EL APORTE DE LA BIOLOGIA MOLECULAR AL ESTUDIO DE LA FIBROSIS QUISTICA EN ARGENTINA

ACTUALIZACIONES EL APORTE DE LA BIOLOGIA MOLECULAR AL ESTUDIO DE LA FIBROSIS QUISTICA EN ARGENTINA Dras. Lilien Chertkoff, Alicia A. Visich Laboratorio de Biología Molecular, Servicio de Genética. Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan. INTRODUCCION La Fibrosis Quística (FQ) es la enfermedad hereditaria letal más frecuente en la población blanca. Pese a ello, en los países latinoamericanos, es todavía una enfermedad relativamente rara probablemente debido a su subdiagnóstico. En los últimos años, con el desarrollo de centros especializados en diagnóstico y tratamiento de la FQ, el número de casos diagnosticados se incrementó notablemente. En población argentina, si bien no existen datos definitivos, los primeros estudios realizados indican una incidencia de 1/3468 recién nacidos vivos 1. De estos datos se puede inferir una frecuencia de portadores asintomáticos en la población general de alrededor de 1 en 30. Por lo tanto 1 cada 900 familias está en riesgo de tener un niño afectado. La forma clásica y más común de esta entidad presenta enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia pancreática exócrina, concentraciones elevadas de electrolitos en sudor e infertilidad masculina por azoopermia obstructiva. Ya que prácticamente todos los componentes clínicos del fenotipo FQ muestran algún grado de variabilidad, otras formas de presentación menos comunes son también clasificadas como FQ 2. Entre éstas se incluye pacientes con suficiencia pancreática (15% de la población afectada), los casos poco frecuentes de test del sudor negativo y los pacientes con una inusualmente leve afectación pulmonar. El fenotipo FQ también puede incluir síntomas menos comunes como el íleo meconial, el síndrome de obstrucción intestinal distal, pancreatitis, enfermedad hepática o diabetes entre otros 3. El gen alterado en esta patología codifica para una proteína denominada reguladora de la conductancia de transmembrana de la FQ (CFTR) que se expresa en la membrana apical de las células del epitelio exócrino. Esta proteína funciona principalmente como un canal para el transporte activo de iones cloruros y parece además ser capaz de regular la función de otros canales iónicos. A partir de su descubrimiento, en 1989 4,5, se han encontrado más de 800 mutaciones que causan enfermedad distribuidas a lo largo de este extenso gen 6. La mutación más común, F508 está presente en promedio en el 67% de los alelos FQ analizados a nivel mundial 7 ; sólo un grupo de no más de 20 mutaciones supera el 1%, mientras que las restantes son consideradas raras o exclusivas de una población en particular 8. La mayoría de ellas, conduce a la completa pérdida de función del canal, ya sea porque afectan la biosíntesis de la proteína (mutaciones de clase I) su maduración (mutaciones de clase II) o su función (mutaciones de clase III). Otras mutaciones, en cambio (clase IV y V), producen proteínas que retienen una cierta actividad residual (Figura 1). La contribución de estas diferentes variantes alélicas del gen CFTR a la variabilidad clínica de la fibrosis quística es evaluada a través de estudios de correlación genotipo-fenotipo. Estos estudios demostraron que el grado de correlación varía con los distintos componentes clínicos y alcanza su máximo grado con la función pancreática 9. Los fenotipos con insuficiencia pancreática (IP) están asociados a la presencia de mutaciones de clase I, II y III mientras que los fenotipos con suficiencia pancreática (SP) poseen al menos una mutación de clase IV o V. Por el contrario se observó una muy pobre correlación entre el genotipo CFTR y la severidad de la enfermedad pulmonar 10,11, lo que sugiere, para este componente clínico, una fuerte influencia de factores ambientales y factores genéticos secundarios (genes modificadores). Recientemente se han encontrado mutaciones en el CFTR diferentes de las que caracterizan a las formas clásicas de la FQ, asociadas a entidades clínicas monosintomáticas que semejan el fenotipo FQ. Estas incluyen varias formas de azoospermia obstructiva 12,13, pancreatitis idiopática 14, bronquiectasias diseminadas 15, aspergilosis broncopulmonar alérgica 16,17, entre otras. Así, la composición, frecuencia y tipo de mutación o variante del gen CFTR Biología molecular en FQP 113

