivos que se especifican a continuación: Tubo Nº 1 2 3 4 5 ml de solución diluida de 0 2 4 6 8 beta- caroteno ml de solvente puro 10 8 6 4 2 (éter de petróleo) Agitar con cuidado los tubos y determinar la absorbancia de cada solución a la longitud de onda máxima. Construir la curva de calibración trazando un grafico de la absorbancia correspondiente contra la concentración de betacaroteno contenida en cada una de las soluciones patrón. 2. Determinación del contenido de carotenoides totales en el alimento: 1. Pesar aproximadamente 1g de muestra fresca de zanahoria previamente pelada y cortada en trozos pequeños. 2. Homogenizar en una licuadora con 60 ml de acetona por unos 3 minutos. 3. Decantar y agregar más acetona para realizar una extracción. Repetir el proceso hasta extraer completamente los pigmentos. 25
4. 3 Filtrar y lavar el residuo que queda en el papel de filtro con unos 20-30 ml de acetona. 5. Concentrar en campana con un baño de María (o en plancha eléctrica) hasta pequeño volumen. 6. Agregar 60 ml de éter de petróleo. 7. A la solución etérea que contiene los carotenoides agregar una pequeña cantidad de Na 2 SO 4 anhidro. Dejar la solución con el agente desecante unos 15 minutos, agitar ocasionalmente. 8. Transferir cuantitativamente la solución etérea a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con éter de petróleo. 9. Tomar con una pipeta 2 ml de esta solución ( o un volumen que pueda medirse la intensidad de color) y transferir a un tubo. 10. Agregar 8 ml de éter de petróleo y medir la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción encontrada previamente. D. Cálculos: 1. Determinar por medio de la curva estándar la cantidad de carotenoides totales presentes en la muestra. Expresarlos como mg de beta-carotenos/100 g de muestra. 2. Calcular la cantidad de carotenoides totales expresados como beta-caroteno utilizando la constante 3. Comparar ambos resultados. 1% E 1cm I. COMPUESTOS NO COLOREADOS: NITRITOS A. Fundamento: Cuando se hacen reaccionar soluciones de ácido sulfanílico y alfanaftilamina en ácido acético diluido con ácido nitroso, se produce una coloración roja. El ácido sulfanilico se transforma en el diazo compuesto correspondiente que se copula con la alfa-naftilamina- 26
4 pazobenceno-p-sulfonico, azocolorante rojo. B. Reactivos: 1. Reactivo de Greiss (modificado) Disolver 0,5 g de ácido sulfanilico en 150 ml de ácido acético al 15 % (V/V). Hervir 0,1 g de alfa-naftilamina o 0,125 g de clorhidrato en 20 ml de agua hasta disolver; agregar, en caliente, a 150 ml de ácido acético al 15 % (V/V). Mezclar las dos soluciones. Filtrar si es necesario y guardar en frasco ambar. 2. Solución estándar de nitrito de sodio (1 mg / ml) 3. Solución de ferrocianuro de potasio (10 %) 4. Acetato de zinc dihidratado (22 %) 5. Solución de Bórax decahidratado C. Procedimiento: 1. Curva patrón. 1. Diluir volúmenes adecuados de la solución estándar de nitrito en matraces aforados de 50 ml. 2. Añadir 2 ml de reactivo de Greiss. 3. Dejar desarrollar color por 15-20 minutos. 4. Leer a 520 nm y llevar a un grafico los valores de Absorbancia vs. concentración de cada una de las soluciones patrones. Concentración de los estándares: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5 ppm. 2. Determinación de nitritos en carnes curadas. 1. Pesar 5 g de carme finamente homogenizada en un vidrio de reloj. 2. Pasarlos a un vaso precipitado de 250 ml con 150 ml de agua aproximadamente. 3. Añadir 5 ml de bórax. 4. Colocar en baño de Maria durante 45 minutos. Agitar 27
5 ocasionalmente 5. Transferir cuantitativamente a un balón aforado de 250 ml 6. Añadir 2,5 ml de solución de ferrocianuro y 2,5 ml de acetato de zinc, mezclar. 7. Enfriar a temperatura ambiente, llevar a volumen con agua y mezclar cuidadosamente. 8. Filtrar 9. Medir una alícuota de 25 ml (o un volumen que permita medir la intensidad de color desarrollado) en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen. 10. Mezclar y dejar desarrollar color por 15-20 minutos 11. Leer a 520 nm la absorbancia (A) de la solución contra un blanco preparado añadiendo 2 ml de reactivo de Greiss a 50 ml de agua. NOTA: EL AGUA A USAR EN ESTAS DETERMINACIONES DEBE ESTAR LIBRE DE NITRITOS. 3. Cálculos: Calcular el contenido de nitritos presentes en la muestra por medio de la curva estándar. Reportar como ppm. Comparar el resultado obtenido con valores reportados en libros de análisis o Norma Venezolana COVENIN. 28