Dako GenPoint TM Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes Nº de catálogo K0620 10 ml Licencia de uso limitado GenPoint utiliza tecnología desarrollada por y bajo licencia de PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. (Patente estadounidense N 5.196.306). Este producto se distribuye y vende al usuario final conforme a una licencia de PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. para su uso por parte del usuario final para el procesado manual o automatizado en instrumentos Dako, únicamente sobre portaobjetos de cristal para microscopio u otro soporte (siempre que no sean microarrays o bio-chips) que contengan muestras de células o tejidos para su estudio mediante microscopía (incluidos los sistemas automáticos de captura y análisis de imágenes) con el propósito de detectar ácidos nucleicos o proteínas diana. Su adquisición no incluye ni supone ningún derecho de reventa o transferencia de este producto, bien sea de forma individual o como componente de otro producto. Queda terminantemente prohibido cualquier uso de este producto diferente al que indican los términos de esta licencia sin la autorización expresa y por escrito de PERKIN ELMER/NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro. Estas instrucciones se aplican a GenPoint Tyramide Signal Amplification System for Biotinylated Probes. GenPoint (nº de catálogo K0620) es un sistema de amplificación de señal altamente sensible para la detección de sondas biotiniladas en preparaciones de tejidos y células. Es compatible con todo tipo de sondas biotiniladas y se puede utilizar para amplificar la señal de hibridaciones de ADN o de ARN. Los especímenes y las sondas biotiniladas debe suministrarlas el usuario. Procedimiento GenPoint 1. Hibridación con sonda biotinilada. 2. Aplicación del conjugado primario con estreptavidina-hrp (Primary Streptavidin-HRP Conjugate). 3. Aplicación del sustrato de tiramida (reactivo amplificador) (Tyramide Substrate). 4. Aplicación del conjugado secundario con estreptavidina-hrp (Secondary Streptavidin-HRP Conjugate). 5. Conversión DAB. (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 1/7
Resumen y explicación Reactivos suministrados Los métodos de hibridación in situ (ISH, en sus siglas inglesas) utilizan sondas marcadas para localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos a nivel subcelular. La biotina se utiliza habitualmente para marcar las sondas para la detección no radioactiva 1-6. Existen diversos modos de visualización de la biotina mediante avidina o estreptavidina, la cual presenta una afinidad muy elevada de unión a la biotina. 7 Las estrategias habituales de detección de la biotina utilizan enzimas con estreptavidina, de modo que se produce una señal de tinción por precipitación a partir del sustrato enzimático cromogénico. El sistema GenPoint crea un nivel de amplificación adicional para la detección de la biotina. Tras una unión inicial de la estreptavidina-peroxidasa a la sonda biotinilada, la peroxidasa cataliza la oxidación de la biotinil tiramida 8, con la formación inmediata de enlaces covalentes con los grupos aromáticos de la muestra. Esta reacción deposita grandes cantidades de biotina en el sitio de la hibridación. Esta biotina adicional se utiliza a continuación para capturar más estreptavidina-peroxidasa. El ciclo de amplificación de estreptavidina-peroxidasa > biotinil tiramida > estreptavidina-peroxidasa puede repetirse nuevamente para incrementar la presencia de la biotina. La señal se revela finalmente al incorporar un indicador cromogénico de diaminobenzidina (DAB), que se oxida por las enzimas de peroxidasa, formándose un precipitado marrón oscuro en el sitio de la hibridación. El kit contiene reactivos suficientes para 65 portaobjetos en un solo ciclo de amplificación. Cantidad Descripción 30 ml Concentrado de lavado astringente 0,2 ml Concentrado de estreptavidina-hpr primaria 15 ml Diluyente de estreptavidina-hpr primaria 10 ml Solución de biotinil tiramida 10 ml Estreptavidina-HRP secundaria 0,2 ml Concentrado de cromógeno DAB 10 ml Solución tampón de sustrato DAB Material necesario pero no suministrado Sondas biotiniladas Hybridizer (S2450 o S2451, 110V o 220V) Target Retrieval Solution (nº de catálogo