Shigella spp. : diagnóstico y caracterización

Shigella spp. : diagnóstico y caracterización María Rosa Viñas Servicio Enterobacterias INEI-ANLIS C.G.Malbrán Especialización en Bacteriología Clínica UNNE 12-13 de junio 2015

Familia Enterobacteriaceae. Género: Escherichia Escherichia coli Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Escherichia vulneris Escherichia blattae Género: Shigella Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei

GÉNERO SHIGELLA * Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados, no móviles de la familia ENTEROBACTERIACEAE, no produce gas a partir de carbohidratos. El género se diferencia en cuatro especies y esta separación se basa en caracteres bioquímicos y antigénicos. Shigella dysenteriae, serogrupo A: 13 serotipos.(*) Shigella flexneri, serogrupo B: 8 serotipos. (*) Shigella boydii, serogrupo C: 20 serotipos. (*) Shigella sonnei, serogrupo D: 1 serotipo. (*) La cantidad de serotipos por grupo cambia cuando se definen nuevos serotipos. (*) En el marco de un grupo de trabajo a nivel internacional se está consensuado la nomenclatura de la nueva variante emergente de S. flexneri

Infección por Shigella spp. La shigellosis está distribuída en todo el mundo, endémica en países tropicales y de clima templado incidencia en verano. Riesgo para viajeros que se trasladan hacia áreas endémicas. Brotes en condiciones de hacinamiento y falta de saneamiento en cárceles, hospitales psiquiátricos, geriátricos, campamentos y a bordo de embarcaciones. Shigella: único huésped el ser humano y a los primates. Se transmite de persona a persona por la vía fecal-oral o por alimentos contaminados, el vector de transmisión son las moscas y/ o aguas estancadas. Altamente infecciosa por la ruta oral, la ingestión de 10 a 100 organismos. Shigella no es de notificación obligatoria pero a través del SNVS de Argentina, módulo laboratorio SIVILA, permite una vigilancia del mo.

La mayor parte de los casos positivos para diarreas bacterianas se debieron a Shigella (4116) con predominio de S. flexneri, seguido por Salmonella, Escherichia coli. SIVILA 2014

SHIGELLOSIS PRESENTACION CLINICA Diarrea acuosa asociada con vómitos y deshidratación leve a moderada. Disentería caracterizada por pequeños volúmenes de materia fecal con sangre, mucus y dolor abdominal. Disentería: consecuencia de la invasión de la mucosa colónica, multiplicación y muerte celular, inflamación y ulceración de la mucosa con la consiguiente aparición de sangre en materia fecal. Complicaciones posteriores a una Shigellosis : bacteriemia, convulsiones y problemas neurológicos, artritis reactiva ( pacientes inmunocomprometidos, niños y ancianos). Infección por Sh. dysenteriae serotipo 1: tasa de letalidad del 20% causando las más severas disenterías debido a su potente toxina Shiga, exotoxina termolábil que afecta el intestino y el SNC, y contribuir a la gravedad extrema de la infección.

U1 INVASION POR SHIGELLA GENE GLOBE PATHWAYS

Diapositiva 7 U1 Usuario, 28/08/2014

FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO DE Shigella (Muestra clínica) Observación en fresco MUESTRA (Hisopo en Cary Blair) Coloración de Gram Suspensión salina MacConkey, EMB, SS, Hektoen, XLD Colonias típicas TSA TSI LIA P. Bioquímicas Serotipificación

El género Shigella es un género bioquimicamente poco reactivo; presenta las propiedades indicadas en TABLA IV. Las placas de medio selectivos y diferenciales : agar McConkey y agar EMB a 37ºC, 18 a 24 horas. Las colonias características, se siembran en estría de TSA, TSI y LIA, a 37ºC, 18 a 24 hs. TSI: -K/A, LIA: -K/A pruebas mínimas Prueba Bioquimica Shigella spp. SH2 - Glucosa (gas) - Glucosa (ácido) + Movilidad - Citrato Simmons - Adonita (fermentación) - Malonato (utilización) - Voges-Proskauer - Arginina dehidrolasa - Lisina decarboxilasa - Ornitina decarboxilasa - ó + (S. sonnei) Salicina (fermentación) - Lactosa (fermentación) - Urea (hidrólisis) - Sacarosa (fermentación) - Xilosa (fermentación) - Fenilalanina deaminasa - Inosita (fermentación) - Rojo de metilo + + 90% o más en 1-2 días; 90% o más en 1-2 días

