Estudio de caso 1: Frijol común Genéticamente Modificado Resistente al Mosaico Dorado Evento Embrapa 5.1 (EMB-PVØ51-1) Promoventes ante la Comisión Técnica Nacional de Bioseguridad de Brasil (CTNBio, Brasil) Documento preparado por: Francisco José Lima Aragão (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) & Josias Corrêa de Faria (Embrapa Arroz e Feijão) Diciembre de 2010 RESUMEN La Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa) desarrolló una línea de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) genéticamente modificada (GM), en adelante denominada Embrapa 5.1. El evento Embrapa 5.1 en frijol, fue generado con el uso de la estrategia de ARN interferente o de interferencia (RNAi) y es altamente resistente al virus del mosaico dorado del frijol [cuya nomenclatura oficial en lengua inglesa es Bean golden mosaic virus (BGMV)]. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y JUSTIFICACIÓN El evento Embrapa 5.1 se obtuvo a partir de la inserción de transgenes en el genoma nuclear utilizando el método de biobalística descrito por Aragão et al. (1996). Para la obtención de resistencia al virus se insertó un gen quimérico para la expresión de un ARN que contiene un par de fragmentos del gen rep (AC1) del BGMV, colocados en sentido y antisentido pero intercalados por un intrón. Ese RNA fue diseñado para formar un transcrito con secuencias de ARN bicatenario (double stranded, o dsrna) que son reconocidas por un complejo molecular de la célula, el cual genera pequeños fragmentos de ARN (small, interfering o sirna) los cuales interfieren con la expresión del gen rep viral (cf. Tabla XX). Como consecuencia de la falta de expresión del gen rep, la replicación viral se ve comprometida y las plantas se vuelven resistentes a la virosis. En adelante, el casette (módulo) de expresión del ARN en horquilla ( hp por hairpin que forma dsrna) será llamado ΔAC1hpRNA. Para la selección de los brotes genéticamente modificados originados de células apicales de embriones cigóticos de frijol, se insertó el gen AtAhas de Arabidopsis thaliana (también llamado csr1.2; AtAhas será la denominación aquí), junto a su propio promotor y la región 3 no traducida (3 UTR) nativa. El gene AtAhas codifica para la subunidad mayor de la enzima aceto-hidroxiácido sintasa (AHAS), también llamada acetolactato sintasa, que confiere tolerancia a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas. Aunque el evento Embrapa 5.1 presenta copias íntegras del gen AtAhas, se verificó que las plantas no tuvieran una tolerancia significativa a este tipo de herbicidas. La tolerancia es suficiente apenas para permitir la selección in vitro de los brotes generados a partir de células transformadas, originados a partir del meristemo apical de embriones de frijol. Los análisis genéticos y moleculares mostraron que los transgenes fueron insertados en un único locus del genoma nuclear y que se han mantenido estables por varias generaciones de 1
autofecundación, y después de cruzas y retrocruzas con variedades comerciales no modificadas genéticamente (no-gm). En este evento, no se encontraron secuencias funcionales del gen bla de E. coli que codifica para una beta-lactamasa (la cual confiere resistencia a compuestos betalactámicos como la ampicilina que es usada como marcador de selección bacteriano). Esto era lo que se esperaba, ya que el vector pbgmvrnaiahas, utilizado en la transformación del frijol, fue digerido con la enzima de restricción FspI. Como el sitio de restricción que corta esa enzima se encuentra dos veces dentro del vector y al interior de la secuencia del gen bla, la digestión del vector resulta en la inactivación del gen marcador. El evento Embrapa 5.1 ha sido la base para el desarrollo de variedades comerciales de frijol de diversos grupos para cultivo en Brasil. El aprovechamiento de las variedades de frijol común Embrapa 5.1 GM será una importante herramienta para el control del mosaico dorado en Brasil y posiblemente, en otros países de América Latina. Como se ha mencionado anteriormente, el mosaico dorado es causado por el BGMV, el cual se transmite por poblaciones plaga de mosquita blanca (Bemisia tabaci, Genn.) presentes en todas las regiones del continente donde se cultiva el frijol. Los síntomas de esta enfermedad son: el aspecto en mosaico de las hojas, enanismo y/o superbrotación en las plantas. Además de