Normal I II III IV V Ausencia de síntesis Bloqueo del procesamiento Bloqueo de la regulación Conductancia Alterada Síntesis Reducida Sin G542X Marco de lectura 394delTT Sitio de splicing 1717-1G >A Deleción de aminoácidos F508 G551D R117H A455E Splicing alternativo 3849+10kbC >T Figura 1: Consecuencias moleculares de las mutaciones en el gen CFTR. se corresponde con un espectro continuo de fenotipos asociados a este gen que varían desde la forma clásica mas severa hasta las presentaciones monosintomáticas leves (Figura 2). El número e incidencia de las mutaciones varía ampliamente de acuerdo al origen étnico y la localización geográfica de cada población. Así, por ejemplo, F508 muestra frecuencias variables de 50 a 88% 7 en países de Europa occidental y de menos del 30% en poblaciones de Medio oriente 18. Por otro lado, en poblaciones genéticamente homogéneas el análisis de un pequeño grupo de mutaciones permite la identificación de más del 90% 19,20 de los alelos mutados mientras que en poblaciones heterogéneas el análisis de más de 40 CBAVD, Bronquitis crónica Normal SP FQ IP Bronquiectasias, pancreatitis, etc. Escala de Severidad Mutaciones Atípicas Mutaciones Típicas FQ: fibrosis quística; SP: suficiencia pancreática; IP: insuficiencia pancreática; CBAVD: ausencia congénita bilateral de vasos deferentes Figura 2: Mutaciones del gen CFTR y sus consecuencias clínicas. mutaciones permite la caracterización de apenas el 74%-78% 21,22 de los alelos FQ. Análisis del gen CFTR en pacientes de Argentina La población argentina se constituyó por la integración de diferentes grupos étnicos inmigratorios y los grupos amerindios que habitaban nuestro país, formando una población genéticamente heterogénea. Debido ello nos planteamos la necesidad de desarrollar una metodología de investigación que permitiera conocer la naturaleza y distribución de las mutaciones que causan FQ en nuestro país con el fin de diseñar una adecuada estrategia de diagnóstico molecular en una población de características étnicas tan complejas. Realizamos, en una primera etapa, el estudio en forma directa de F508 y otras 10 mutaciones reportadas como las más frecuentes por el Consorcio Internacional para el registro de mutaciones en el gen CFTR (CFGAC) en 220 niños atendidos en el Hospital de Pediatría Garrahan y en el hospital Sor María Ludovica de La Plata, que cumplían con los criterios clásicos de diagnóstico de fibrosis quística. Este grupo de pacientes representa 1/3 del total de afectados informados al Registro Argentino de Fibrosis Quística (RAFQ) 23. La mutación más frecuente, F508, estuvo presente en el 57% de los alelos analizados Las otras 10 mutaciones analizadas mostraron frecuencias marcadamente inferiores, siendo la segunda más frecuente G542X con el 4%. El análisis del conjunto de estas 11 mutaciones permitió detectar el 70% de los alelos FQ 24. De este modo se alcanzó el nivel mínimo de sensibilidad que se requiere para que un método de laboratorio pueda ser considerado como diagnóstico. 114 Medicina Infantil Vol. VIII N 2 Junio 2001

Sin embargo, con este estudio se identificaron ambos alelos mutados (genotipo completo) en sólo el 51% de los pacientes. Por lo tanto, en una importante proporción de familias, el análisis molecular directo, no aportó la información necesaria para completar el diagnóstico genético y el asesoramiento familiar. Fue necesario entonces, aplicar una estrategia de estudio, denominada de scanning molecular, que permitiera detectar cualquier cambio en el gen CFTR para luego identificarlo por secuenciación directa de la región alterada 25. Si el cambio detectado resultara deletéreo para el correcto funcionamiento de la proteína será una mutación, si, por el contrario, fuera inocuo se denominará polimorfismo. De los métodos de scanning descriptos hasta el momento elegimos el de Análisis de Heterodúplex en Multiplex (HA-MDE) que permite el análisis simultáneo de las regiones que serán traducidas a proteína (27 exones) y las secuencias regulatorias más relevantes. Esto representa el análisis conjunto de más de 10.000 pares de bases 26 (Zielenski, comunicación personal). Este análisis exhaustivo del gen CFTR permitió caracterizar el 83.45% de los alelos estudiados (367/440). Se detectaron en total 39 mutaciones de distinta naturaleza, distribuidas a todo lo largo del gen. Cabe