ATIPIAS TSI alcalino/ácido sin gas, LIA alcalino/ácido, SIM (- v -), acetato negativo, urea negativa. Serología para Shigella: pobre o negativa; estos cultivos se deben calentar a 100º C. TSI alcalino/ácido con gas, LIA alcalino/ácido, SIM (- - -), acetato negativo, urea negativa. Se debe realizar serología para Shigella, porque hay ciertos serotipos de Sh. dysenteriae, Sh flexneri y Sh. boydii que pueden producir gas a partir de glucosa. Shigella sonnei ONPG negativas, lactosa -

TABLA. Caracteres Bioquímicos Diferenciales entre especies de Shigella Especie D-Manitol ONPG Ornitina decarboxilasa *Sh. dysenteriae - - - **Sh. flexneri + - - ***Sh. sonnei + + + Sh. boydii + - - S. dysenteriae 1 son ONPG +, ** S. flexneri fermenta manitol, excepciones: S. flexneri 4 y 6 variedades S. flexneri manitol-negativo, *** S. sonnei ONPG Utilización de Azúcares, pruebas orientativas para la diferenciación a nivel de especie de Shigella : Dulcita, Xilosa, Ramnosa, Rafinosa y Glicerol (Tabla con % ) Ej. S. boydii utiliza xilosa ó ducitol, glicerol, S sonnei utiliza rafinosa, rhamnosa, permite diferenciar de otros subgrupos ó especies

TABLA. Caracteres Bioquímicos Diferenciales entre Shigella y E. coli. Prueba Bioquímica Shigella Escherichia coli Indol - o + + Lisina decarboxilasa, (+), - Ornitina decarboxilasa - o + +, (+), - Arginina dehidrolasa -, +, (+) (+), +, - Mucato (utilización) Acetato (utilización), (+) Citrato Christensen, (+), - Glucosa (gas) Lactosa (fermentación) -, (+) + Sacarosa (fermentación) -, (+) +, (+), - Salicina (fermentación), (+), - Movilidad ó - + 90% o más en 1-2 días; (+) luego de 3 o más días; - 90% o más, + o mayoría de cepas positiva, - o + mayoría de cepas negativa Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae, 4th. Edition

* Las pruebas del acetato y mucato tienen considerable valor para diferenciar ambos géneros: Prueba Bioquímica *Shigella Escherichia coli **Escherichia coli inmóvil Acetato (utilización) + ó - Mucato (utilización) + ó - Glucosa c/gas - SIM -, -, - -,+, + -,+, - ó -, -, - Citrato Christensen - - ó + + ó - + : 90% o más en 1-2 días; - : 90% o más, + o mayoría de cepas positiva, - o + mayoría de cepas negativa *S. flexneri 4: suele utilizar acetato como fuente de carbono positivo 2-7 días reacción débil (confirmar por PCR) ** biotipos E.coli no móviles anaerógenos, lactosa - en TSI : K/A similar a Shigella

FIGURA Flujograma de Serotipificación para Shigella spp. Cepa con características bioquímicas de Shigella Estria en TSA Aglutinación con solución fisiológica Negativa Aglutinación con OShB Positiva Cepa rugosa PCR Múltiple para S. flexneri Negativa Positiva Sh. flexneri(se prueban serotipos 1 a 6) Aglutinación con OShD Negativa Positiva Sh. sonnei Aglutinación con OShC Negativa Positiva Sh. boydii(se prueban serotipos indol + y - - Aglutinación con OShA Negativa Positiva Sh. dysenteriae(se prueban serotipos indol + y - Calentar (ver pág.13)

Shigella spp.: primer agente de origen bacteriano por SIVILA y asociado a brotes comunitarios. Mejorar la detección de fuente de infección con técnicas sensibles y/ó medidas oportunas. En el marco de la RND * Uso del antisuero AA479 como screening de este nuevo subserotipo de S. flexneri cuya sero -prevalencia aumentó en el país en los últimos años.

