DiaSorin S.p.A. Via Crescentino snc - 13040 Saluggia (VC) - Italy Tel. +39.0161.487.093 Fax +39.0161.487.628 Exclusivamente para uso profesional! Modificaciones: 10, 13 Supresiones: LIAISON Cortisol (REF 313261) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO Ensayo in vitro para la determinación cuantitativa de cortisol en suero y plasma (y orina) humanos. La prueba debe realizarse con el analizador LIAISON. 2. SUMARIO Y EXPLICACIÓN DEL TEST El cortisol es el glucocorticoide más potente producido por las glándulas suprarrenales humanas. Se sintetiza a partir del colesterol, y su producción es estimulada por la corticotropina (ACTH) hipofisaria, que a su vez es regulada por la corticoliberina (CRF). La secreción de ACTH y CRF se ve inhibida por niveles elevados de cortisol, en un bucle de retroalimentación negativa. En la sangre, la mayor parte del cortisol está ligado con una afinidad alta a la transcortina o globulina transportadora de corticoesteroides (CBG). El cortisol actúa a través de receptores intracelulares específicos, y afecta a numerosos sistemas fisiológicos, entre ellos la función inmunitaria, la contrarregulación de la glucosa, el tono vascular y el metabolismo óseo (4,5). El nivel de cortisol en el torrente sanguíneo presenta lo que se conoce como ritmo circadiano o variación diurna, por lo que las concentraciones normales de cortisol varían a lo largo de un periodo de 24 horas. En individuos normales, los niveles de cortisol son máximos a primera hora de la mañana, aproximadamente de 6 a 8, y mínimos en torno a la medianoche. El factor que controla este ritmo no está totalmente definido, y puede verse alterado por una serie de trastornos físicos y psicológicos. La ACTH y el cortisol se segregan de forma independiente del ritmo circadiano en respuesta al estrés físico y psicológico (8). Los niveles elevados de cortisol y la ausencia de variación diurna se han asociado a la enfermedad de Cushing (hipersecreción de ACTH). También se han identificado niveles elevados de cortisol circulante en pacientes con tumores suprarrenales (2,9). Existen niveles reducidos de cortisol en caso de insuficiencia suprarrenal primaria (p.ej. hipoplasia suprarrenal, enfermedad de Addison) y de deficiencia de ACTH (6). Debido a la variación circadiana normal en los niveles de cortisol, puede resultar difícil distinguir entre niveles de cortisol normales y anormalmente bajos, por lo que se recomienda recoger varias muestras a lo largo del día. Las pruebas de estrés adicionales como la estimulación con ACTH o la supresión con dexametasona ayudan a diagnosticar las enfermedades que afectan a las glándulas suprarrenales. La medición de los niveles de cortisol en orina es útil en el diagnóstico del síndrome de Cushing. Para esta prueba se recoge orina durante un periodo de 24 horas y se analiza (1,3,7). 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El método para la determinación cuantitativa de cortisol está basado en el principio SPALT (técnica de luminiscencia con antígenos en fase sólida). Las partículas magnéticas (fase sólida) están recubiertas con un conjugado de proteína cortisol; un anticuerpo monoclonal está ligado a un derivado de isoluminol (conjugado de isoluminol-anticuerpo). Durante la incubación, la cortisol compite con el conjugado de proteína cortisol por los sitios de ligado del anticuerpo marcado. Después de la incubación, se elimina el material no enlazado mediante un ciclo de lavado. A continuación, se añaden los reactivos starter que inducen una reacción de quimioluminiscencia. La señal luminosa, y por lo tanto la cantidad de conjugado anticuerpo-isoluminol, se mide con un fotomultiplicador en unidades relativas de luz (RLU, relative light units) e indica la concentración de Cortisol presente en los calibradores, en las muestras o en los controles. 4. MATERIALES SUMINISTRADOS El orden de los reactivos refleja el orden con el que se han ensamblado los contenedores en el integral de reactivos. Cartucho integral de reactivos para 100 determinaciones 2,3 ml Suspensión de partículas magnéticas: partículas magnéticas, revestidas con conjugado de cortisol 1,0 ml Calibrador, nivel bajo 1,0 ml Calibrador, nivel alto 7,0 ml Conjugado:anti-cortisol conjugado, marcado con isoluminol 23 ml Tampón para el ensayo Todos los reactivos se suministran listos para usar. Materiales requeridos, pero no suministrados Otros materiales requeridos LIAISON Module (REF 319130) LIAISON Endocrinology Diluent (REF 319133) LIAISON Starter Kit (REF 319102) LIAISON Cleaning Kit (REF 310990) LIAISON Light Check (REF 319101) LIAISON Wash/System Liquid (REF 319100) LIAISON Waste Bags (REF 450003) 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Sólo para uso diagnóstico in vitro. Todos los materiales utilizados para la fabricación de los componentes de este kit se han analizado y se han encontrado no reactivos para la presencia de HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 y anti-hiv-2. Sin embargo, visto que ningún método de análisis puede asegurar que los agentes patógenos estén ausentes, todo el material de origen humano se deberá considerar potencialmente infeccioso y manipularlo como tal.
