ALT/GPT LIQUIFORM VET Ref.:1008 Finalidad. Sistema para la determinación de la Alanina Amino Transferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico Pirúvica (GPT) de modo cinético. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] Principio. La ALT cataliza específicamente la transferencia del grupo amino del la alanina para el cetoglutarato, con formación de glutamato y piruvato. El piruvato se reduce a lactato por acción de la lactato deshidrogenasa (LDH), en tanto que la coenzima ADH se oxida a AD. La reducción de la absorbancia a 3 nm, resultante de la oxidación de la coenzima ADH, se monitorea fotométricamente, siendo directamente proporcional a la actividad de la ALT en la muestra. L-Alanina + Cetoglutarato Piruvato + ADH ALT LDH Características del sistema. Piruvato + L-Glutamato AD + L-Lactato La metodología cinética-uv para 1 la medición de la actividad de la ALT fue introducida por Karmen, siendo posteriormente optimizada por Henry y colaboradores y el procedimiento de medición ganó aceptación mundial por ser rápido, preciso y exacto. El método de referencia propuesto por la International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) 3 recomienda la utilización del piridoxal fosfato para asegurar que toda la transferasa presente en el suero esté totalmente activa, evitando así, resultados falsamente disminuidos en muestras con deficiencia de la coenzima. El sistema Labtest está optimizado para satisfacer esas recomendaciones. Para obtener resultados rastreables al método de referencia IFCC, es necesario utilizar el procedimiento bi-reactivo con la activación por el piridoxal fosfato (Reactivo 3). Cuando se aplica el procedimiento monoreactivo no se utiliza la activación con piridoxal fosfato. Por lo tanto, los resultados obtenidos no son rastreables al método de referencia de la IFCC. Los componentes de la reacción se encuentran distribuidos adecuadamente en tres reactivos para otorgar mayor estabilidad en la forma líquida original y mantenimiento de las condiciones óptimas de la reacción. El sistema ALT/GPT VET de Labtest utiliza mediciones en modo cinético y puede ser fácilmente aplicado a analizadores automáticos y semiautomáticos capaces de medir absorbancias a 3 nm Metodología. Reactivos REACTIVO 1 - REACTIVO. - REACTIVO 3 - Material necesario y no provisto. Cinética UV-IFCC. Reactivo 1 - Almacenar entre - 8 C. Contiene Tampón Tris 13,5 mmol/l; L-alanina 687,5 mmol/l; LDH 300 U/L y azida sódica 0,095%. Reactivo - Almacenar entre - 8 ºC. Contiene Tampón Tris mmol/l; ADH 13 µ mol/l, cetoglutarato 8,5 mmol/l y azida sódica 0,095%. Reactivo 3 - Almacenar entre - 8 ºC. Contiene Tris mmol/l, piridoxal fosfato 11,1 mmol/l, azida sódica 0,095%. Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en el rótulo. Después de abiertos, los reactivos deben ser manipulados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de la estabilidad. Precauciones y cuidados especiales Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación de los reactivos. o utilizar los reactivos cuando la absorbancia del reactivo de trabajo o de la mezcla Reactivo 1, Reactivo y Reactivo 3, medida contra agua a 3 nm, fuera menor a 1,0 o cuando los reactivos estuvieran turbios o con señales de contaminación. En los analizadores automáticos, los reactivos están sujetos a contaminaciones con otros reactivos o con el aire ambiente, dependiendo de las características del equipo y de las condiciones de trabajo. Estas contaminaciones pueden provocar reducción de la estabilidad de los reactivos o modificaciones en su desempeño, requiriendo una nueva calibración del sistema. Como ocurre en toda medición de la actividad enzimática, la rigurosa observancia del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Los reactivos contienen azida sódica que es tóxica. o ingerir y, en el caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las cañerías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilizar grandes volúmenes de agua para descartar los reactivos. Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud absorbancias a 3 nm. Pipetas para medir muestras y reactivos. Cronómetro.