Vigilancia desde el LRN: S. flexneri atípicas (no tipables): 1,7% en 2008 y 16% en 2009, reconocidos por 1ra vez en tres provincias (N, RN y La Pampa) y luego en el resto del país alcanzando un 30,4% en 2010. Distribución de serotipos de S. flexneri LNR, Enero 2007 a Diciembre 2010 N Aislamientos de Shigella flexneri 400 300 200 100 Serotipos de S. flexneri S. flexneri atípicas S. flexneri 2 S. flexneri 3 S. flexneri 1 0 2007 2008 2009 2010 S. flexneri 6 S. flexneri 4, 5, X e Y Caracterizar feno-genotípicamente una selección de aislamientos de S.flexneri atípicos emergentes en Argentina y estudiar el comportamiento epidemiológico de esta variante desde su reconocimiento en el país.

S. flexneri atípicas análisis PFGE PFGE- NotI: relación genética de aislamientos de S. flexneriatípicos y cepas de serotipos variantes X, Y and tipo 4. Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] PFGE-NotI 70 80 90 100 PFGE-NotI Isolate State Isolate Date NotI-PFGE pattern S. flexneri serotype SF461/10 SF478/09 SF564/09 SF66/10 SF1241/10 SF412/09 SF1460/10 SF612/10 SF617/10 SF493/09 SF479/09 SF571/09 SF2080/09 SF730/09 SFB67X-1 SF1004/09 SF465/10 SF294/09 SF743/09 SFB4a-1 SF472/09 SFB69Y-1 SF2029/09 SFB4a-6 SF1944/06. CABA Jujuy Neuquén Neuquén Jujuy Salta Neuquén Río Negro Río Negro Río Negro Neuquén Neuquén Neuquén Neuquén Río Negro ND Tucumán Jujuy Buenos Aires La Pampa ND La Pampa ND Río Negro ND 2010-01-04 2009-07-01 2009 2009-11-20 2010 2009 2010-04-10 2010-02-09 ARJZXN11.0019 ARJZXN11.0019 ARJZXN11.0019 ARJZXN11.0019 ARJZXN11.0022 ARJZXN11.0012 ARJZXN11.0028 ARJZXN11.0028 Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical Atypical 2010-02-13 ARJZXN11.0028 Atypical 2009-07-01 ARJZXN11.0010 Atypical 2009 ARJZXN11.0006 Atypical 2009 ARJZXN11.0007 Atypical 2009 ARJZXN11.0033 Atypical 2009-07-01 ARJZXN11.0026 X variant ND ARJZXN11.0084 X variant 2009-07-01 ARJZXN11.0045 Atypical 2010-05-05 ARJZXN11.0024 Atypical 2009 ARJZXN11.0080 Atypical 2009-07-01 ARJZXN11.0039 Atypical ND ARJZXN11.0054 4a ARJZXN11.0046 Y variant ND ARJZXN11.0072 Y variant ARJZXN11.0133 Y variant ND ARJZXN11.0044 4a 2006 ARJZXN11.0136 4a * Shigella flexneri nomenclature updated. August, 2014