esto, las plantas infectadas precozmente, tienden a alargar su ciclo vegetativo, hecho relacionado a la brotación excesiva de flores. Las vainas, cuando se desarrollan, presentan deformaciones o un tamaño reducido, con semillas subdesarrolladas, lo que afecta la calidad final del grano y su valor comercial. Cuando se presenta la enfermedad, las pérdidas estimadas en la producción de granos puede variar de 40 a 100% dependiendo de la incidencia, la época de cultivo y el cultivar (Costa,1987). Las pérdidas anuales en Brasil al menos, oscilan entre 90 y 280 mil toneladas de grano, cantidad que sería suficiente para alimentar a entre 6 y 20 millones de brasileños adultos. Adicionalmente, se considera que en varias regiones Brasil, por lo menos unas 200 mil hectáreas son actualmente inviables para el cultivo de frijol durante el ciclo agrícola de secas. La búsqueda de cultivares resistentes al mosaico dorado fue iniciada en la década de los 70s habiendo sido encontrados apenas bajos niveles de tolerancia a la enfermedad. No existe, ni en Brasil ni en México o Centroamérica, una variedad con un nivel adecuado de resistencia al mosaico dorado; tampoco se ha observado inmunidad a la enfermedad dentro del género Phaseolus. Hay tolerancia en cultivares de origen mesoamericano, especialmente vs. el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), pero no inmunidad. Como consecuencia de esta falta de un alto nivel de resistencia genética, el control del mosaico dorado se ha hecho dependiente de prácticas culturales para el manejo de la enfermedad por métodos de control químico del vector (mosca blanca). El principal método de control de la mosca blanca continúa siendo el químico. Se ha registrado un número aproximado de 23 principios activos para el control de la mosca blanca en frijol, aunque, pocos de ellos han mostrado ser eficientes. En pruebas realizadas en condiciones controladas, los principios activos en los grupos de los organofosforados, los piretroides, carbamatos, han sido eficientes para el control de adultos de mosca blanca B. tabaci raza A, pero ineficientes para B. tabaci raza B. Los insecticidas del grupo de los neonicotinoides han sido eficientes en el control de adultos de mosca blanca B. tabaci raza B. Los principios activos thiamethoxan, acetamiprid e imidacloprid fueron los más eficientes en el control de la mosca blanca B. tabaci raza B. Las formulaciones de thiametoxan y de imidacloprid se utilizan en el tratamiento de semillas y en pulverizaciones. Actualmente, en pruebas realizadas con pulverizaciones de neonicotinoides, se ha verificado una reducción acentuada de la eficiencia y del efecto residual para el control de adultos. Este hecho tiene como causa principal, la exposición continua de las poblaciones de mosca blanca a los 2
neonicotinoides, continuamente utilizados para su control. Por otro lado, en ocasiones se recomienda como una medida preventiva al tratamiento de semillas y pulverizaciones secuenciales con adulticidas, el establecimiento de un cultivo de frijol con probabilidad de ser infestada por moscas blancas provenientes de otros cultivos como la soya. En áreas de cultivo continuo de frijol, esta misma recomendación, no tendría el efecto esperado, porque se presenta una migración de adultos portadores del virus de mosaico dorado. El insecticida actúa con eficiencia en el control de adultos de mosca blanca, pero no es capaz de evitar la transmisión del virus. Además de ello, la aplicación continua de insecticidas ocasiona la elevación en los costos de producción. INOCUIDAD Y EFECTOS EN SALUD ANIMAL o HUMANA La inocuidad para el consumo humano y animal de los transgenes expresados en el evento Embrapa 5.1 fue evaluada por varios estudios que confirmaron que la composición de este es sustancialmente equivalente al del su tipo parental, y similar al de otras variedades de frijoles cultivados en Brasil. También se llevaron a cabo estudios de alimentación con animales que no mostraron alteraciones comparados con grupos testigo que fueron alimentados con el frijol cv. parental Olathe. El frijol es fuente de fibra, proteína y hierro. Por tanto, se realizó un análisis extenso de composición de granos colectados en las localidades cultivadas de Paraná, Goiás y Minas Gerais en el año de 2008, y sólo de los dos últimos en 2009. Los granos fueron colectados y sometidos a un análisis de