S1699 o S1700) Proteinase K (nº de catálogo S3004 o S3020) o Pepsin (nº de catálogo S3002) Se recomienda la solución tampón TBST Tris-Buffered Saline/Tween-20 (nº de catálogo S3306) como tampón de lavado para tinciones automatizadas y manuales H 20 2 al 0,3% en metanol Soluciones de alcohol (al 95% y al 100%) Agua desionizada o destilada Medio de montaje, como Faramount (nº de catálogo S3025) o Glycergel (nº de catálogo C0563) Xilol o Histoclear Agente de contratinción (opcional); se recomienda Hematoxylin (nº de catálogo S3302) Recipientes de tinción o Coplin Portaobjetos silanizados o tratados para mejorar su adherencia; Dako suministra Silanized Slides aptos para su uso en ISH (nº de catálogo S3003) Placa u horno calefactor Incubadora Horno Baño de agua Cubreobjetos para hibridación (18 mm x 18 mm) Cubreobjetos para montaje (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 2/7
Paños absorbentes para limpieza Guantes Cámara húmeda para la incubación de portaobjetos Microscopio óptico estándar Precauciones 1. Para usuarios profesionales. 2. Este producto contiene azida sódica (NaN 3), un compuesto altamente tóxico en su forma pura. A las concentraciones en las que está presente en el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la NaN 3 acumulada puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando azidas metálicas altamente explosivas. En el momento de su eliminación, aclare con agua abundante a fin de evitar acumulaciones de azida en las cañerías 11,12. 3. Reduzca al mínimo la contaminación microbiana de los reactivos para evitar una tinción no específica. 4. Como con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben seguirse los procedimientos de manipulación apropiados. 5. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. 6. Cualquier solución no utilizada debe desecharse con arreglo a las normativas locales, provinciales y nacionales. 7. Los usuarios profesionales pueden solicitar una Hoja de datos de seguridad. Peligro Stringent Wash Concentrate: 1-5% Polyoxyethylene octyl phenyl ether; 1-5% Cloruro de sodio H318 Provoca lesiones oculares graves. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P305 + P351 + EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente P338 + P310 durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE INFORMACIÓN TOXICOLÓGICA o a un médico. Atención Primary Streptavidin-HRP Diluent: 10-30% Glicerol H320 Provoca irritación ocular. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P305 + P351 + EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente P338 durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. P337 + P313 Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Atención Biotinyl Tyramide:10-30% Glicerol H320 Provoca irritación ocular. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P305 + P351 + EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente P338 durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. P337 + P313 Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Almacenamiento Peligro DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Puede provocar cáncer. H341 Se sospecha que provoca defectos genéticos. P201 Procurarse las instrucciones antes del uso. P202 No manipular antes de haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. P281 Utilizar el equipo de protección individual obligatorio. P308 + P313 EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico. P405 Guardar bajo llave. P501 Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. Los reactivos del sistema GenPoint deben almacenarse en la oscuridad y a una temperatura entre 2 y 8 C. No congelar. (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 3/7