Influencias pre analíticas. La concentración de ALT en los hepatocitos de equinos y rumiantes es baja; consecuentemente, la actividad sérica de ALT en estas especies no es útil para la detección de enfermedad hepática. Esteroides anabólicos, medicamentos anticonvulsivos, cloranfenicol, clorotiazida, gentamicina y otras drogas pueden causar aumento en la actividad de la ALT. Muestra Se debe crear un Procedimiento Operativo Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para la recolección, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Usar suero o plasma (EDTA, Heparina). La actividad enzimática permanece estable durante 4 días entre - 8 ºC y semanas a 10 ºC negativos. Como ningún test conocido puede asegurar que las muestras de sangre no transmitan infecciones, todas ellas deben ser consideradas como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas, se deben seguir las normas establecidas para la bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias Valores de Bilirrubina hasta 19 mg/dl, Hemoglobina hasta 180 mg/dl, Triglicéridos hasta 650 mg/dl no producen interferencias significativas. Para evaluar la concentración aproximada de hemoglobina en una muestra hemolizada se puede proceder del siguiente modo: Diluir 0,05 ml de la muestra en,0 ml de acl 150 mmol/l (0,85%) y medir la absorbancia a 5 ó 415 nm ajustando el cero con agua desionizada o destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia 5 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbancia x 467 Las muestras fuertemente lipémicas y ictéricas poseen absorbancia elevada a 3 nm. Cuando la actividad enzimática en estas muestras está muy aumentada, puede darse un consumo bastante rápido del sustrato sin haber disminución significativa en la absorbancia. Por lo tanto, si se obtuvieran valores bajos de actividad enzimática en estas muestras se debe repetir la determinación utilizando la muestra diluida con acl 0,85%. Procedimiento Ver los ítems Cálculo, Calibración, Linealidad y Observaciones. Determinación de la actividad enzimática utilizando el piridoxal fosfato Para obtener resultados rastreables al método de referencia IFCC, es necesario utilizar el procedimiento bi-reactivo, para que la enzima sea totalmente activada por el piridoxal fosfato. 415 Preparación del reactivo. Transferir 0,300 ml del Reactivo 3 a un frasco de Reactivo 1 (4 ml) y homogeneizar suavemente. Estabilidad: 1 días entre - 8 ºC y 4 horas entre 15-5 ºC cuando no hubiera contaminación química o microbiana. Anotar la fecha de expiración. Opcionalmente se puede preparar un volumen menor de la mezcla (Reactivo 1 + Reactivo 3) adicionando 1 parte del Reactivo 3 a 80 partes del Reactivo 1 (ejemplo: adicionar 0,010 ml del Reactivo 3 a 0,800 ml del Reactivo 1). Procedimiento de la muestra En un tubo rotulado Muestra o Calibrador, pipetear 0,800 ml de la mezcla Reactivo 1 + Reactivo. Adicionar 0,100 ml de muestra o de calibrador de enzimas, homogeneizar y incubar en baño- María a 37 ± 0, ºC por 5 minutos. Después de esta incubación, se puede esperar hasta 30 minutos para iniciar la medición cinética con la adición del Reactivo. Ajustar el cero del fotómetro a 3 nm con agua destilada o desionizada. 4. Adicionar 0,0 ml del Reactivo, homogeneizar y transferir inmediatamente a una cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC. Esperar 1 minuto. 5. Registrar la absorbancia inicial (A 1) y disparar simultáneamente el cronómetro. Después de minutos registrar la absorbancia (A ). Para verificar la linealidad de la reacción, registrar la absorbancia a intervalos de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia por minuto es equivalente. Determinación de la actividad enzimática sin la utilización del piridoxal fosfato Preparación del reactivo de trabajo. Transferir el contenido de un frasco de Reactivo a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar suavemente. El reactivo de trabajo es estable 14 días entre - 8 ºC y 4 horas entre 15-5 ºC cuando no hubiera contaminación química o microbiana. Anotar la fecha de expiración. Opcionalmente se puede preparar un volumen menor de reactivo de trabajo mezclando 1 parte de Reactivo con 4 partes de Reactivo 1 (ejemplo: mezclar 0,0 ml de Reactivo y 0,800 ml de Reactivo 1). Para preservar el desempeño, los reactivos deben permanecer fuera de la temperatura de almacenamiento solamente el tiempo necesario para obtener el volumen a utilizar. Evitar la exposición a la luz solar directa. Procedimiento de la muestra En un tubo rotulado Muestra o Calibrador, pipetear 1,0 ml del reactivo de trabajo.. Ajustar el cero del fotómetro a 3 nm con agua destilada o desionizada. Adicionar 0,100 ml de muestra o calibrador de enzimas, homogeneizar y transferir inmediatamente a una cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC. Esperar 1 minuto.