composición para la determinación del contenido de azúcares, de vitaminas (B 1 y B 2 ), minerales (aluminio, calcio, cobre, hierro, fósforo, magnesio, manganeso, potasio, zinc); de aminoácidos (triptófano, cisteína, metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, glicina, histidina, arginina, treonina, alanina, prolina, tirosina, valina, lisina, isoleucina, leucina, fenilalanina). Paralelamente, se determinó también el % de humedad, cenizas, proteína total, extracto etéreo, así como de la concentración de ácido fítico y de inhibidores de tripsina. En razón de no tener disponible información sobre el contenido de factores nutricionales y anti-nutricionales presentes en granos de frijol cultivados en Brasil, se generó un una base de datos para este cultivo utilizando las variedades BRS Valente, Diamante Negro, Pérola, Timbó y Olathe (parental del evento Embrapa 5.1), cultivados en distintos ciclos de los años 2003 a 2007 en municipios de los estados de Goiás, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná y Rio Grande do Sul. Tal estudio mostró que los niveles de estos componentes son similares entre la variedad GM, su parental y las otras cuatro variedades convencionales cultivadas en Brasil. Sea analizó asimismo, el perfil protéico de los granos de las variedades GM y no-gm cultivados en localidades agrícolas de los tres estados mencionados. Las principales proteínas presentes en granos maduros de frijol fueron identificadas y los resultados revelaron que el patrón es el mismo tanto entre las variedades como entre localidades. En hojas de frijol GM cultivados en tres localidades de Brasil (Londrina, estado de Paraná [PR]; Santo Antônio de Goiás, estado de Goiás [GO] y en Sete Lagoas, estado de Minas Gerais [MG]), fueron detectados los ARN pequeños de interferencia (sirna) codificados por el transgén insertado. Tales sirna son el resultado de la expresión del inserto ΔAC1hpRNA, que produce una horquilla de ARN bicatenaria (dsrna) que no es traducida, pero que es procesada por componentes macromoleculares de la célula para la formación de dos especies de sirna. Más aún, los sirna se encontraron en hojas, pero se detectaron a niveles traza en las semillas frescas; en semillas cocidas no fue posible detectar sirna. Más adelante, los análisis in silico e in planta no mostraron ninguna señal de efecto off-target (ectópicos; es decir, el silenciamiento no intencional de otros genes en leguminosas, humanos y animales) y se descarta la posibilidad de 3
alteración bioquímica de las plantas, tal y como pudo ser observado por los análisis de caracterización agronómica y los análisis de composición nutricional. En relación a la inocuidad, los animales alimentados con sirna aislados de hojas de frijol GM no mostraron ninguna alteración bioquímica o de desarrollo en relación a los controles. Aunque la expresión del gen AtAhas fue muy reducida, a juzgar por la dificultad de detectar la proteína AtAHAS en tejidos de hoja y semillas del frijol Embrapa 5.1, los análisis realizados tanto in sillico como in vitro mostraron que esa proteína no tienen ningún potencial de alergenicidad. La predicción del potencial alergénico de las proteínas AtAHAS y SEC61 (de cuya secuencia tampoco se detectaron transcritos) requirió un análisis in silico que reveló que no tienen identidad con alergenos conocidos. Adicionalmente, la comparación de las proteínas AHAS de A. thaliana y de Phaseolus vulgaris mostró una similitud en secuencia de aminoácidos del 83% y de 98-100% en las regiones catalíticas, característica de la superfamilia de las enzimas dependientes de tiamina difosfato (ThDP). Recientemente la CTNBio en Brasil, aprobó el evento BPS-CV127 de soya genéticamente modificada la cual es tolerante a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas, debido a la expresión del gen AtAhas (con el mismo fragmento de expresión usado para la generación del evento de frijol Embrapa 5.1). En este proceso, quedó demostrado experimentalmente que las proteínas AtAHAS e SEC61 no poseen características de proteínas tóxicas ni alergénicas. Para complementar esto, debe mencionarse que esas proteínas están presentes en plantas (de una forma general), y no existen antecedentes de alergenicidad para la especie donadora del gen (A. thaliana). EQUIVALENCIA AGRONÓMICA La caracterización agronómica del evento Embrapa 5.1 cultivado en tres regiones