6. NORMAS DE SEGURIDAD No coma, beba, fume o se maquille durante la ejecución del ensayo. No pipetee las soluciones con la boca. Evite el contacto directo con el material potencialmente infeccioso usando batas de laboratorio, gafas de protección y guantes desechables. Lávese cuidadosamente las manos al terminar el ensayo. Evite salpicaduras o formación de aerosoles. En caso de que esto sucediera, cada gota de reactivo se debe eliminar con una solución de hipoclorito sódico al 5% y el medio utilizado se deberá tratar como material residuo potencialmente infeccioso.todas las muestras, los reactivos biológicos del kit y los materiales usados para efectuar el ensayo se deben considerar capaces de transmitir agentes infecciosos; por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. 7. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS INTEGRAL DE REACTIVOS Antes de quitar la protección de los contenedores, es esencial agitar horizontalmente el integral de reactivos con delicadeza y sumo cuidado. Evite la formación de espuma. Retire por completo el precinto de cada envase y gire a un lado y a otro la ruedecilla situada en la base del envase de partículas magnéticas hasta que la suspensión adquiera un color marrón. Este procedimiento da inicio a la resuspensión de las partículas magnéticas. Seque con sumo cuidado la superficie de cada pared para eliminar el líquido residual. Coloque el integral de reactivos en el área de los reactivos del instrumento con la etiqueta de los códigos de barras situada a la izquierda y déjelo agitar durante 30 minutos antes del uso. Durante este tiempo las partículas magnéticas serán mantenidas en agitación automáticamente para garantizar una resuspensión completa. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para cargar las muestras e iniciar el ensayo. 8. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS INTEGRAL DE REACTIVOS - Sellado: Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. - Abierto a borde del instrumento o a 2-8 C: Estabilidad mínima 2 semanas. Después de este intervalo de tiempo, se puede seguir usando el integral de reactivos, siempre que los controles permanezcan dentro de los límites esperados. - Use siempre el mismo instrumento LIAISON para un integral de reactivos ya abierto. - No congele. - Manténga el integral de reactivos en posición vertical durante la conservación para facilitar la resuspensión de las partículas magnéticas. - Use las gradillas suministradas con el instrumento LIAISON para la conservación del integral de reactivos en posición vertical. - Manténga protegido de la luz directa. 9. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS - Tome las muestras mediante los procedimientos habituales. - Material de las muestras: suero**, plasma** (EDTA, citratado, heparinizado), orina extraída en cloruro de metileno*. * Cada laboratorio debe seleccionar y validar un procedimiento de extracción adecuado. Deben cumplirse estrictamente las precauciones de seguridad y condiciones de conservación de las muestras de orina extraídas aplicables para el procedimiento seleccionado. LIAISON Endocrinology Diluent es adecuado para la redisolución de los residuos secos de extracción para su determinación. Cada laboratorio debe determinar los datos reales de recuperación y los intervalos normales para orina. ** Las muestras de suero y plasma con concentraciones de cortisol extremadamente elevadas deben diluirse con suero o plasma de baja concentración. La concentración de la muestra deberá calcularse teniendo en cuenta la concentración del suero o plasma de baja concentración utilizado como diluyente. - Si la prueba no se realiza el mismo día de la recogida de la muestra, el suero/plasma debe separarse del sedimento y conservarse en un tubo diferente. - Conservación a 2-8 C: 24 h. - Para periodos de almacenamiento más prolongados: congelar por debajo de -20 ºC. - Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. - Las muestras almacenadas deben agitarse bien antes de su uso (agitador Vortex). - No use muestras fuertemente hemolizadas o lipémicas, ni muestras que presenten material suspendido o evidente contaminación microbiana. - No use muestras coaguladas. - El volumen mínimo de muestra necesario para una determinación es 200 µl (50 µl de muestra + 150 µl de volumen muerto). 