Caracterización feno-genotípica de una selección de S. flexneri atípicas? Caracterización fenotípica Car. genotípica PCR m5 m6 S. flexneri Serotype Typing S. flexneri IV sera (INPB) Typing S. flexneri IV sera (DS) Study of agglutination assay with: Grouping 3,4 sera (INPB & DS) Grouping 6 sera (INPB & DS) Grouping 7,8 sera (INPB & DS) AA479 antisera MASF IV-1 antisera Biochemical assays: Acetate / mannitol / Indol Resistant to: AMP-SXT Results of PCR a ssays gtriv gtrx set1-b sen 4a + + + - - - - - / + / - S / S + - - - 4a + + + - - - - - / + / - S / S + - 4a + + + - - - / - / + R / R + - Y - - - - - - / + / - S / S - + Y - - - - NR - / + /- S / R - + Y - - - - - - / + /- S / S - - X - - - - - - / + /- R / R X - - - - - - / + /- R / R atypical - + NR - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + NR - / + / + R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + + - / + / + R / R atypical - + + - / + / + R / R atypical - + NR - / + / - S / S atypical - + NR - / + / - R / R atypical - + NR - / + / - R / R atypical - + NR - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + NR - / + / - R / R atypical - + + - / + / - R / R atypical - + NR - / + / - R / R NR: no determinado Mab MASF IV-1, Dr Kaisar Talukder, icddr,bangladesh - - - -

Diapositiva 18 m5 mpichel, 03/06/2013 m6 mpichel, 03/06/2013

Bases de la seroconversión en S. flexneri para diseño de PCR La adición de residuos glucosil, acetil o fosfoetanolamina a los ázúcares del antígeno-o resulta en determinantes antigénicos: de tipo (I, II, III, IV, V,VI) específicos de un serotipo de grupo (3,4; 6; 7,8; E1037) pueden estar presentes en mas de un serotipo. * En su conjunto definen un serotipo y subserotipo Gwen E. Allison and Naresh K. Verma, 2000, Trends in Microbiology

Serotipificación molecular: *Validación PCR Múltiple, con grupo colaborativo de trabajo compuesto por 5 laboratorios de referencia (USA, Inglaterra, Bangladesh, China, Hong Kong y Argentina). Set de muestras ensayadas incluyó aislamientos de distintas regiones y autóctonos de cada país. PCR múltiple para la identificación de todos los serotipos descriptos al 2014, incluyendo la variante de S. flexneri X (AA479) Ye et al, JCM, 2012

Desde el LRN: Flujograma de PCR múltiple para serotipos de Sh. flexneri ( en desarrollo y validación ) PCR 1: a) Primer MIX 1: Target gene Amplicon size (bp) Contentración en la Mix de primers Concentración en la reacción Serotype specificity wzx 1-5 782 2 µm 0.2 µm Todos excepto 6 gtri 1122 2 µm 0.2 µm 1a, 1b, 1c gtrii 1272 2 µm 0.2 µm 2a, 2b oac 604 2 µm 0.2 µm 1b, 3a, 3b, 4b gtriv 378 2 µm 0.2 µm 4a, 4av, 4b gtrv 905 2 µm 0.2 µm 5a, 5b PCR 2: b) Primer MIX 2: Target gene Amplicon size (bp) Contentración en la Mix de primers Concentración en la reacción Serotype specificity gtrx 425 2 µm 0.2 µm 2b, 3a, 5b, X, Xv gtric 518 2 µm 0.2 µm 1C (propuesto como serotipo 7) lpt-o 1098 4 µm 0.4 µm Xv,Yv,4av

PCR como técnica alternativa al flujograma diagnóstico de Shigella flexneri Validación intralaboratorio con cepas controles y autóctonas recibidas en el LRN

Implementación de PCR Múltiple para Shigella flexneri PCR 1 gtrii 1272 pb oac604 pb gtriv378 pb gtri 1122 pb gtrv905 pb Wzx1-5 782 pb PCR 2 lpt-o 1098 pb gtric 518 pb gtrx425 pb M marcador de peso molecular 100 pb