señalar que 8 de estas mutaciones no habían sido descriptas previamente en ninguna población. Se describieron también 2 nuevas secuencias polimórficas (Figura 3). La única mutación preponderante fue F508 y sólo otras 5 mutaciones (G542X, W1282X, N1303K, 3849+10KbC T y R334W) mostraron frecuencias superiores al 1%, 14 mutaciones tenían frecuencia entre 0,45 y 0,9 % y cada una de las 19 mutaciones restantes estuvo presente solamente en una familia afectada 27. La aplicación de esta metodología aumentó drásticamente el diagnóstico de certeza al 75.5% de los pacientes estudiados (donde se describieron 43 genotipos diferentes) y solamente un 8,5% de los pacientes permanece aún sin ninguna mutación detectada (Figura 4). A partir de haber definido las mutaciones más frecuentes pudimos establecer el mínimo número de mutaciones que deberían incluirse en todo sistema de diagnóstico molecular de fibrosis quística en nuestra población; estas son F508, G542X, W1282X, N1303K, 3849+10KbC T, R334W. Con el estudio conjunto de las mismas se caracteriza al 70.5% de los alelos FQ. Este nivel de sensibilidad resulta suficiente para ser aplicado en la optimización del screening neonatal basado en el dosaje de tripsinógeno en gota de sangre seca sobre papel n = 220 Genotipo completo 75,50% dos alelos identificados ningún alelo identificado Genotipo incompleto 16,00% Genotipo desconocido 8,50% un alelo identificado Figura 4: Distribución de pacientes fibroquísticos de acuerdo al genotipo caracterizado. F508 I507 297+2A G L6V D426C G542X R553X 2686insT G1061R R1066C 621+1G AT 1353insT 1460delAT 1717-1G A S549R 1782delA 2789+5G A 2789+2insA 4005-1G A W1282X 5T 5 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a 14b 15 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 3 G85E W57X R75Q Q220X R334W Y362X 1811+1.6KbA G 1898+3A G 2594delGT 2566insT 2184insA 2183AA G I1027T 3659delC R1162X 3849+10KbC T N1303K 4016insT Marco de lectura Sin Splicing Poliformismo Nuevas Figura 3: Distribución de las mutaciones del gen CFTR detectadas en población argentina. Biología molecular en FQP 115

(IRT). Estas mutaciones pueden estudiarse en la misma muestra elevando sensiblemente la especificidad de la pesquisa. Recientemente se han desarrollado kits comerciales para el estudio genético de la FQ. Estos sistemas han sido concebidos para poblaciones del norte de Europa, como Inglaterra y Bélgica, donde muestran una sensibilidad superior al 95%. A partir de nuestros resultados podemos concluir que estos kits comerciales, que detectan entre 8 y 31 mutaciones, no superan, en nuestra población, el 75% de sensibilidad. El informe del consenso para el diagnóstico de FQ publicado en el Journal of Pediatrics 2 especifica que la sensibilidad de detección de las mutaciones del los test comerciales podría elevarse si estos fueran diseñados de acuerdo a background étnico y al fenotipo del paciente. Un test que incluyera un panel con las 20 mutaciones más frecuentes en Argentina tendría una sensibilidad del 79% y con las 31 más frecuentes se alcanzaría el 82%. Si comparamos nuestros resultados, con los de diferentes países de Europa y América Latina vemos que esta población de Argentina tiene un patrón de distribución de mutaciones único y característico aún si se la compara con las poblaciones más cercanas desde el punto de vista étnico o geográfico. Así por ejemplo, las mutaciones W1282X y 3849+10KbC T, muy frecuentes en población judía ashkenazi 28,29 se encuentran entre las cinco mutaciones más comunes en nuestra población, con frecuencias significativamente superiores al promedio mundial. Estos resultados concuerdan con los datos demográficos que indican que la Argentina es segundo país americano (después de USA) que dio asilo a la diáspora judía 30. De las 10 mutaciones más frecuentes en nuestra población, I507 no fue encontrada en población de Brasil 31, otras dos mutaciones (3849+10KbC T y R553X) estuvieron ausentes en la serie de Uruguay 32 y cinco de nuestras más frecuentes no se encontraron en la población mexicana 33. Por otro lado, el nivel de sensibilidad alcanzado en este estudio es similar al observado en otras poblaciones étnicamente heterogéneas principalmente del sur de Europa (Grecia 74.5% 34 ; España 78% 35 e Italia 74% 36 ; pero resulta más alto que el de otras Frecuencia % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Gran