de Brasil por un período de dos años, no derivó en ninguna alteración fenotípica del frijol Embrapa 5.1, cuando fue comparado con su cultivar parental Olathe. Tampoco se observaron diferencias en la germinación de las semillas, sometidas o no a un proceso de almacenamiento/ envejecimiento. Cuando se cultivaron plantas de frijol GM y no-gm en suelos de baja y alta fertilidad, no se observaron diferencias significativas en los parámetros agronómicos, reflejando que en esas condiciones, no hubo una alteración en la absorción de nutrientes. Cuadro 1. Análisis de la equivalencia agronómica entre las líneas de frijol Embrapa 5.1 (GM, BGMV R,) y el parental convencional cv. Olathe (no-gm, BGMV S ), en tres localidades de cultivo en Brasil. Tomado de: Aragão & Faria (2009), Nat. Biotech 27 (12): 1086-8. Goiás Minas Gerais Paraná Característica Convencional Frijol G M Convencional Frijol G M Convencional Frijol G M Rendimiento (Kg/ Ha) 770.8 628.1 2,460 2,476 2,268 2,344 Germinación de 86.9 91.4 87.9 85.4 75.2 86.2 semillas (%) Altura inicial de 10.4 10.2 13.6 13.5 9.9 9.7 plantas (cm) Anchura de hojas (cm) 6.8 6.7 7.4 7.3 6.4 6.3 Peso de 100 27.3 29.7 31.0 32.1 31.4 32.7 4
semillas (g) Tiempo a floración 31 31 32 32 30 30 (dd-germ) Semillas por vaina 5.8 5.7 5.3 5.4 5.6 5.7 El análisis estadístico indicó la ausencia de diferencias significativas entre las líneas transgénicas y controles (P < 0.05; intervalo de prueba de Tukey-Studentizado, n=48). Se verificó asimismo, que el evento Embrapa 5.1, que posee copias íntegras del gen AtAhas, no tuviera en campo, una tolerancia significativa a los herbicidas de selección. Su tolerancia debe ser apenas suficiente para permitir la selección in vitro de brotes generados a partir de células transformadas, derivadas a su vez, de meristemos apicales de embriones de frijol. El evento Embrapa 5.1 no presenta tolerancia a dosis equivalentes a 1/10 de la utilizada comercialmente. Consecuentemente el evento no podrá ser utilizado como alternativa tecnológica el para el control de maleza. RIESGO AMBIENTAL La evaluación de riesgo ambiental del evento de frijol Embrapa 5.1 implicó realizar múltiples estudios con la intención de analizar posibles efectos sobre diversos organismos que interaccionan con la planta en condiciones de campo. Los ensayos se realizaron en condiciones de invernadero y de parcela experimental en tres regiones de Brasil durante un período de dos años. Se determinó en primera instancia, la estructura así como la fluctuación poblacional de artrópodos asociados a las parcelas cultivadas con frijoles Embrapa 5.1 y convencional, tanto en la parte aérea como en la superficie del suelo. Las especies conocidas como plagas y enemigos naturales más comunes de los sistemas de producción de frijol, se identificaron visualmente utilizando los manuales correspondientes. En tales estudios fueron observadas pocas diferencias dentro de las comunidades de artrópodos en la superficie del suelo entre ambos tratamientos, lo que permite concluir que el evento Embrapa 5.1 no causa ningún efecto sobre la diversidad de artrópodos en esta zona. También se condujeron análisis cualitativos y cuantitativos complementarios sobre la macro e mesofauna (de especies más abundantes en suelos bajo influencia del frijol Embrapa 5.1). Los grupos de macrofauna más abundantes fueron: hormigas, larvas y adultos de coleópteros, larvas de dípteros, isópteros y oligoquetos. La comunidad de mesofauna del suelo tuvo al grupo de los ácaros como el más representativo. (Otros grupos importantes fueron: Formicidae, Collembola, larvas de Coleoptera e larvas de Diptera. El número medio de unidades taxonómicas por muestra o la diversidad promedio en cada grupos presentó una variación significativa en función de la localidad, tanto para macrofauna como para mesofauna del suelo. No obstante, no se observaron diferencias significativas en ambos tipos de comunidades, entre los suelos cultivados con frijol convencional y los del transgénico Embrapa 5.1, en cada localidad individual de ensayo. Otras evaluaciones comparativas de relevancia ecológica, incluyeron las siguientes: a) Los posibles efectos sobre Zabrotes subfasciatus, que es el principal gorgojo que ataca los granos de frijol almacenado en las regiones más cálidas de los trópicos. Para ello se estimó el efecto del frijol Embrapa 5.1 sobre el desarrollo biológico de 10 generaciones del gorgojo Z. subfasciatus. Este experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de entomología de Embrapa Arroz e Feijão, en Santo Antônio de Goiás, GO. Los resultados demuestran que este evento biotecnológico no interfiere con los parámetros de desarrollo biológico de Z. subfasciatus. 5