Cepas control para PCR Múltiple para S. flexneri (validación interlaboratorio) PCR 1 (arriba) y PCR 2 (abajo) Calle Amplicons sizes Strain Controles Genes (bp) 2 S. flexneri 1b CDC_China 45 gtri, wzx1-5, oac 1222, 782, 604 3 S. flexneri 2b CDC_China 46 gtrii, wzx1-5, gtrx 1272, 782, 425 4 S. flexneri 4b CDC_China 47 wzx1-5, gtriv, oac 782, 604, 378 5 S. flexneri 5a CDC_China 48 gtrv, wzx1-5, oac 905, 782, 604 7 S. flexneri CDC_China 49 lpt-o, wzx1-5, gtrx, 1098, 782, 425 Xv 8 S. flexneri Ic HPA, UK_1C gtri, wzx1-5, gtric 1122, 782, 518 9 S. flexneri 6 CDC_China 50 wzx6 739

Estudios epidemiológicos señalan al agua como fuente de infección, vegetales crudos, frutas, mariscos, manipulador de alimentos, etc. Sobrevida en el agua es limitada (horas a días), depende de la cantidad de contaminación, temperatura del agua (susceptible a clorinación, luz UV ) Requerimiento de Técnicas sensibles para la detección en muestras de agua

Métodos rápidos: Ensayos de PCR estandarizados para Shigella spp. para muestras Nombre de la Técnica PCR Shigellaspp. / EIEC (E. coli enteroinvasivo) Blanco Método Tipo de muestra Requerimientos. Tiempo de procesamiento ipah ( Antígeno plasmídico de invasión) (Hartman et al,1990) PCR simple Prueba de tamizaje Muestras de agua y cepa aislada Detección en muestras de agua a partir de caldo de enriquecimiento GN, luego de 18 h de incubación a 37 C Detección preliminar del aislamiento a partir de TSA, luego de 24 h de incubación a 37 C Especificidad / Sensibilidad E: Shigellaspp. /EIEC

PCR a partir de caldo GN el gen ipah * codifica una proteína involucrada en el proceso de invasión de las células epiteliales y está presente en varias copias en el plásmido de 140 MDa de Shigella spp. y a nivel cromosomal, presente en aislamientos de E. coli enteroinvasivo (EIEC) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M ipah 619 pb Fig 1. Gel de electroforesis de PCR ipah a partir de caldo de enriquecimiento de muestras de agua inoculadas experimentalmente. Calle 1: agua sin inocular, Calle 2: 1-10UFC (fallo amplificación, pero en este punto tuvimos problemas con el filtro y perdimos muestra), Calle 3: 10-100 UFC, Calle 4: 100-1000 UFC, Calle 5: Shigella flexneri 4a (1944/06), cepa Control positivo, Calle 6: agua sin inocular, Calle 7: 1-10UFC con tritón (fallo amplificación), Calle 8: 10-100 UFC con tritón, Calle 9: 100-1000 UFC con tritón, Calle 10: Shigella flexneri 4a (1944/06), cepa Control positivo., Calle 11: Shigella flexneri, cepa control positivo, Calle12: Shigella flexneri, cepa Control positivo, Calle13: Shigella flexneri, cepa control positivo, Calle 14: Control de reactivos

* Se notificaron al LRN 2009 al 2014: Brotes: 17 de Shigella sonnei y 14 de Shigella flexneri De los brotes estudiados se recuperó de: crema de almendras y se sospechó de agua de red, verdura entre otros. 2009 Se implementó un estudio prospectivo para detección temprana de brotes en colaboración con la Univ de Harvard, USA (Proyecto MIDAS) en seis provincias de la región centro-sur.

* En Desarrollo y proyectos futuros La transferencia en el marco de la RND de una PCR validada para serotipificación molecular de Shigella flexneri ( 2, 1, 3, 4, 5 y 6,variante X e Y ;inclusive plásmido gen lpt-o; S. flexneri AA479). Incorporación de S. flexneri atípica en la taxonomía con una nueva nomenclatura según consenso a nivel internacional: Shigella flexneri nomenclature updated. Scheme for serotypes designation based on the use of monoclonal and polyclonal antisera and PCR. Proposals of Dr. Kaisar, Dr. Xu and Dr. Sun to be discussed by the working group Aug, 2014 Shigella flexneri Xb? Secuenciación de nuevas variantes emergentes