4. Registrar la absorbancia inicial (A 1) y disparar simultáneamente el cronómetro. Después de minutos registrar la absorbancia (A ). Para verificar la linealidad de la reacción, registrar la absorbancia a intervalos de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia por minuto es equivalente. Una absorbancia inicial (A 1) igual o menor a 0,8 es indicativa de que la muestra tiene actividad elevada de ALT. En este caso, diluir la muestra y repetir la medición (ver linealidad). Como ocurre en toda medición de la actividad enzimática, la rigurosa observancia del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos. Los procedimientos sugeridos son adecuados para fotómetros cuyo volumen mínimo de reacción de medición es igual o menor a 1,0 ml. Debe verificarse la necesidad de ajuste de volumen según el fotómetro utilizado. Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados proporcionalmente sin perjuicio del desempeño del ensayo y el procedimiento de cálculo se mantiene inalterado. En caso de reducción de los volúmenes es fundamental que se observe el volumen mínimo necesario para la medición fotométrica. Volúmenes de muestra menores a 0,010 ml son críticos en aplicaciones manuales y deben ser usados con cautela porque aumentan la imprecisión de la medición. Cálculos. Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción las que incluyen: Longitud de onda: 3 nm Cubeta termostatizada a 37 ± 0, ºC con 1,0 cm de espesor de solución. Ancho medio de banda nm. Luz espuria 0,1 %. Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda el Calibra VET para calibración del sistema ALT/GPT Liquiform VET. A/minuto Muestra o Calibrador = (A - A )/ Factor = Ejemplo Actividad del Calibrador A/min Calibrador ALT = A/min Muestra x Factor Muestra A = 1,95 A = 1,851 1 1,95-1,851 A/min Muestra = = 0,037 Calibrador A = 1,875 A = 1,733 1 1 1,875-1,733 A/min Calibrador = = 0,071 Actividad del Calibrador = 15 15 Factor = = 1761 0,071 Actividade de la ALT = 0,037 x 1761 = 65 Cuando las condiciones óptimas de reacción citadas anteriormente son tenidas en consideración, se puede optar por la utilización del factor 1746. Calibración Calibraciones manuales Usar calibradores de la línea Calibra VET - Labtest que tienen actividades de la ALT rastreables al material de referencia ERM-AD454/IFCC y al 3 método de referencia de la IFCC. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 puntos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Sistemas automáticos Blanco de reactivos: agua desionizada o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%); Usar calibradores de la línea Calibra VET - Labtest que tienen actividades de la ALT rastreables al material de referencia ERM-AD454/IFCC y al 3 método de referencia de la IFCC. Intervalo de calibraciones Calibración en ó 3 puntos al cambiar de lote; Calibración en ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Linealidad El resultado de la medición es lineal entre 3,5 y 0 U/L. Para valores mayores, diluir la muestra con acl 150 mmol/l (0,85%). Realizar una nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Deben utilizarse materiales de control para monitorear la imprecisión de la medición y los desvíos de la calibración. Se sugiere que las especificaciones del coeficiente de variación y del error total sean basados en los componentes de la 4,5,6 variación biológica (VB). Intervalo de referencia. Se debe utilizar los intervalos únicamente como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca, su propio rango de valores de referencia en la población de animales atendida.
Especie (UI/L) Canina 10 a 88 Felina 10 a 88 Equina 3 a 3 8 Características de desempeño Estudios de recuperación. A dos muestras con concentraciones de alanina amino transferasa iguales a 100 y 7 U/L le fueron adicionadas cantidades medidas de la enzima, obteniéndose los siguientes resultados: Actividad Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias) estimado es igual a,6% para un nivel de decisión igual a 80 U/L y 3,7% para un nivel de decisión igual a 8 U/L. Estos errores son menores que el error sistemático analítico de la especificación óptima basada en la variación biológica que es ± 6,0%. Estudios de precisión. Los estudios de precisión fueron realizados en el sistema Labtest/Labmax, utilizando muestras con valores de actividad iguales a 89 y 7 U/L para el procedimiento con piridoxal fosfato y 80 y 8 U/L para el procedimiento sin piridoxal fosfato. Ensayos realizados con piridoxal fosfato Inicial 100 7 Adicionada Esperada Encontrada 41 141 1 41 68 75 Recuperación (%) 99, 10,6 Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra 89 7 1,43,61 1,6 1,0 El error sistemático proporcional medio estimado es igual a 0,7 U/L para el nivel de decisión 80 U/L y,5 U/L para el nivel de decisión 81 U/L. Reproducibilidad - imprecisión total Estudios de comparación de métodos. El método propuesto 3 fue comparado con el método de referencia de la IFCC, obteniéndose los siguientes resultados: Muestra 89 7,31 7,,6,7 Ensayos realizados con piridoxal fosfato úmero de muestras Intervalo de concentraciones de las estimativas Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Comparativo 8, - 56, 10,4 Labtest 8,0-6,7 105,5 Labtest = 1,036 x Comparativo - 0,589 0,999 Ensayos realizados sin piridoxal