b) Estudios para determinar la producción de materia seca y acumulación de nitrógeno. Se concluyó que la producción de materia seca por las plantas de frijol varió entre los tratamientos dependiendo sólo del suelo de las diferentes localidades analizadas. c) La comparación de los dos genotipos (evento Embrapa 5.1 y su parental Olathe) mostraron un comportamiento similar frente a condiciones de estrés. Los resultados coinciden con el análisis de los mecanismos de defensa antioxidante a través de las enzimas: catalasa, ascorbato peroxidasa e superóxido dismutasa (SOD), así como las mediciones de daño celular (peroxidación lipídica) y daños a proteínas, utilizando extractos de hojas de frijol GM (Embrapa 5.1) y su parental no-gm (Olathe). En estos casos también, los resultados no mostraron diferencias entre los genotipos. d) La nodulación y dependencia por fijación biológica de N 2 por las raíces en plantas de frijol se revisó también y no se encontraron cambios significativos entre los genotipos comparados. e) Se estudió también la asociación de una comunidad de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) y las raíces de las plantas de frijol, por medio de: el análisis de la densidad de esporas de HMAs (hongos micorrízicos arbusculares) en la rizosfera de las plantas; la colonización de las raíces por HMA nativos y el número de especies de HMAs identificadas en la rizosfera, es decir, el censo de especies dentro de la comunidad de de HMAs nativos. De una manera general, no se observaron diferencias significativas entre el frijol Embrapa 5.1 y su cv. parental Olathe no-gm, lo que indica la ausencia de alteraciones en la capacidad de micorrización debido a la modificación genética derivada del evento en cuestión. f) Se efectuó también un análisis cualitativo y cuantitativo de los microrganismos en suelo bajo influencia del frijol Embrapa 5.1. Los análisis del perfil de alfaproteobacterias en la rizósfera de plantas de frijol, se realizaron en parcelas experimentales en las localidades referidas de Paraná, Goiás y Minas Gerais. A través de los dendrogramas generados utilizando DDGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), fue posible observar que no hay cambios importantes en los agrupamientos de secuencias formados entre ambas comunidades microbianas. g) Los estudios de actividad enzimática del suelo en el cual fue cultivado el evento Embrapa 5.1 en distintas regiones de Brasil, no permitirán observar diferencias estadísticas entre las muestras de frijol transgénico transgénico Embrapa 5.1 y el convencional (Olathe) com respecto a las actividades de las enzimas: aril-sulfatasa (conjunto de enzimas del ciclo del azufre), fosfatasa ácida y beta-glucosidasa. La rizósfera es la porción del suelo que sufre influencia directa de la planta ocasionada por los exudados que produce. Las alteraciones en el patrón de actividad enzimática del suelo representada por un grupo de enzimas determinadas (i.e., fosfatasa ácida, beta-glucosidasa y aril-sulfatasa), podrían ocurrir como consecuencia de la influencia de la planta sobre la actividad biológica de la rizósfera. Las actividades de las enzimas claves del suelo, han sido utilizadas para investigar una posible integración ente los procesos bioquímicos y la calidad del suelo, reflejada en el estatus biológico del suelo. Las enzimas del grupo de las beta-glucosidasas son producidas por una variedad de organismos, entre ellos, animales, plantas, hongos y bacterias. La beta-glucosidasa es una enzima que actúa en la etapa final del proceso de descomposición de celulosa, por la hidrólisis de los residuos de celobiosa, y las alteraciones en su actividad pueden tener, por tanto, influencia sobre la calidad del suelo. Por los resultados encontrados, en los estudios con las variedades de frijol, se puede concluir que la modificación genética que confiere resistencia al mosaico dorado, no implican una alteración sensible y consistente capaces de influenciar las actividades enzimáticas claves en la dinámica del C, S y P, en la rizósfera de frijol. 6