LACTATO ENZIMÁTICO Instrucciones de Uso Ref.:138 Finalidad. Sistema enzimático para la determinación cuantitativa del lactato en plasma (fluoruro) y líquido cefalorraquídeo. Uso profesional. [Solo para uso diagnóstico in vitro.] Principio. El lactato se determinado de acuerdo con las siguientes reacciones: Lactato L - Lactato + O Piruvato + H O 2 2 2 Oxidasa Peroxidasa 2 H O + TOOS + 4 Aminoantipirina Quinoneimina + 4 H O 2 2 2 En la presencia del oxígeno, el lactato oxidasa cataliza la oxidación del ácido láctico, que promueve la formación de piruvato y peróxido de hidrógeno. A continuación, sobreviene una reacción de acoplamiento entre el peróxido de hidrógeno,4- Aminoantipirina y TOOS, catalizada por la peroxidasa, que produce una quinoneimina que tiene absorbancia máxima en 550 nm. La intensidad del color del producto de la reacción es directamente proporcional a la concentración de lactato en la muestra. Características del sistema 1, 2. Es sistema utiliza la enzima lactato oxidasa en la determinación de la concentración de lactato presente en una muestra. El método enzimático es altamente específico y de simples ejecución. Los datos de repetibilidad y reproducibilidad demuestran que el método es capaz de proveer resultados que cumplen con las especificaciones deseables de error máximo, basadas en los componentes de variación biológica. La medición en 550 nm minimiza la interferencia de bilirrubina y hemoglobina. Concentraciones de triglicéridos hasta 1100 mg/dl, bilirrubina hasta 30 mg/dl y hemoglobina hasta 300 mg/dl no interfieren significativamente en la reacción. El producto se puede aplicar en procedimiento manual, semiautomático y automático. Metodología. Enzimático - Trinder Reactivo 1. Reactivo - 1 - Almacenar entre 2-8º C. Contiene tampón 50 mmol/l ph 7,2; 4-aminoantipirina peroxidasa 1000 U/L y conservante. 0,05 mmol/l; 2. Reactivo - 2 - Almacenar entre 2-8º C. Contiene tampón 50 mmol/l ph 7,2; lactato oxidasa 1000 U/L; N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOOS) 1,5 mmol/l y conservante. 3. Estándar - - 40 mg/dl. Almacenar entre 2-8º C. Contiene lactato de litio y azida sódica al 0,09%. Después del manejo almacenar bien sellado para evitar la evaporación. Los reactivos si se almacenan en las condiciones indicadas son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Durante el manejo, los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden causar reducción de la estabilidad. Precauciones y cuidados especiales Para mantener su rendimiento, se deben mantener los reactivos fuera de la heladera solo el tiempo necesario, a fin de obtener el volumen que será utilizado. Evitar la exposición a la luz solar directa. Los cuidados habituales de seguridad deben aplicarse en el manejo de los reactivos. No utilice los reactivos, si se muestran turbios o con signos de contaminación. El estándar contiene azida sódica que es tóxica. No beba y, en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilice grandes volúmenes de agua para desechar los reactivos. Materiales necesarios y no fornecidos. 1. Baño-Maria mantenido a temperatura constante (37ºC). 2. Fotómetro capaz de medir con exactitud absorbancias a 550 nm (530 a 570). 3. Pipetas para medir muestas y reactivos. 4. Cronómetro. 01 Español - Ref.: 138
Muestra 3-7 Use plasma (fluoruro) o líquido cefalorraquídeo. El fluoruro inhibe la glucólisis y, por lo tanto, es responsable de la estabilización del lactato sanguíneo. Recomendaciones para la preparación del paciente, obtención y procesado de la muestra. Antes de la realización del procedimiento de la recogida de sangre el paciente debe permanecer en cama por lo menos 30 minutos. La muestra de sangre debe ser realizada preferentemente sin garrote o inmediatamente después de la aplicación del torniquete. Si la muestra no está completada, poco después de la aplicación el torniquete, este último debe removerse y la muestra solo debe iniciarse de nuevo al cabo de 2 minutos. El paciente debe evitar el ejercicio de las manos y los brazos inmediatamente antes y durante el procedimiento de la muestra. La separación por centrifugación se debe realizar en un plazo máximo de 15 minutos. Tras la separación, el plasma es estable 8 horas entre 20-25ºC, 14 días entre 2-8ºC o 1 mes a -20ºC. El líquido cefalorraquídeo debe centrifugarse y usarse sin modificaciones adicionales. Puesto que ninguna prueba conocida puede asegurar que las muestras de sangre no transmiten infecciones, todas ellas