10. CALIBRACIÓN El análisis de los calibradores específicos para el ensayo permite ajustar a la curva maestra asignada los valores RLU detectados. Cada solución de calibración permite realizar 6 calibraciones. La recalibración por triplicado es obligatoria siempre que se dé al menos una de las siguientes situaciones: - Se usa un nuevo lote de integral de reactivos o de reactivos starter. - La calibración previa se realizó hace más de 5 días. - El instrumento ha sufrido una intervención de asistencia técnica. - Los valores de los controles están fuera de los rangos esperados. - Siempre que los cambios en la temperatura ambiente superen los 3 C. 11. PROCEDIMIENTO OPERATIVO Para obtener unas prestaciones analíticas ideales hay que respetar estrictamente las instrucciones del manual operativo del instrumento. Cada parámetro del test es identificado mediante el código de barras en la etiqueta del integral de reactivos. En caso de que el lector del código de barras no funcione correctamente, se deberán introducir manualmente los datos convenientes. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada.
El instrumento realiza las operaciones siguientes: 50 µl Muestra, calibrador o controles +180 µl Tampón para el ensayo + 50 µl Conjugado + 20 µl Tampón para el ensayo + 20 µl Partículas magnéticas recubiertas 10 min Incubación seguida por un ciclo de lavado 3 s Medición 12. CONTROL DE CALIDAD El control de calidad se debe realizar (a) por lo menos una vez por cada día de trabajo, (b) cuando se usa un nuevo integral de reactivos, (c) cuando se calibra el kit, o según las disposiciones legislativas y las reglamentaciones vigentes en cada país, (d) cuando se usa un nuevo lote de reactivos starter, (e) cuando se determina la adecuación de las prestaciones del integral de reactivos abierto con más de dos semanas de anterioridad. Atención: Los controles se deben analizar individualmente para evaluar las prestaciones del test. Los valores de los controles tienen que estar comprendidos entre los rangos esperados: cada vez que los valores estén fuera de los rangos esperados habrá que volver a efectuar la calibración y probar de nuevo los controles. Si los valores de control obtenidos después de llevar a cabo con éxito la calibración se encuentran repetidamente fuera de los intervalos predefinidos, debe repetirse la prueba utilizando un frasco de control nuevo. Si los valores de control se hallan fuera de los intervalos esperados, los resultados de los pacientes deben ser desechados. Las prestaciones de los controles se deben evaluar para asegurar su compatibilidad con este test antes del uso. Por lo tanto es indispensable establecer los intervalos de los valores de los materiales usados para el control de calidad. 13. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El instrumento calcula automáticamente las concentraciones de Cortisol de las muestras expresadas en µg/dl. Hágase referencia al manual operativo del instrumento para una información más detallada. Estandarización La prueba se ha calibrado utilizando los valores de cromatografía de gases y espectroscopía de masas proporcionados por la Sociedad Alemana de Bioquímica Clínica y Medicina de Laboratorio (DGKL) para muestras correspondientes a ensayos públicos en anillo (EQAS). Intervalo de ensayo LIAISON Cortisol mide concentraciones hasta 80 µg/dl. Factor de conversión: µg/dl Cortisol x 27,6 = nmol/l Cortisol nmol/l Cortisol x 0,0362 = µg/dl Cortisol Rango de referencia Rango de referencia Cortisol percentil 2,5-97,5 de un grupo de control de referencia Suero de la mañana (6.00-10.00) n=349 4,5-24,0 Suero de la tarde (16.00-20.00) n=12 1,8-6,5 Orina de 24 horas extraída en cloruro de metileno a determinar por cada laboratorio. n=50 12,8-82,5 µg/24 horas Cada laboratorio deberá establecer su propio rango de referencia. 