Preparación del reactivo Solución Tris-Buffered Saline/Tween (TBST) Diluya el concentrado TBST (nº de catálogo S3306) a razón de 1:10 en agua desionizada o destilada. La solución diluida se mantiene estable por un periodo de tiempo de hasta un mes si se almacena a una temperatura entre 2 y 8 C. Deseche la solución si tiene un aspecto turbio. Solución de lavado (Stringent Wash Solution) Diluya el concentrado de solución de lavado a razón de 1:50 en agua desionizada o destilada y caliente hasta alcanzar la temperatura adecuada en el baño de agua. Deseche la solución diluida que no se haya utilizado durante el proceso. Solución primaria de estreptavidina-hrp (Primary Streptavidin-HRP Solution) Diluya el concentrado primario de estreptavidina-hrp a razón de 1:100 en el diluyente de estreptavidina-hrp que se suministra, 30 minutos antes de su utilización. Deseche toda solución diluida que no se haya utilizado durante el proceso. Cromógeno DAB (DAB Chromogen) Diluya el concentrado de cromógeno DAB a razón de 1:50 en la solución tampón sustrato DAB (DAB Substrate Buffer) que se suministra. La solución de tampón sustrato diluida se mantiene estable por un periodo de tiempo de hasta un día si se mantiene a temperatura ambiente o hasta 5 días si se almacena a una temperatura entre 2 y 8 C. Procedimiento Procedimiento ISH Desparafinización Todos los especímenes incluidos en parafina deben desparafinarse para retirar el medio de inclusión y posteriormente rehidratarse antes de proceder a la hibridación in situ y la tinción de la muestra. Asegúrese de que no se realiza una retirada incompleta de la parafina, ya que la presencia de parafina residual aumenta la tinción no específica. La desparafinización puede realizarse calentando primero los cortes de tejido a 60 C en un horno durante 30 minutos para ablandar la parafina y posteriormente sumergiendo los portaobjetos en dos cambios de xilol o Histoclear durante cinco minutos cada vez. El xilol o Histoclear residual puede retirarse sumergiendo los portaobjetos en dos cambios de alcohol al 100%, seguidos de tres cambios de alcohol a 95% durante un minuto cada vez. A continuación, las muestras se rehidratan sumergiéndolas en varios cambios de agua. Tratamiento previo de la muestra Los especímenes de células o tejido preparados con fijadores que forman ligamientos cruzados, como el formol, requieren un tratamiento previo que proporcione a la sonda de hibridación acceso a las secuencias de ácido nucleico diana. El tratamiento previo de la muestra puede realizarse de acuerdo con alguno de los métodos que se citan a continuación: 1. Tratamiento previo para recuperación antigénica: sumerja los portaobjetos en solución para recuperación antigénica Target Retrieval Solution (nº de catálogo S1700) calentada previamente durante 20 40 minutos a 97 C (±2 C) y después deje que enfríen en la solución durante 20 minutos. Aclárelos con agua destilada para retirar todo resto de solución para recuperación antigénica. 2. Tratamiento previo con pepsina: sumerja los portaobjetos en Pepsin (nº de catálogo S3002) al 0,4%-0,8% (disuelva un paquete en 250 500 ml de ácido clorhídrico 0,2N) a 37 C durante 1 10 minutos y, a continuación, aclare los portaobjetos varias veces con agua destilada para retirar la pepsina residual. 3. Tratamiento previo con recuperación antigénica y pepsina: trate los portaobjetos con la solución para recuperación antigénica tal como se ha detallado anteriormente y sométalos a un tratamiento leve con pepsina. En general, es suficiente un tratamiento con pepsina al 0,005% 0,01% en ácido clorhídrico 0,2N durante 10 20 minutos a temperatura ambiente. 4. Tratamiento previo con Proteinase K: trate los portaobjetos con Proteinase K, RTU (nº de catálogo S3020) durante 10 30 minutos a temperatura ambiente. Aclare los portaobjetos varias veces con agua destilada para retirar la Proteinase K residual. La determinación de las condiciones de tratamiento previo óptimas, sea con recuperación antigénica, digestión con proteasa o una combinación de ambos métodos, debe determinarse para cada tipo de muestra. En la mayoría de los casos, es suficiente someter las muestras a recuperación antigénica o digestión con proteasa. En general, las muestras citológicas requieren un tratamiento menos agresivo que las muestras de tejidos. Las muestras preparadas con fijadores que no forman ligamientos cruzados, como la acetona, no suelen precisar tratamiento previo. Sin embargo si se considera necesario someter muestras de este tipo a tratamiento previo, éste debe ser lo más leve posible, dado que son preparaciones que pueden estropearse con facilidad. Se recomienda realizar el siguiente procedimiento con las muestras citológicas basadas en líquido: (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 4/7