se deben considerar como potencialmente infecciosos. Por lo tanto, al manejarlas, se deben cumplir las normas establecidas para la bioseguridad. Para desechar los reactivos y el material biológico, se propone la aplicación de las normas locales, estaduales o federales de protección ambiental. Interferencias 1 Concentraciones de triglicéridos hasta 1100 mg/dl, bilirrubina hasta 30 mg/dl y hemoglobina hasta 300 mg/dl no interfieren significativamente en la reacción. Muestras con bilirrubina, hemoglobina y triglicéridos en concentraciones superiores a las mencionadas anteriormente deben diluirse en NaCl 150 mmol/l (0,85%) antes de realizarse los ensayos. Multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Preparo del reactivo de trabajo. El conjunto de un envase de Reactivo 1 y un envase de Reactivo 2 permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un envase de Reactivo 2 para un envase de Reactivo 1 y homogeneizar suavemente. Identificar el envase del Reactivo de Trabajo y apuntar la fecha de caducidad. Los estudios demuestran que el reactivo de trabajo presenta una alta estabilidad. Tras el preparo, se debe considerar que la fecha de caducidad del reactivo de trabajo es la misma de los reactivos que lo conforman, a condición de que se mantengan entre 2 y 8ºC, en un recipiente cerrado y cuando no hay contaminación química o microbiana. El desarrollo de coloración ligeramente rosado en el Reactivo de Trabajo es normal y no afecta su rendimiento. Opcionalmente, puede prepararse menor volumen del Reactivo de Trabajo utilizando la proporción de 4 volúmenes del Reactivo 1 y 1(un) volumen del Reactivo 2. Para preparar el volumen de reactivo necesario para llevar a cabo la prueba, mezcle 0,8 ml del Reactivo 1 y 0,2 ml del Reactivo 2. Para mantener su rendimiento, el reactivo debe permanecer fuera de la heladera solo el tiempo necesario, a fin de obtener el volumen que será utilizado. Evitar la exposición a la luz solar directa. Procedimiento. Véase observaciones 1 y 2. Identifique 3 tubos de ensayo y proceda como se describe a continuación: Muestra Blanco ----- Prueba 0,01 ml Estándar ----- Estándar ----- ----- 0,01 ml Agua 0,01 ml ----- ----- Reactivo de Tabalho 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Homogeneizar y poner en baño maría a 37ºC durante 5 minutos. El nivel de agua en el baño debe ser superior al nivel de los reactivos en el tubo de ensayo. Determinar las absorbancias de la prueba y estándar a 550 nm (530-570), y ajustar el cero con el blanco. El color es estable durante 30 min. El procedimiento sugerido para la medición es adecuados para fotómetros cuyo volumen mínimo de solución para lectura es igual o menor que 1,0 ml. Se debe efectuar una verificación sobre la necesidad de ajuste del volumen para el fotómetro utilizado. Los volúmenes de las muestras y reactivos pueden modificarse proporcionalmente, sin afectar el rendimiento de la prueba, manteniéndose inalterado el procedimiento de cálculo. En el caso de reducción de los volúmenes, es fundamental que se observe el volumen mínimo requerido para la lectura fotométrica. Volúmenes de muestreos inferiores a 0,01 ml son críticos en aplicaciones manuales y se debe usar con precaución ya que aumentan la inexactitud de la medición. Cálculos. Véase linealidad. Absorbancia de la Prueba Lactato (mg/dl) = x 40 Absorbancia del Estándar El resultado también puede obtenerse con la utilización del factor de calibración: Factor de calibración = 40 Absorbancia del Estándar Lactato (mg/dl) = Absorbancia de la Prueba x Factor de calibración 02 Español - Ref.: 138
Ejemplos Los datos presentados a continuación son ilustrativos. Absorbancia de la Prueba: 0,450 Absorbancia del Estándar: 0,757 0,450 Lactato (mg/dl) = x 40 = 24 0,757 o 40 Factor de calibración = = 52,84 0,757 Lactato (mg/dl) = 0,450 x 52,84 = 24 Calibración Calibraciones manuales. Obtener el factor de calibración al usar un nuevo lote de reactivos, o si se indica el control interno de la calidad. Sistemas automáticos Blanco de reactivos agua o solución de cloruro de sodio 150 mmol/l (0,85%); Usar calibrador Calibra H - Labtest Intervalos de calibración Calibración de 2 puntos al cambiar el lote: Calibración de 2 puntos, si indica el control de calidad. Linealidad La reacción es lineal hasta 150 mg/dl. Para valores superiores a 150 mg/dl, disolver la muestra con NaCl 150 mmol/l (0,85%), realizar nueva determinación y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. Control interno de calidad 2,8,9. