AREA DE PRODUCCION AGRICOLA

Transcripción

1 Proyecto núm. SC NUEVOS METODOS DE DIAGNOSTICO DE ALGUNAS ENFERMEDADES DE LOS CITRICOS TRANSMISIBLES POR INJERTO Y DE ETIOLOGIA DESCONOCIDA Equipo Investigador José Guerri Sirera (Dr. C.B.); Pedro Moreno Gómez (Dr. I.A.); Luis Navarro Lucas (Dr. I.A.); José Francisco Ballester-Olmos (I.T.A.); Jaime Piquer Aguilar (I.T.A.); Luis Galipienso Torregrosa (L.B.). Equivalente de jornada completa: 2,00 AREA DE PRODUCCION AGRICOLA Centro de Investigación Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. (IVIA). Valencia Duración: Enero, Diciembre, Coste: Miles de pesetas: Financiación INIA: 100% 199

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Los cítricos en España ocupan una superficie cultivada de más de Ha con una producción estimada en más de 5 millones de toneladas. Una gran parte de esta producción se destina a la exportación en fresco, principalmente a los mercados europeos, lo que constituye una de las principales fuentes de entrada de divisas. Al valor directo de la producción, hay que añadir, la actividad económica secundaría que se crea alrededor de este cultivo, así como, su valor social debido a la demanda de mano de obra que ocasiona. Existe una serie de enfermedades transmisibles por injerto, comúnmente llamadas virosis que producen el decaimiento e incluso la muerte de la planta, disminuyen la producción y calidad de los frutos, acortan la vida de la planta, y en algunos casos limitan el uso de ciertos patrones. Entre las enfermedades transmisibles por injerto detectadas en España se encuentra lo que se ha denominado psoriasis-ringspot. Esta enfermedad generalmente no produce la muerte rápida del árbol pero si acorta la vida del mismo y produce una disminución en la producción, calculada en un 20%, lo que puede suponer el margen comercial del agricultor. La enfermedad de la psoriasis de los cítricos está muy entendida por todo el mundo, y en España después de la tristeza es la virosis que más daños causa en las plantaciones comerciales, particularmente en los naranjos dulces. El diagnóstico de la psoriasis se ha efectuado tradicionalmente mediante ensayos de infectividad. Este consiste en inocular plantas indicadoras injertando en ellas una porción de tejido de la planta en estudio, normalmente un trozo de corteza. Algunos de los síntomas inducidos por la psoriasis en plantas indicadoras son similares a las inducidas por otras enfermedades de los cítricos como son el concavegum, imprietratura y cristacortis. Por lo tanto, es importante caracterizar biológicamente la enfermedad tanto en condiciones de campo como de invernadero. Esta caracterización es necesaria para poder correlacionar las características biológicas de un aislado y la detección del mismo por los métodos rápidos de diagnóstico que podamos desarrollar. Los métodos biológicos utilizados hasta la fecha para el diagnóstico de la enfermedad son lentos y caros, lo que ha impedido el control sanitario del material vegetal. Por lo tanto el desarrollar métodos específicos y rápidos es necesario para establecer estrategia de control de la enfermedad. Por otra parte, dentro del programa de Mejora sanitaria de variedades de cítricos se han detectado dos nuevas enfermedades transmisibles por injerto. Una de ellas produce la incompatibilidad sobre citrange Troyer. La otra enfermedad produce la incompatibilidad de naranjos dulces sobre limonero Rugoso, pero no se sabe aún si puede producirla también en otras combinaciones. La primera de estas enfermedades se detectó en un Kunquat Nagami, pero no se sabe si está muy extendida, ni si alguno de los síntomas de incompatibilidad de algunas variedades de cítricos con citrange Troyer detectadas en campo pueden estar producidas por el mismo patógeno. La difusión en campo de un virus que produjera la incompatibilidad sobre citrange Troyer sería de consecuencias catastróficas para nuestra citricultura, por ser actualmente el patrón más utilizado por ser tolerante a tristeza y presentar unas buenas características agronómicas. El conocimiento sobre la incompatibilidad de algunas variedades de naranjo dulce sobre limonero Rugoso es muy escaso. Hasta la fecha no se conoce el agente causal, ni se dispone de ensayos de infectividad para el diagnóstico específico de la misma que no sea la aparición de los síntomas de incompatibilidad, lo que requiere varios años. Hasta que no se conozca la naturaleza y características biológicas de los distintos patógenos que producen esta enfermedades no se podrá abordar el control de las mismas. Para ello es imprescindible el desarrollo de técnicas de diagnóstico específicas, sensibles y si es posible rápidas. Los objetivos generales establecidos en este proyecto incluían: 1. Caracterización de síntomas inducidos por la enfermedades psoriasis-ringspot en campo e invernadero. Desarrollo de métodos rápidos para el diagnóstico de las mismas. 2. Caracterización biológica y bioquímica del virus implicado en la incompatibilidad de Kunquat sobre citrange Troyer. Establecimiento de métodos rápidos de diagnóstico. 3. Caracterización biológica del agente infeccioso que causa la incompatibilidad de naranjo dulce sobre limonero Rugoso. Búsqueda de métodos más rápidos de diagnóstico de esta enfermedad. 200