Los portaobjetos se sumergen en alcohol al 50% durante 30 minutos, seguido de una fijación posterior en formol de tampón neutro al 10% durante 30 minutos. Seguidamente, se aclaran en varios cambios de agua desionizada y se incuban con Proteolytic Enzyme (nº de catálogo S3007) a temperatura ambiente durante 3 minutos. Después de la digestión enzimática, los cortes deben aclararse en varios cambios de agua desionizada, luego se sumergen en H 2O 2 al 0,3% en metanol durante 5 minutos, y seguidamente se aclaran con varios cambios de agua desionizada. Para reducir la tinción de fondo, se pueden incubar los cortes con el Biotin Blocking System (nº de catálogo X590). Aplique un inhibidor de avidina durante 10 minutos y después un inhibidor de biotina durante 10 minutos (aclárelos en varios cambios de agua desionizada antes y después de cada paso). Los portaobjetos deben mantenerse húmedos antes de aplicar la sonda. En las especificaciones de la sonda se incluyen las recomendaciones relativas a la hibridación y al lavado astringente. Siga las instrucciones indicadas a continuación con la siguiente excepción: diluya 1:100 1:300 estreptavidina primaria-hrp durante 15 30 minutos. Mitigación de la tinción de fondo Éste es un paso muy útil para reducir la tinción de fondo en ciertos tipos de tejido, eliminando la actividad endógena de unión a la estreptavidina y mitigando cualquier actividad de peroxidasa que pueda presentar una muestra. Un protocolo típico de este tipo supone la exposición del portaobjetos a H 2O 2 al 0,3% en metanol a temperatura ambiente durante como mínimo 20 minutos. A este paso debe seguirle el lavado en agua destilada durante 10 minutos. Hibridación y lavado astringente Las temperaturas óptimas de hibridación y lavado astringente para las sondas biotiniladas de Dako se describen en las instrucciones que se suministran con cada sonda. En el caso de que se utilicen sondas suministradas por el usuario, es éste quien debe determinar las temperaturas óptimas de hibridación y lavado astringente. Como regla general, la temperatura de hibridación óptima es 25 C inferior a la T M que se haya calculado, siendo T M la temperatura de fusión de la sonda hibridada. La temperatura del baño astringente se encuentra entre 10 y 20 C por debajo de la TM calculada. Puede encontrar las fórmulas para el cálculo de la T M en Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales de Biología Molecular). 10 Para sondas de cadena única y marn diana, es menor la necesidad de desnaturalizar los materiales antes de someterlos a hibridación. En el caso de sondas de cadena doble y/o ADN diana, es imprescindible someter el material a una desnaturalización. La desnaturalización de la diana y/o la sonda de ADN suele realizarse calentando la sonda y/o los portaobjetos a una temperatura entre 90 C y 95 C durante 5 minutos en una placa calefactora. Procedimiento de tinción Nota: puede obtener los protocolos para el uso de instrumentos de Dako del servicio técnico de Dako. PASO 1 ESTREPTAVIDINA-HRP PRIMARIA Antes de su utilización, el concentrado de estreptavidina-hrp primaria debe diluirse a razón de 1:100 en el diluyente de estreptavidina primaria (Primary Streptavidin-HRP Diluent) que se suministra. Prepare aproximadamente 150 µl de solución de estreptavidina-hrp primaria para cada portaobjetos. Tras su lavado astringente, aclare los portaobjetos varias veces en solución de lavado TBST. alrededor de la muestra para retirar cualquier resto de líquido. Añada 3 ó 4 gotas de solución de estreptavidina-hrp primaria (Primary Streptavidin-HRP) para cubrir la muestra e incúbela a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aclare los portaobjetos con la solución de lavado TBST y colóquelos en tres baños recién preparados de solución de lavado TBST durante 5 minutos cada vez, para retirar cualquier resto de la solución de estreptavidina-hrp primaria. PASO 2 BIOTINIL TIRAMIDA (REACTIVO DE AMPLIFICACIÓN) alrededor de la muestra para retirar cualquier resto de líquido. Añada 3 ó 4 gotas de biotinil tiramida para cubrir la muestra e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aclare los portaobjetos con la solución de lavado TBST y colóquelos en tres baños recién preparados de solución de lavado TBST