Bretaña 98 Bélgica Alemania 78,5 72,5 75 98 94 Frecuencia de alelos 86,5 F508 Israel 97 30 Francia 90 68,5 Grecia Poblaciones Italia 69 74 53,06 47,5 Figura 5: Caracterización de los alelos FQ en distintas poblaciones. Sensibilidad del análisis molecular. España 78 50,61 Argentina 58,64 200 896 475 470 326 1987 1136 440 72 500 160 310 1034 84 Nº de Alelos estudiados Chile 33 29,16 Sensibilidad del análisis molecular poblaciones de América Latina (Brasil 72% y México 74%) 31,33 (Figura 5). Esto está relacionado con el hecho de que Argentina muestra la frecuencia de F508 más elevada de Latinoamérica. El alto porcentaje de mutaciones raras encontradas y la historia genética de nuestra población nos hacen pensar que las mutaciones que faltan caracterizar no serían prevalentes. Únicamente el desarrollo de metodologías aún más complejas, como la secuenciación completa del gen, nos permitiría alcanzar una sensibilidad de 90-95%. Asesoramiento familiar Una de las aplicaciones importantes del estudio molecular, además del diagnóstico, es que provee la información necesaria para el asesoramiento genético, ya que el conocimiento de las mutaciones en el niño permite confirmar el estado de portador de sus padres y el de los familiares en riesgo sabiendo que cada hermano sano del niño tiene una chance de 2/3 de ser portador de una de las mutaciones involucradas. Asimismo, los familiares de segundo grado (tíos y sobrinos) tienen un riesgo a priori de 25% y los familiares de tercer grado (primos hermanos) de 12.5% de ser portadores. Como se muestra en la Figura 4, se detectó el genotipo completo en el 75.5% de los afectados permitiendo el asesoramiento adecuado para todas estas familias. Consideramos necesario, sin embargo, poder contar con un método que permitiera confirmar o descartar el carácter de portador de los familiares de pacientes donde no se pudieron detectar ambas mutaciones. Este método, denominado análisis de ligamiento, se basa en la utilización de marcadores Brasil 56 47 México 37 30 EE.UU 75 64 Canadá 86 70 Alelos desconocidos 116 Medicina Infantil Vol. VIII N 2 Junio 2001

microsatélites que se heredan junto al gen de interés, en nuestro caso, el CFTR. Estos marcadores, como todos los microsatélites, son secuencias cortas altamente variables en una población y propias de cada individuo. Se heredan de manera estable, lo que permite su utilización para establecer vínculos entre personas. Los microsatélites IVS17bTA 37, IVS8CA 38 y IVS17bCA 39 al estar ubicados dentro del gen CFTR hacen posible marcar dentro de una familia el camino de los alelos afectados. Para evaluar si estos marcadores eran apropiados para realizar estudios de ligamiento en nuestra población se analizó la variabilidad de estos tres microsatélites en 40 familias que tenían al menos un niño afectado. Se determinó el número de alelos de cada marcador y su distribución en la población de estudio. Se detectaron 15 variantes alélicas diferentes de IVS17TA, 10 de IVS8CA y 4 de IVS17bCA. En conjunto mostraron un alto grado de heterocigosidad (99%) lo que permitió identificar en cada familia afectada las variantes alélicas asociadas a la enfermedad 40. Este estudio resultó informativo en el total de las familias analizadas: entre los 48 hermanos de pacientes FQ analizados, identificamos 34 portadores y 14 individuos sanos no portadores. También se realizó el asesoramiento a otros individuos relacionados, como tíos y primos que así lo requirieron. Además permitió realizar el diagnóstico presintomático en dos recién nacidos, hermanos de pacientes cuyos alelos mutados permanecían desconocidos posibilitando iniciar tempranamente conductas terapéuticas. En conclusión estos microsatélites constituyen un excelente grupo de marcadores genéticos útiles para observar la transmisión de los alelos mutados en familias FQ donde no se pudo establecer el genotipo completo. Resultan también muy apropiados para la realización de estudios prenatales 40. Del conocimiento del gen al desarrollo de nuevas terapias El creciente conocimiento de la etiología y patogénesis de la FQ a nivel molecular abrió un espectro completamente nuevo de posibilidades terapéuticas. Este abarca desde la provisión del gen normal a las células del epitelio respiratorio (terapia génica) al desarrollo de estrategias farmacológicas orientadas a