fosfato Repetitividad - imprecisión intra-ensayo Muestra Muestra 80 8 Reproducibilidad - imprecisión total 80 8 1,,19 1, 3,31 1,5 0,8 1,8 1, Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias) estimado es igual a,9% para un nivel de decisión igual a 89 U/L y 3,3% para un nivel de decisión igual a 7 U/L. Estos errores son menores que el error sistemático analítico de la especificación óptima basada en la variación biológica que es ± 6,0%. Ensayos realizados sin piridoxal fosfato úmero de muestras Intervalo de concentraciones de las estimativas Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Comparativo 8, - 56, 10,4 Labtest 10,8-43,3 99,4 Labtest = 0,958 x Comparativo - 1,84 0,998 La imprecisión total obtenida en las muestras satisface la especificación óptima para la imprecisión total basada en la variación biológica que es 6,1%. Estimativa del error total. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado para el valor de 89 U/L es igual a 7,% y para el valor de 7 U/L es igual a 7,8% en los ensayos realizados con piridoxal fosfato. Para los ensayos realizados sin piridoxal fosfato el error total estimado para el valor de 80 U/L es igual a 5,5% y para el valor de 8 U/L es igual a 5,7%. Los resultados indican que el método satisface la especificación óptima para el error total ( 16%) basada en los componentes de la Variación Biológica (VB). Sensibilidad metodológica. Utilizándose como parámetro la absorbancia mínima detectable, la sensibilidad fotométrica es de 1,75 U/L, correspondiendo a una absorbancia igual a 0,00
Efectos de la dilución de la matriz. Dos muestras con valores iguales a 8 y 459 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con acl 150 mmol/l (0,85%). Usando factores de dilución que variaron de a 16 fue encontrada una recuperación media 100,3%. 10,11 Significado clínico. En perros y gatos la ALT es predominantemente específica para lesión celular hepática. Sin embargo, la ALT también puede estar aumentada en situaciones de lesión muscular grave como rabdomiólisis, trombosis ilíaca en gatos, sin que exista lesión hepática aparente. En estas situaciones, se recomienda la medición concomitante de creatino quinasa (CK). Se puede observar aumentos discretos a moderados de ALT en gatos con hipertiroidismo y perros con hiperadrenocorticismo. Diversas enfermedades hepáticas o cualquiera que cause lesión de hepatocitos, puede aumentar la actividad sérica de la ALT. Entre los factores más comunes encuéntranse: hipoxia, toxinas bacterianas, inflamación, hepatitis canina, virus y otras afecciones virales, neoplasia hepática, glicocorticoides y diversas drogas y medicamentos. La ALT también puede estar aumentada en la fase de reparación de enfermedades hepáticas debido a la regeneración activa de hepatocitos. Es posible que en algunos perros y gatos con una importante enfermedad hepática presenten la actividad sérica de ALT normal o discretamente aumentada. En estas situaciones, entiéndese que la masa hepática puede estar considerablemente disminuida y la cantidad de hepatocitos remanentes es insuficiente para causar un aumento en la actividad de la enzima. En grandes animales, la ALT es una enzima muscular y, en la clínica, no posee valor diagnóstico en estas especies. Observaciones La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.. El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones, debe tener resistividad 1 megaohm o conductividad 1 microsiemens y concentración de silicatos <0,1 mg/l (agua tipo II). Para el enjuague del material de vidrio el agua puede ser del tipo III, con resistividad 0,1 megaohms o conductividad 10 microsiemens. En el enjuague final, utilizar agua tipo II. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y substancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por ello es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar http:/www.fxol.org. Referencias Karmen A. J Clin Invest 1955; 34:13. Henry RJ, Chiamori, Golub O, Berkman S. Amer J Clin Path 1960; 34:38 IFCC Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alanine Aminotransferase. Clin Chem Lab Med 0; (7):718-4. 4. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponible en: <http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acceso desde 04/06). 5. http://www.westgard.com/biodatabasehtm (acceso desde 03/08). 6. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981; 7:493-50 7. Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC. Pediatric Reference Intervals, 5.ed. Washington: AACC Press, 05. p. 3-4. 8. Labtest: Datos de archivo. 9. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry,.ed., Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1994. p. 788-96. 10. Kerr MG. Exámenes Laboratoriales en Medicina Veterinaria, Bioquímica Clínica y Hematología. Roca. 0 1 Thrall MA, et al. Hematología y Bioquímica Clínica Veterinaria. Roca. 07. Presentación Producto Referencia Contenido ALT/GPT Liquiform Vet 1008-4/30 1008-/100 Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] REACTIVO 1 REACTIVO REACTIVO 3 REACTIVO 1 REACTIVO REACTIVO 3 4 X 4 ml 4 X 6 ml 1 X 1,5 ml X 80 ml X ml 1 X, ml Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto dentro de las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente.
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