DIFERENCIAS FENOTIPICAS Y FUNCIONALES ENTRE LINFOCITOS DEL NALT Y PASAJES NASALES RESUMEN El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) y los pasajes nasales (NP) se consideran como los sitios inductores y efectores de la respuesta inmune en las Bias áreas superiores. Las diferencias entre los linfocitos de estos compartimientos nasales no han sido claramente establecidas. El objetivo de este trabajo fue contribuir a la caracterización de las poblaciones de linfocitos tanto del NALT como de los NP en ratones. Se aislaron los linfocitos de ambos compartimentos, y se determino las frecuencias de linfocitos B (B220+), así como las células CD8+ y CD4+, y analizó la expresión moléculas de activación (CD69 y CD25). Además se analizó la proporción de las células T productoras de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-c y TNF-a. Se encontraron ó diferencias entre ambos tejidos. Primero se observaron dos poblaciones de las células B (B220 +hihg y B220 +low ) que fueron encontradas solo en los PN. Estas dos poblaciones expresaron CD19+ y solo la población de linfocitos B220 +low expresó el marcador de células plasmáticas CD138+. En este estudio se encontró una mayor cantidad de linfocitos B, que de linfocitos T, así como una frecuencia más alta de linfocitos CD4+ que de CD8+. También se encontró una pequeña fracción de células NK (CD3,DX5+) junto con una proporción importante de las células doble negativas (CD4, CD8, CD3+ y DX5). Además, los tres tipos de linfocitos (B220 +, T CD4 + y células T CD8+) expresaron las moléculas de activación CD25 y CD69 en ambos compartimentos. Asimismo, la proporción de las células T que producen espontáneamente IL-2, IFN-c, y la IL-4, fue mayor en el PN que en NALT. Estos datos proporcionan más pruebas de que el distintivo de las características fenotípicas y funcionales existe en la población de linfocitos que residen en NALT y NP. INTRODUCCION El NALT tiene la forma de un cilindro y se encuentra a ambos lados del tabique sobre el piso de la cavidad nasal. La función atribuida al NALT, es proporcionar un sistema de defensa en las vías aéreas superiores. En cuanto a su estructura, el NALT esta compuesto principalmente por linfocitos T y linfocitos B; otras poblaciones presentes son células dendríticas y macrófagos. EL NALT, se ha utilizado en una gran cantidad de trabajos, en los cuales se reporta que este órgano, juega un papel muy importante en el sistema de defensa de las vías respiratorias altas de los roedores, ya que se ha
demostrado que puede provocar respuestas inmunes, tanto locales como sistémicas. Se ha reportado que el NALT es un sitio importante en la recirculación de linfocitos hacia los nódulos cervicales y hacia las placas de Payer [1, 4, 5, 9]. En pocos estudios se ha caracterizado las poblaciones de linfocitos localizados en el tejido que rodean al NALT, llamado pasajes nasales (PN). Los pasajes nasales incluyen el tracto nasal y varias partes de la nariz tales como los cornetes, el tabique y las paredes laterales (1). El NALT y los pasajes nasales son considerados como los sitios inductores y efectores respectivamente, debido a que estos sitios han sido poco descritos el objetivo de este trabajo es contribuir en la descripción de los diferentes fenotipos de linfocitos del NALT y los NP. MATERIAL Y METODOS Obtención de linfocitos de la nariz. Los linfocitos se obtuvieron de ratones inmunizados con extracto más Cry1Ac, extracto solo o Cry1Ac sola. Los ratones fueron sacrificados siete días después de la última inmunización, se anestesiaron con éter etílico y fueron sangrados con una jeringa; después se decapitaron y se corto la mandíbula inferior. Se quito la piel y los músculos de la cabeza, la parte de la nariz fue separada del resto de la cabeza realizando un corte a la altura de la línea de los ojos. Se cortaron los músculos y los huesos de las mejillas. Los componentes aislados de la nariz (los turbinados nasales, el tabique, las paredes laterales y el paladar) fueron cortados en una caja de petri con 2 ml de medio RPMI con 4 mg/ml de colagenasa (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) hasta obtener partes más pequeñas. Los pedazos de nariz se pasaron a tubos de centrifugación (15 ml, Corning), y se incubaron por 30 min a 37 C en agitación (los tubos se colocaron en posición horizontal). Después de la incubación las células se filtraron en organiza y se lavaron con 10 ml de medio RPMI por centrifugación a 2500xg 10 min. Las células se colectaron y centrifugaron en un gradiente de Percoll (40%/70%) (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) a 2000xg por 30 min. Las células de la interfase se colectaron y se lavaron dos veces con medio RPMI, por ultimo las células se resuspendieron en 1 ml de RPMI. Las células quedaron listas para realizar la tinción con anticuerpos monoclonales (mab). 3.8.1. Citometria de flujo. Para la caracterización de los linfocitos B y T aislados de la nariz, los linfocitos se ajustaron a 1x10 6 de células por muestra y se incubaron con el
anticuerpo adecuado. Para determinar el fenotipo de superficie de los linfocitos se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales: Para controles de isotipo IgG2a (PE), IgG2b (FITC), para linfocitos T CD3 (PERCP), CD4 (FITC), CD8 (PE), CD3 (FITC); para linfocitos B CD45 ó B220 (PE); para activación CD25 (FITC) (IL -2Ra chain, p55) (7D4), anti -CD25 (PE) anti -CD69 (FITC) (very early a ctivation antigen) (H1.2F3) and anti-cd69 (PE) (H1.2F3). Los anticuerpos se utilizaron a una dilución 1:100 disueltos en PBS con albúmina sérica bobina al 0.5% (PBA) por 30 min a 4 C. Se lavaran con PBA y se desecho el sobrenadante, las células se fijaron con 500 l de paraformaldehído al 1% en PBS. Los datos se obtuvieron mediante citometría de flujo en un FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA) los eventos contados fueron un mínimo de 10,000. El análisis de resultados se llevo a cabo en un Software para análisis de citometría de flujo (LYSYS II). Los resultados se presentan como porcentajes de células positivas, la densidad de marcado se expreso en relación con la intensidad de fluorescencia. RESULTADOS Y DISCUSION Caracterización de los linfocitos del NALT y de los PN. Los linfocitos fueron obtenidos como se describe en material y métodos. El número de linfocitos aislados del NALT fue de 7x10 5 células por cada ratón, mientras que para los PN fue de 1.4x106 por ratón. El fenotipo de los linfocitos del NALT y de los PN analizados por citometría de flujo se muestra en la Fig. 1. En ambos tejidos el número de linfocitos B fue mayor que el de linfocitos T. Aunque la en los PN se encontraron dos poblaciones diferentes de linfocitos B (B220+ hi B220+low).