corregir la disfunción del gen (terapia alelo específica). Terapia génica Esta estrategia consiste en introducir el gen normal en las células afectadas de modo que su expresión reemplace a la del gen mutado. El éxito de esta terapia depende en gran medida de la identificación de agentes (vectores) que permitan introducir eficientemente el nuevo gen en las células correctas y mantener su expresión en el tiempo. Inicialmente se pensó que el pulmón, debido a su fácil acceso, era un órgano ideal para este tipo de terapia. Sin embargo investigaciones posteriores demostraron que la superficie de las vías aéreas resultaba una barrera limitante para la mayoría de los vectores virales y no virales desarrollados durante los últimos 10 años. Los más estudiados fueron los adenovirus, los virus adeno-asociados y los liposomas Los vectores adenovirales (adenovirus a los que se les quitó la capacidad de replicación y se les unió una copia del CFTR) mostraron serias limitaciones ya que no lograron liberar eficientemente el gen normal al interior de las células in vivo, ya sea en modelos animales como en pacientes FQ. Además estas partículas virales inducen una rápida reacción inflamatoria en respuesta al vector viral así como a las células modificadas. Los vectores virales adeno-asociados (AAV) son derivados de un parvovirus no patogénico que tiene la propiedad de integrarse al genoma del huésped, característica que le permitiría aumentar la persistencia del gen introducido. En estudios in vitro, utilizando estos vectores, se observó expresión persistente del CFTR por más de 6 meses 41. Las respuestas inflamatorias parecen ser más leves que en el modelo anterior; sin embargo este sistema presenta ciertas desventajas relacionadas con una menor eficiencia y una limitada capacidad para transportar grandes secuencias de ADN exógeno 42. Se están realizando pruebas clínicas -fase I- en epitelio nasal y pulmones en pacientes en Europa y Estados Unidos 43. Los vectores sintéticos no virales, como los liposomas catiónicos, muestran ventajas sobre los virales respecto a la toxicidad y inmunogenicidad. Sin embargo la liberación de ADN desnudo es poco eficiente y poco estable por lo que se necesitan repetidas dosis para sostener el efecto 44. Las numerosas pruebas clínicas realizadas en la década del noventa mostraron que la terapia génica, independientemente del método utilizado, es segura para el paciente y su entorno pero no es eficaz por lo que no podría ser considerada una alternativa terapéutica en el corto plazo 45. El éxito de la misma depende de un mejor conocimiento de la biología del CFTR y de los mecanismos responsables del ingreso de cada tipo de vector al epitelio respiratorio. Queda aún por establecer cuales serían las verdaderas células blanco y qué proporción de ellas debería expresar el gen para producir beneficio clínico. También deberá dilucidarse si es necesario recuperar cada una de las funciones de CFTR y cuál es el mejor momento para aplicar esta terapia. Se está trabajando intensamente en estos puntos así como en el desarrollo de nuevos vectores que minimicen la inmunogenicidad y maximicen su eficacia. Biología molecular en FQP 117

Terapia alelo específica Se trata del desarrollo de estrategias farmacológicas orientadas a reparar la proteína mutante por lo que cada clase de mutación requiere un enfoque específico. Esta estrategia tiene la ventaja de asegurar que la corrección de la función del CFTR se hará en la célula afectada y estará regulada por la mayoría de los mecanismos apropiados de las vías aéreas. Las mutaciones de Clase I, que disminuyen la producción de proteína, poseen un cambio de base en la molécula de ADN que resulta en una señal de terminación en lugar de la que permite incorporar el aminoácido apropiado, lo que resulta en una cadena proteica que termina prematuramente produciendo una molécula no funcional. Ciertos antibióticos aminoglucósidos (como la gentamicina) pueden suprimir estas señales de terminación y restaurar la síntesis completa de la proteína 46. Están planificadas pruebas clínicas en pacientes con las mutaciones clase I más frecuentes (W1282X, R553X, R1162X y G542X) para ver si esta acción puede ser efectiva usando concentraciones de gentamicina o análogos que puedan ser tolerados por los pacientes 47. Las mutaciones de Clase II, entre las que se encuentra