3 A) ESTUDIO SOBRE LAS ENFERMEDADES PSORIASIS-RINGSPOT A-1) Caracterización de síntomas inducidos por las enfermedades psoriasis-rinspot en campo e invernadero Se ha estudiado la distribución, en árboles de campo del factor que induce la reacción de shock en plantas de invernadero. Se ha observado que dicho factor se encuentra irregularmente distribuido a lo largo del árbol. Se ha encontrado una correlación entre la presencia de descamaciones en árboles de campo, la capacidad para inducir reacción de shock en plantas de invernadero y la transmisibilidad a Chenopodium quinoa. Se ha encontrado una estrecha correlación entre la capacidad de inducir la reacción de shock en plantas de invernadero por un aislado y la capacidad de proteger frente a psoriasis B. RESULTADOS Se ha puesto a punto un método para purificar y concentrar la proteína capsídica del virus. Con dicha metodología se ha purificado proteína de varios aislados de psoriasis-ringspot y con la mezcla de proteínas se ha inmunizado un conejo y obtenido un suero. Este suero además de reaccionar con planta enferma tiene cierta reacción con planta sana, lo que lo hace inviable para el diagnóstico rutinario de la enfermedad por el método ELISA. Se ha obtenido una sonda de cdna para el diagnóstico del virus mediante hibridación molecular. Debido a la baja concentración que se encuentra el virus en la planta,los resultados no son lo suficientemente claros para utilizar esta sonda para el diagnóstico rutinario de la enfermedad mediante hibridación molecular. Este clon se ha secuenciado y a partir de las secuencias se han diseñado unos iniciadores para el diagnóstico de la enfermedad mediante RT-PCR. B) ESTUDIO DEL VIRUS QUE PRODUCE LA INCOMPATIBILIDAD DEL KUNQUAT SOBRE CITRANGE TROYER B-1) Caracterización biológica Se ha estudiado la incompatibilidad de distintas variedades comerciales inoculadas a partir del aislado de kunquat SRA-153 sobre citrange Troyer. En dos de las variedades ensayadas (Clementino y limonero) se indujo a los pocos meses una fuerte línea de incompatibilidad. En las otras dos variedades ensayadas (dulce y pomelo) hasta la fecha no se ha observado dicha línea de incompatibilidad, pero no se descarta que ésta pueda aparecer con el tiempo. B-2) Caracterización bioquímica AREA DE PRODUCCION AGRICOLA A-2) Desarrollo de técnicas de detección más rápidas Se ha puesto a punto un método para purificar el virus. En extractos purificados a partir del Kumquat SRA-153 se observaron unas partículas filamentosas de aproximadamente 800 mm de longitud y 11 mm de diámetro que no se observaron en extractos equivalentes de planta sana. Estas partículas llevan asociadas una proteína de aproximadamente 42 kd y un RNA monocatenario con movilidad electroforética equivalente a unos 4x10 6 Daltons. En extractos purificados de RNA bicatenarios obtenidos a partir del Kunquat enfermo se observaron 3 bandas de aproximadamente 8, 6 7 y 5 3 x 10 6 Mr que no se detectaban en extractos idénticos de plantas sanas. B-3) Desarrollo de métodos rápidos de diagnóstico Se ha preparado una genoteca de cdna a partir de extractos purificados de RNA 201