durante 5 minutos cada vez para retirar cualquier resto de la solución de biotinil tiramida. PASO 3 ESTREPTAVIDINA-HRP SECUNDARIA alrededor de la muestra para retirar cualquier resto de líquido. Añada 3 ó 4 gotas de solución de estreptavidina-hrp secundaria (Secondary Streptavidin-HRP) para cubrir la muestra e incúbelo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aclare los portaobjetos con la solución de lavado TBST y colóquelos en tres baños recién preparados de solución de lavado TBST durante 5 minutos cada vez para retirar cualquier resto de la solución de estreptavidina-hrp secundaria. (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 5/7
PASO 4 REACCIÓN CON EL CROMÓGENO Inmediatamente antes de su utilización, diluya el concentrado de cromógeno a razón de 1:50 en el tampón sustrato DAB. Prepare aproximadamente 150 µl de cromógeno por portaobjeto. alrededor de la muestra para retirar cualquier resto de líquido. Añada 3 ó 4 gotas de solución cromógeno DAB para cubrir la muestra e incúbela a temperatura ambiente durante 5 minutos. Detenga la reacción del cromógeno sumergiendo los portaobjetos en agua durante 1 minuto. Aclare los portaobjetos con varios cambios de agua para retirar cualquier resto de la solución DAB. PASO 5 CONTRATINCIÓN La Hematoxylin (nº de catálogo S3302) produce una contratinción nuclear en azul que contrasta bien con el marrón de la señal DAB y que es permanente tanto en medios de montaje en solución acuosa como en medios de montaje en solución orgánica. Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina. La duración de la incubación dependerá de la concentración de la hematoxilina que se utilice. Cuando se utiliza Hematoxylin (nº de catálogo S3302), suele ser suficiente una incubación de entre 1 y 4 minutos. Aclare los portaobjetos con varios cambios de TBST y posteriormente con agua antes de proceder al montaje. PASO 6 MONTAJE Coloque un cubreobjetos sobre las muestras utilizando medio de montaje en solución acuosa o permanente. Para montaje en solución acuosa, se recomienda Glycergel (nº de catálogo C0563). Control de calidad Las diferencias que pueden darse en el procesado de las muestras o en las técnicas del laboratorio del usuario puede suponer una variabilidad significativa de los resultados obtenidos, por lo que es necesaria la realización, de forma regular, de controles de rendimiento en el propio centro. La realización de procedimientos de tinción con los controles adecuados mostrará cuál es el uso correcto de los reactivos y del procedimiento técnico que debe seguirse. Tejido y/o sonda de control positivo Para poder hacer un seguimiento del procesado y rendimiento correctos de tejidos, reactivos y sondas en estudio, es necesario utilizar tejidos que se sepa de antemano que son positivos a modo de control así como sondas de control que se sepan que son positivas para las muestras que se estén analizando. Puede utilizarse una sonda Positive Control (Human DNA) Biotinylated DNA Probe (nº de catálogo X1414) para mostrar la presencia de ADN genómico en el núcleo. La especificidad de los reactivos de detección puede demostrarse realizando el procedimiento de hibridación en ausencia de sonda; la presencia de tinción de fondo utilizando este control indica la unión no específica de los reactivos de detección. Este problema puede presentarse si los cortes llegan a secarse durante el procedimiento de detección. Sonda de control negativo Utilice una sonda de control negativo en lugar de la sonda de prueba con un corte de cada muestra para evaluar la tinción no específica que se produce y la especificidad de la reacción de hibridación con la sonda de prueba. Para poder determinar la especificidad de la reacción de hibridación, puede utilizarse como control negativo una sonda marcada incapaz de hibridarse, por ejemplo Negative Control (Plasmid DNA) Biotinylated DNA Probe (nº de catálogo X1415). Interpretación de la tinción Primero deben examinarse las muestras de control positivo para asegurarse de que todos los reactivos están actuando adecuadamente. Las señales positivas, que se corresponderán con las zonas de hibridación, aparecerán como zonas de color marrón o negro dentro de los límites de cada célula. La ausencia de tinción específica