F508, generan defectos estructurales que provocan problemas durante el procesamiento a través de la célula. Debido a que la composición en aminoácidos es anormal, estas proteínas mutantes son reconocidas como anómalas por la maquinaria de control de calidad de la célula y son conducidas a la vía de la degradación. Se observó que la proteína con la mutación F508 recupera parcialmente su función y es transportada correctamente a la superficie de la célula luego del tratamiento con chaperonas químicas (moléculas que favorecen el correcto plegamiento de las proteínas dentro de la célula) como el glicerol 48. Una alternativa a las chaperonas químicas es el fenilbutirato, un análogo oral del butirato, que fue desarrollado como tratamiento para enfermedades del ciclo de la urea. El fenilbutirato regula la expresión de muchos genes, incluyendo el CFTR. Se ha observado, tanto in vitro como in vivo, que esta molécula promueve el acceso de la molécula defectuosa ( F508) a la superficie de la célula 49. Actualmente se está explorando el uso de dosis más altas y análogos más potentes así como períodos de exposición más prolongados. Los mutantes de clase III y IV son proteínas completas que alcanzan correctamente la membrana plasmática. Sin embargo presentan defectos de funcionamiento, en la regulación y activación del canal. A nivel de la activación del canal se están estudiando tres compuestos diferentes, milrinona, genistein y CPX 49. La milrinona es un inhibidor de la fosfodiesterasa que mejora la conducción de cloruros de un modelo murino con la mutación F508 50. El genistein, un inhibidor de la tirosina quinasa y el CPX, agonista del receptor de xantina A1-adenosina aumentan la actividad del canal. Se están realizando las primeras pruebas clínicas (fase I) en pacientes F508 homocigotas El CPX ha mostrado resultados muy promisorios activando los canales afectados por la mutación F508. La mayoría de estas drogas están en estadios muy tempranos de pruebas clínicas, fase I (como es el caso del CPX en pacientes homocigotas F508 y los aminoglucósidos en pacientes con las mutaciones G542X y W1282X) o se están planificando las mismas y habrá que esperar por lo menos dos años para ver qué resultados producen. CONCLUSIONES En la actualidad los objetivos terapéuticos en la FQ están orientados fundamentalmente a la preservación de la función pulmonar, la optimización del estado nutricional, minimizando las complicaciones y manteniendo la calidad de vida de los pacientes. El diagnóstico temprano es uno de los requisitos indispensables para alcanzar tales metas y tendrá mayor impacto aún sobre la eficacia de las nuevas estrategias terapéuticas. La terapia génica así como las terapias alelo-específicas probablemente sean más efectivas si se aplican antes del inicio de las típicas manifestaciones pulmonares. El estudio molecular del gen CFTR provee diagnóstico precoz y de certeza a un significativo número de pacientes y es especialmente importante en los casos de test de sudor negativos así como en el período neonatal. Brinda además a los pacientes la información necesaria para acceder a nuevos protocolos de tratamiento. El desarrollo de esta tecnología en un hospital público permite el libre acceso a la misma de todos los pacientes afectados por esta enfermedad. Agradecimientos A la Dra. Cristina Barreiro por su invalorable apoyo para la concreción de este proyecto. Al Dr. Julian Zielenski por su generosa colaboración para la puesta en marcha de la técnica de screening molecular. Al Dr. Pablo Gravina por su colaboración durante la elaboración de este manuscrito. A la Fundación FIPAN por la beca otorgada desde 1995 hasta 2000. REFERENCIAS 1. Segal E, Grenoville M, Macri C, et al. Consenso de Fibrosis Quística. Arch Argent Pediatr, 1999: 97 (3): 188-224. 2. Rosenstein B and Cutting GR, for the Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. J Pediatr 1998; 132:589-95. 3. Welsh MJ, Tsui LCH, Boat TF Beaudet AL. Cystic Fibrosis in Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds.). The metabolic and molecular bases of inherited diseases. 7 ed. New York: Mc- Graw-Hill; 1995; 3799-876. 4. Rommens JM, Ianuzzi MC, Kerem B, et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science 1989, 245:1059-1075. 118 Medicina Infantil Vol. VIII N 2 Junio 2001

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