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos y criterios para los pliegos de calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Materiales de control deben utilizarse para monitorear la inexactitud de la medición y desviaciones de la calibración. Se propone que los pliegos para el coeficiente de variación y error total se basen en los componentes de la variación biológica (VB). Recién-nascidos, niños y adolescentes Plasma (fluoruro) mg/dl mmol/l 0 a 90 dias 9-32 1,0-3,5 3 a 24 meses 9-30 1,0-3,3 2 a 18 anos 9-22 1,0-2,4 Adulto Plasma (fluoruro) mg/dl mmol/l Venoso 4,5-19,8 0,5-2,2 Arterial 4,5-14,4 0,5-1,6 La concentración de lactato en el líquido cefalorraquídeo normalmente es similar a los niveles sanguíneos. Sin embargo, en alteraciones bioquímicas en el SNC, los valores de lactato en el líquido cefalorraquídeo se alteran independientemente de los valores en la sangre. Conversión: Unidades convencionales (mg/dl) x 0,111 = Unidades SI (mmol/l). Características de desempeño 12 Estudios de recuperación. En dos muestras con concentraciones de lactato iguales a 9,8 mg/dl y 19,7 mg/dl se han añadido cantidades distintas de analito, con la obtención de los siguientes resultados: Inicial 9,8 19,7 Concentración (mg/dl) Añadida 40,8 10,2 Esperada 38,2 76,4 Encontrada Percentual de recuperación 39,5 103,4% 77,1 100,9% El error sistemático total estimado es igual a 0,3 mg/dl para el nivel de 13,6 mg/dl, 0,8 mg/dl para el nivel de 37,1 mg/dl y 1,78 mg/dl para el nivel de 82,8 mg/dl. El promedio de los errores es inferior al error sistemático analítico de la especificación deseable basada en los componentes de la VB que es 8,0%. Estudios de comparación de métodos. Se ha verificado la precisión del método por comparación con otro método enzimático, y se ha obtenido los siguientes resultados: Se sugiere la utilización de los productos de la línea Qualitrol - Labtest para el control interno de la calidad en ensayos de química clínica. Intervalo de referencia 10,11. Estos valores deben usarse apenas como guía. Se recomienda que cada laboratorio establezca en la población atendida sus propios rangos de valores de referencia. Número de muestra Intervalo (mg/dl) Ecuación da regresión Coeficiente de correlación Método Comparativo Lactato Enzimático 40 40 6,7 a 135,1 6,5 a 147,3 Lactato Enzimático = 1,060* (MC) + 0,138 mg/dl 0,999 03 Español - Ref.: 138
Con la utilización de la ecuación de regresión, el error sistemático (bias) estimado es igual al 2,8% para el nivel de 15,7 mg/dl y el 2,9% para el nivel de 44,8 mg/dl. El promedio de los errores es inferior al error sistemático analítico de la especificación deseable basada en los componentes de la VB que es 8,0%. Estudios de precisión. Los estudios de precisión se han realizados con la utilización de dos muestras. Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Promedio N DP CV (%) (mg/dl) Muestra 1 Muestra 2 La imprecisión encontrada cumple con la especificación deseable para imprecisión total basada en los componentes de la VB que es 13,6%. El error sistemático (error aleatorio + error sistemático) estimado es igual al 10,39% para el nivel de 15,7 mg/dl, y el 7,55% para el nivel de 44,8 mg/dl. Los resultados señalan que el método cumple con la especificación deseable para el error total ( 30,4%) basada en los componentes de la Variación Biológica. Sensibilidad metodológica. Se ha utilizado una muestra que contenía 15 mg/dl de lactato calcular el límite de detección del ensayo, en la cual se ha encontrado un valor igual a 0,4 mg/dl, equivalente a tres desviaciones estándar de una serie de análisis con 20 replicaciones. Con la utilización de la absorbancia del estándar como parámetro, se ha comprobado que el límite de detección fotométrica es 0,05 mg/dl, que corresponde a una absorbancia igual a 0,001. Efectos de la dilución de la matriz. Una muestra con concentración igual a 151 mg/dl fue utilizada para evaluar la respuesta del sistema en la dilución de la matriz con solución NaCl 150 mmol/l (0,85%). Con el uso del factor de dilución de 2 a 16 se ha encontrada un promedio de recuperación del 102,5% que corresponde a un promedio de un error sistemático igual al 2,5%. Observaciones 80 15,7 0,11 0,71 80 44,8 0,62 1,39 Reprodutibilidade - Imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 N Promedio (mg/dl) DP CV (%) 80 15,7 0,72 4,61 80 44,8 1,26 2,81 1. La limpieza y secado adecuado del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 2. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, el agua debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Significancia clínica 10. El lactato es el producto final de la degradación de la glucosa en ausencia de oxígeno (glicólisis anaeróbica) y es producido por la reducción del piruvato. El lactato es producido en todos los tejidos; no obstante, el músculo esquelético, el cerebro y los hematíes son responsables por la producción de la mayor parte del lactato del organismo. La producción normal de lactato es de 1 mmol/kg/hora. La concentración de lactato en sangre depende de la tasa de producción y de la tasa de metabolismo en el hígado y en los riñones. Aproximadamente 30% de la producción basal total de lactato es utilizada por el hígado con predominio en la gluconeogénesis. Una concentración aumentada de lactato en sangre indica una disminución del flujo sanguíneo hacia los tejidos, con la consiguiente disminución del abastecimiento de oxígeno. La oxigenación disminuida de los tejidos, proveniente de hipovolemia, shock o insuficiencia ventricular izquierda puede predisponer al individuo a la acidosis láctica (tipo A o hipóxica), cuadro en el que se encuentra concentración aumentada del lactato sanguíneo. El aumento del lactato sanguíneo se observa también en la acidosis láctica tipo B o metabólica. Esta última está asociada a enfermedades como Diabetes mellitus, neoplasia y enfermedad hepática o a drogas y/o toxinas, como el etanol, el metanol y el salicilato. Después del ejercicio físico de larga duración la producción de lactato puede aumentar considerablemente. Para evaluar la capacidad de ejercicio y monitorear la intensidad de entrenamiento de los atletas se puede realizar la determinación del lactato sanguíneo. La concentración del lactato en el líquido cefalorraquídeo es semejante a los niveles sanguíneos. Sin embargo, en alteraciones bioquímicas del SNC, los valores de lactato en el LCR se alteran independientemente de los valores en la sangre. Niveles elevados en el LCR se observan en accidentes vasculares cerebrales, hemorragia intracraneana, meningitis bacteriana, epilepsia y otros disturbios del SNC. Referências 1. Artiss JD, Karcher RE, Cavanagh KT, Collins SL, Peterson VJ, Varma S, Zak B. A Liquid-Stable Reagent for Lactic Acid Levels - Application to the Hitachi 911 and Beckman CX7. Am J Clin Pathol 2000; 114:139-143. 2. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponível em: <http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/2006). 04 Español - Ref.: 138
3. Tietz. Textbook of Clinical Chemistry, Burtis CA.; Ashwood ER. eds, 2ª edição, Philadelphia: WB. Saunders Co, 1994. 4. Savory J, Kaplan A. A gas chromatographic method for the determination of lactic acid in blood. Clin Chem 1966; 12:559-569. 5. Westgard JO, Lahmeyer BL, Birnbaum ML. Use of the Du Pont Automatic Clinical Analyzer in Direct Determination of Lactic Acid in Plasma Stabilized with Sodium Fluoride. Clin Chem 1972; 18 (11): 1334-1338. Presentación Producto Lactato Enzimático Lactato Enzimático Labmax 560/400 Referencia 138-1/50 138-2/20 Contenido 1 1 X 40 ml 2 1 X 10 ml 1 X 5 ml CAL 1 2 X 16 ml 2 2 X 4 ml 1 X 5 ml CAL 6. Astles R, Williams CP, Sedor F. Stability of Plasma Lactate in Vitro in the Presence of Antiglycolytic Agents. Clin Chem 1994; 40 (7): 1327-1330. 7. The Quality of Diagnostics Samples, Samples and Stability of Analytes. Disponível em: <http://www.diagnosticsample.com/samples.php3?lang=en> (acesso em 27/05/09). Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto, dentro de las especificaciones, hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones, sean seguidos correctamente. 8. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica 2005. 9. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501. 10. Tietz. Fundamentos de Química Clínica, Burtis CA; Ashwood ER. eds, 4ª edição, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: 16.516.296 / 0001-38 Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000 Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br Customer Service e-mail: customerservice@labtest.com.br 11. Pediatric Reference Ranges. Soldin SJ; Brugnara C; Wong EC. eds, 5ª edição, Washington, DC: AACC Press, 2005. 12. Labtest: Datos de Archivo. Revisión: Octubre, 2012 Ref.: 260117 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 05 Español - Ref.: 138
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