Los aislamientos presentaron un perfil fenotípico atípico para S. sonnei, negativos para la prueba de ONPG (o-nitrofenil-β-d-galactopiranósido) Shigella sonnei, recuperados de Febrero y Marzo del 2013 en la ciudad de Trelew, provincia de Chubut. PFGE-XbaI PFGE-XbaI 90 100 Nº aislamiento Origen Fecha aislamiento Sexo Nº patrón Tipificación SS418/13 SS419/13 SS200/13 SS202/13 SS206/13 SS207/13 SS413/13 SS414/13 SS415/13 SS416/13 SS417/13 SS424/13 SS425/13 SS426/13 SS420/13 SS204/13 SS423/13 Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool Stool 2 013-03- 03 2 013-03- 04 2 013-03- 16 2 013-02- 13 2 013-02- 17 2 013-02- 19 2 013-02- 25 2 013-02- 27 2 013-02- 28 2 013-02- 28 2 013-03- 01 2 013-03- 12 2 013-03- 13 2 013-03- 16 2 013-03- 04 2 013-02- 15 2 013-03- 09 MAL E MAL E FEMALE MAL E MAL E MAL E MAL E MAL E MAL E MAL E MAL E FEMALE MAL E FEMALE FEMALE FEMALE MAL E 3 2 2 2 4 7 4 8 5 7 8 8 6 12 5 4 11 ARJ16 X01.0078 ARJ16 X01.0078 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0047 ARJ16 X01.0406 ARJ16 X01.0408 ARJ16 X01.0407 B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) Figura 1. Dendograma de relación genética de aislamientos de S. sonnei ONPG (neg) de origen humano recuperados en Trelew en febrero y marzo de 2013. Se recuadran los aislamientos con el mismo patrón de PFGE. PFGE con XbaI. B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) B gal (-) El patrón ARJ16XO1.0047, 14% de frecuencia en la BDN, subtipo genético que incluyó aisl. de distintas provincias del país y de distintos años, entre ellas Catamarca 2012; Buenos Aires 2008,2011 y 2012; Córdoba 2010 y 2012; La Pampa 2009; Neuquén 2009; Salta 2005; Jujuy 2011 y Río Negro 2009.

S. sonnei asociados a un brote familiar: PFGE demostró la relación genética entre los aislamientos, confirmó el estudio epidemiológico que evidenció la exposición de los pacientes a una misma fuente de infección: Aislamiento de la cubierta de crema de almendras (una rosca vienesa de elaboración artesanal) PPFG E-XbaI Nº aislamiento Ciudad Origen F. aislamiento Patrón XbaI SS1392/12 Lujan 2012-07-09 ARJ16X 01.0370 SS1393/12 SS1394/12 SS1395/12 SS1396/12 SS1397/12 Lujan Lujan Lujan Lujan Lujan Food 2012-07-09 2012-07-12 2012-07-12 2012-07-12 2012-07-08 ARJ16X 01.0370 ARJ16X 01.0370 ARJ16X 01.0370 ARJ16X 01.0370 ARJ16X 01.0370 Figura 1. Dendograma de relación genética de aislamientos de S. sonnei recuperados en Luján en julio de 2012 con XbaI. Todos los aislamientos mostraron 100% de similitud. Esto fue posible por la oportunidad en la investigación del brote y en la toma de muestras

Figure. Dendrogram showing the genetic relatedness of S. sonnei SXT resistant isolates included in the Event 7. Evento en la comunidad Figure 3. Dendrogram showing the genetic relatedness of S. sonnei SXT resistant isolates included in the Event 7. Isolates recovered in Santa Rosa, La Pampa in January February 2010. The rectangle highlights the 7 S. sonnei isolates with an indistinguishable PFGE pattern which had not previously been recorded in the National Data Base (NDB). The remaining 7 isolates identified statistically and epidemiologically as part of Event 7, exhibited high genetic relatedness (from 91.4 to 97.4% similarity, 1 to 3 bands of difference) to the most frequent pattern within the event, confirming the relation of the cases. http://www.plosntd.org/article/info:doi/10.1371/journal.pntd.0002521