14. LIMITACIONES DEL ENSAYO - Los reactivos del kit deben usarse sólo en el sistema LIAISON. - Los componentes individuales del integral de reactivos no deben ser separados del integral. - El kit no debe usarse después de la fecha de caducidad que figura en la etiqueta externa. - Para obtener resultados fiables es necesario atenerse estrictamente a las instrucciones de utilización y poseer una adecuada técnica manual. - La contaminación bacteriana de las muestras o la inactivación mediante calentamiento pueden modificar los resultados del análisis. - Las muestras obtenidas en pacientes tratados con prednisolona o prednisona pueden presentar niveles de cortisol falsamente aumentados. Por consiguiente, hay que ser cauteloso en las determinaciones de cortisol en pacientes sometidos a tratamiento con estos compuestos o con corticoesteroides sintéticos de estructura similar. - Los valores de cortisol sólo pueden por ello interpretarse en el contexto del cuadro clínico y en combinación con otros procedimientos diagnósticos. Cada decisión terapéutica debe ser tomada caso por caso. - Aunque estén presentes agentes capaces de neutralizar los anticuerpos anti-ratón (HAMA, human anti-mouse antibodies), concentraciones de HAMA extremadamente elevadas pueden quizás influir en los resultados del ensayo. - Las muestras con valores superiores al intervalo de medición pueden diluirse según lo explicado en el apartado 9. - Las muestras de los pacientes que se están sometiendo a una prueba de supresión con dexametasona (diagnóstico del síndrome de Cushing) pueden mostrar unos valores de cortisol ligeramente elevados si la prueba se ha realizado con el análisis LIAISON Cortisol.
Datos de adición y recuperación (las muestras fueron enriquecidas con concentraciones de dexametasona equivalentes a las esperadas en las muestras de suero después de una prueba de supresión con una dosis alta de dexametasona) muestra de suero muestra de suero no enriquecida Cortisol µg/dl enriquecida* Cortisol µg/dl % desviación 11,87 11,99 1,01 12,69 12,96 2,13 15,47 16,48 6,53 16,32 16,34 0,12 17,34 18,12 4,50 26,06 25,42-2,46 29,17 30,62 4,97 45,00 43,38-3,60 * enriquecida con 2,5 µg/dl de dexametasona 15. PRESTACIONES METODOLÓGICAS DEL KIT 15.1. Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad que tiene el test para detectar exactamente el analito ante la presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra (por ejemplo, hemólisis, lipemia, bilirrubinemia). Interferencias. Estudios controlados sobre los factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del test no están influenciadas por las concentraciones de bilirrubina < 0,2 mg/ml, de hemoglobina < 1000 mg/dl o de triglicéridos < 30 mg/ml. Reacciones cruzadas. Conc. % Reactividad cruzada (Intersección del 50%) Prednisolone 50 12,6 11-Deoxycortisol 50 3,0 Prednisone 500 0,4 Cortisone 500 1,4 Corticosterone 100 3,5 21-Deoxycortisol 100 9,1 21-Deoxycortisone 500 1,7 17-Hydroxyprogesterone 200 0,5 Deoxycorticosterone 250 0,7 Androstenedione 400 n.d.* d- Aldosterone 8000 0,1 5ß-Dihydrotestosterone 10000 n.d.* Cholesterine 10000 n.d.* DHEA 10000 n.d.* Estradiol 10000 n.d.* Estriol 10000 n.d.* Estrone 10000 n.d.* Progesterone 400 n.d.* Testosterone 600 n.d.* Cholesterol 10000 n.d.* *n.d. = no detectable 15.2. Precisión La repetibilidad y la reproducibilidad del ensayo (es decir las variaciones intra-ensayo e inter-ensayo) han sido determinadas utilizando muestras con diferentes concentraciones de Cortisol. Variación intraensayo Variación interensayo medio medio CV n* CV n* 2,04 4,0 20 2,04 9,2 5 14,31 2,3 20 14,31 2,7 5 45,04 3,1 20 45,04 11,6 5 *número de determinaciones 15.3. Veracidad La veracidad del ensayo ha sido controlada mediante los test de dilución y recuperación.