Figure 1 Lymphocyte composition of nasalassociated lymphoid tissue (NALT) and nasal passages (NP). NALT and NP lymphocytes were isolated from normal BALB/c mice. Single cell suspensions (1 106/sample) were stained with fluorochrome-labelled mabs and analysed by flow cytometry. Plots shown are from five representative experiments, and the mean values are indicated. Numbers in the upper plots refer to percentage of cells within lymphocyte gate while numbers in lower plots represent the relative frequencies in the CD3+ population. En contraste la proporción de células T fue diferente en el NALT y los PN (Tabla 1). En el NALT se encontró un mayor numero de linfocitos CD36+ que en los PN (37% contra17% respectivamente). La relación de linfocitos B/T fue más alta en los PN que en el NALT (proporción 3:1 B/T respectivamente). Por otra parte el numero de células CD4+ que representaron casi la mitad de del total de células CD3+ fueron encontrados tanto en el NALT como en los PN (48% y 49% respectivamente) (tabla 1). Mientras que el porcentaje de células CD8+ fue más bajo en los PN que en el NALT (6.4 contra 4.4 respectivamente), consecuentemente la proporción de CD4+/CD8+ fue mayor en los PN que en el NALT. En cuanto a las dos poblaciones de linfocitos B encontradas en los pasajes nasales se utilizaron los marcadores de células B CD19, CD138 e IgA para tratar de determinar su linaje dentro de las células B. se encontró que la mayoría de los linfocitos B de las dos poblaciones expresan CD19+ indicando que son linfocitos B (Fig. 2). Mientras que el 15% de los linfocitos B220 low expresaron el marcador CD138, y no fue detectado en la población B220+hi. La presencia de IgA fue similar tanto en el NALT como en los PN. Estos resultados indican que la población de linfocitos B220+low corresponde a células plasmáticas (fig. 2).
Figure 2 Flow cytometric analysis of the expression of CD19, CD138 and intracellular IgA in B220+ cells, in nasal-associated lymphoid tissue (NALT) and nasal passages (NP) l ymphocytes isolated from normal BALB/c mice. The representative plots shown were gated on B220+ cells within lymphocyte gate. Numbers represent the mean percentage values of expression from three independent experiments. Almost all B220+ cells expressed CD19, while only a fraction within the predominant B220+low population found in NP expressed CD138. Análisis de marcadores de activación CD25+ y CD69+. Se analizo si los linfocitos aislados tanto de los PN como del NALT se encontraban activados y si la activación era diferente en cada compartimiento. Los datos en la Fig. 3 indican el porcentaje de linfocitos positivos para CD25+ o CD69+. En la tabla 2 se muestran los resultados de manera individual para linfocitos CD4+, CD8+ y B220+. La proporción de CD25+ y CD69+ en estas células fue mayor en los linfocitos aislados de los PN que en el NALT.
Figure 3 Flow cytometric analysis of activation marker expression on nasal-associated lymphoid tissue (NALT) and nasal passages (NP) lymphocytes. The frequency of B220+, CD4+ and CD8+ cells expressing either CD25+ or CD69+ was determined within the NALT and NP lymphocyte population isolated from normal BALB/c mice. Cells were stained with fluorochrome conjugated mabs and analysed by flow cytometry. Dotplots shown are from representative experiments. Numbers represent the mean percentage values of expression of five independent experiments (using pooled cells of six mice per each tissue). The values were calculated for the entire population within lymphocyte gate. Localización intracelular de citocinas por linfocitos T aislados del NALT y de los PN.
En la Fig. 4 se muestra los niveles citocinas (IL-2, IFN-c, IL-4, IL-5, IL-10 y TNF-a) producidas por los linfocitos T tanto del NALT como de los PN. La IL-4 Y la IL-10 fueron más abundantes en los PN que en el NALT. El IFN-γ fue más abundante en el NALT que en los PN. La IL-5 se expreso de manera similar en ambos compartimientos. Estos datos indican un pequeño numero de linfocitos T producen citocinas Th1 (Fig. 4). En resumen el presente estudio provee evidencias que claramente distinguen características funcionales y fenotípicas tanto del NALT como de los PN en cuanto a sus poblaciones de linfocitos. Mostrando que los pasajes nasales son el sitio efector de la mucosa nasal ya que presentan un mayor numero de linfocitos activados así como una mayor producción de citocinas en comparación con el NALT que seria el sitio inductor.