en los especímenes de control negativo confirmará la especificidad de la sonda de prueba. En el caso de que se produzca una tinción no específica, tendrá un aspecto punteado o difuso. La alta sensibilidad del sistema GenPoint TM se debe a su gran nivel de amplificación; cualquier tinción de fondo no específica también se verá amplificada. Por este motivo, se recomienda el uso de sondas de control negativo con las muestras en estudio, para facilitar la interpretación de los resultados de la tinción. Limitaciones Los resultados negativos pueden deberse a temperaturas y tiempos de incubación inadecuados, a una dilución incorrecta de los reactivos y a condiciones subóptimas de fijación y tratamiento previo. Las condiciones de fijación y tratamiento previo adecuadas debe determinarlas el usuario para cada tipo de espécimen. La alta sensibilidad de este sistema de detección permite la detección de genes de bajo número de copias y marn dianas poco abundantes. Sin embargo, la detección de un gen de copia única o de marn muy poco abundante mediante este sistema de detección depende de lo bien que estén marcadas las sondas de estudio (es decir, la densidad de marcas de biotina por sonda) así como del tamaño de las sondas y las dianas. Existe una actividad peroxidasa o pseudoperoxidasa endógena que se encuentra en hemoproteínas como la hemoglobina, la mioglobina, el citocromo y la catalasa, así como en ciertos leucocitos 7. Esta actividad puede eliminarse incubando las muestras con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos a temperatura ambiente (paso 1 del proceso de tinción) antes de aplicar la sonda. (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 6/7
Es posible que los tejidos de las personas infectadas con el virus de la hepatitis B y con el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) muestren tinción no específica con peroxidasa. 13 Solución de problemas Referencias Problema Causa probable Medida sugerida 1. No hay señal. 1a. La secuencia diana presenta pocas copias o la eficacia de la hibridización es baja. 2. Elevada tinción de fondo. 1b. Tratamiento previo subóptimo. 2a. Exceso de desarrollo de la señal. 1a. Aumente la concentración de sondas. Aumente el tiempo de hibridización. Aumente el número de ciclos de amplificación. 1b. Titule los tiempos de fijación y/o de tratamiento previo. 2a. Aumente la dilución de la estreptavidina- HPR primaria. Disminuya el tiempo de revelado con DAB. 2b. Someta la muestra a una mitigación con peróxido. 2b. Actividad peroxidasa endógena. NOTA: si el problema no puede atribuirse a ninguna de las causas expuestas anteriormente o si la medida de corrección que se sugiere no resuelve el problema, llame a los Servicios técnicos de Dako para obtener ayuda adicional. 1. Al-Hakim AH and Hull R. Chemically synthesized non-radioactive biotinylated long-chain nucleic acid hybridization probes. Biochem J 1988; 251:935 2. Saffran WA, et al. Preparation and characterization of biotinylated psoralen. Nuc Acids Res 1988; 16:7221 3. Levenson C, et al. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridization probes. Methods Enzymol 1990; 184:577 4. Nelson PS, et al. Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel, non-nucleosidic, 2-aminobutyl-1,3-propanediol backbone. Nuc Acids Res 1992; 20:6253 5. Gebeyeju G, et al. Novel biotinylated nucleotide analogs for labeling and colorimetric detection of DNA. Nuc Acids Res 1987; 15:4513 6. Langer PR, et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78:6633 7. Green NM. Avidin. Adv Prot Chem 1975; 9:85 8. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125:279 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood, body fluids, and tissue. (Tentative guideline; Second Edition) Villanova, PA 1991. Order code M29 T2 10. Preparation and analysis of DNA. In: Ausubel FM (eds.). Current Protocols in Mol Biol. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1999: Chapter 2 11. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78 127, Current 13. August 16, 1976 12. Centers for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 13. Omata M, Liew C-T, Ashcaval M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 07/15 (127950-001) P04030ES_ 01_K0620/2015.07 p. 7/7