La tabla proporciona un ejemplo de la linealidad de dilución de un suero de paciente con un suero con título bajo. Suero 1 alto Suero 2 bajo Dilución medido esperado Dilución medido esperado 1,0 55,6 - - Suero 3 alto 1,0 82,95 - - 0,8 49,45 45,20 109 0,8 64,10 67,83 94 0,6 36,91 34,80 106 0,6 53,45 52,71 101 0,4 24,42 24,39 100 0,4 33,25 37,59 88 0,2 11,72 13,99 84 0,2 19,59 22,48 87 0,1 8,26 8,79 94 0,1 13,66 14,92 92 0,0 3,59 - - Suero 4 bajo 0,0 7,36 - - Test de recuperación. Se han analizado muestras después de haberles añadido cantidades crecientes de Cortisol para valorar la recuperación del test LIAISON Cortisol. La tabla proporciona un ejemplo de la recuperación de diferentes cantidades de cortisol añadidas a un suero nativo (16,78 µg/dl, 10,76 µg/dl). medido esperado medido esperado 76,42 74,74 102 72,54 68,73 106 57,07 55,42 103 46,85 49,41 95 38,17 36,10 106 26,67 30,08 89 25,49 26,44 96 19,31 20,42 95 16,78 - - 10,76 - - 15.4. Sensibilidad analítica y funcional La sensibilidad analítica se define como la mínima dosis analizable de analito, que puede ser distinta del punto cero, es decir dos desviaciones estándar por encima de cero. El límite de medición es 0,15 µg/dl. La sensibilidad funcional (definida como la menor concentración de analito que puede determinarse con un CV interensayo < 20%) es 0,5 µg/dl. 16. Bibliografía 1. Canalis E, Caldarella AM, Reardon GE. Serum cortisol and 11-deoxycortisol by liquid chromatography: Clinical studies and comparison with radioimmunoassay. Clin Chem 1979; 25: 1700-1703 2. Kaye TB et al. The Cushing Syndrome: An update on diagnostic tests. Ann Intern Med 1990; 112: 434-444 3. Tunn S, Pappert G, Willnow P, Krieg M. Multicentre evaluation of an enzyme-immunoassay for cortisol determination. J Clin Chem Clin Biochem 1990; 28: 929-935 4. Orth DN, Kovacs WJ. The adrenal cortex. Williams Textbook of Endocrinology 9th Edition 1998: 517-664 5. Young JB, Landsberg L. Catecholamines and the adrenal medulla. Williams Textbook of Endocrinology 9th Edition 1998: 665-728 6. Chodosh LA, Daniels GH. Addison s disease. Endocrin 1993; 3(3): 166-181 7. Kowalski A, Paul W. A simple extraction procedure for the determination of free (unconjugated) cortisol in urine by radioimmunoassay. Clin Chem 1979; 25: 1152 8. Pudek MR. Adrenal hormones. In: Kaplan LA, Pesce AJ, editors. Clinical chemistry: therapy, analysis, and correlation. St. Louis: CV Mosby, 1989: 672-681 9. Miller J, Crapo L. The biochemical diagnosis of hypercortisolism. Endocrin 1994; 4(1): 7-16 Rev. E 2011-12-07