4 bicatenario. Algunos de los clones reaccionaron frente a el RNA viral. Estos clones se han utilizado como sondas y/o se han secuenciado y a partir de las secuencias se han diseñado cebadores específicos para la detección del virus mediante hibridación molecular o RT- PCR respectivamente. C) ESTUDIO DE LA INCOMPATIBILIDAD SOBRE LIMONERO RUGOSO C-1) Caracterización biológica Se propagaron sobre limonero rugoso distintas variedades comerciales preinoculadas a partir de los cultivares de naranjo dulce portadores del factor de incompatibilidad. Un grupo de estas plantas se mantuvo en invernadero frío, otro en caliente y otro se plantó en campo. Sólo en las plantas de naranjo dulce se observó la incompatibilidad, y esta apareció primero en campo, después en invernadero frío y por último en caliente. C-2) Se eliminó por microinjerto el factor que produce la incompatibilidad de alguna variedad de naranjo dulce sobre limonero rugoso C-3) Purificación del virus Se ensayó distintos métodos de purificación de virus isométricos y filamentosos. Hasta la fecha no se ha visto ninguna partícula ni se ha detectado ninguna proteína asociada a la enfermedad. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES A) ESTUDIO SOBRE LA ENFERMEDAD PSORIASIS-RINGSPOT A.1. Caracterización de síntomas inducidos por la enfermedad psoriasis en campo e invernadero 202 Existe una serie de enfermedades que clásicamente se han denominado complejo psoriasis que se caracterizan por inducir síntomas similares en plantas indicadores de invernadero, pero que ocasionan en campo síndromes tan diversos como psoriasis propiamente dicha, concave gum, impietratura, cristacortis. El poder disponer de técnicas de diagnóstico específico de la enfermedad es necesario para poder correlacionar las características biológicas de un aislado y la detección del mismo por los métodos rápidos de diagnóstico que podamos desarrollar. Para realizar estos estudios se seleccionaron dos campos de las variedades Washington Navel y Salustiana injertadas sobre naranjo amargo de 38 y 40 años de edad respectivamente, para que tuvieran tiempo de mostrar síntomas. En ambos casos se apreciaron árboles con síntomas de descamación producidos por psoriasis y otros que no la presentaban. Se eligieron 20 árboles con síntomas de descamación y otros 20 sin síntomas. De cada árbol se tomaron 4 muestras procedentes de las 4 orientaciones. Estas muestras se inocularon en plantas indicadoras. Todos los árboles que presentaban descamaciones indujeron la reacción de shock en plantas indicadoras, mientras que ninguno de los árboles sin descamación indujo la reacción de shock. Todas las plantas que indujeron reacción de shock, protegieron después frente a psoriasis B y no lo hicieron las que no habían dado. Algunos de los árboles que no presentaban síntomas de descamación indujeron en las plantas indicadoras flecos y manchas cloróticas, pero nunca reacción de shock. De estos resultados se desprende que la producción de shock en distintas plantas indicadoras se puede recomendar como ensayo para el diagnóstico específico de psoriasis escamosa, incluso en árboles que aún no muestran síntomas de la enfermedad. La protección frente a psoriasis B se recomendaría sólo en algunos casos, para confirmar el ensayo de shock, ya que es una prueba más larga y costosa. Estos dos ensayos nos permite diferenciar la psoriasis escamosa de otras enfermedades del grupo psoriasis que inducen los mismos síntomas en hojas jóvenes de plantas indicadores. También se estudió la distribución en árboles de campo del factor que induce la reacción de shock en plantas indicadores. Se observó que dicho factor se encuentra irregularmente distribui-

5 do a lo largo del árbol. Esto explica que en una misma plantación se observan árboles con síntomas y otra sin ellos, a pesar que la propagación de los árboles se realice con material de la misma procedencia. A.2. Desarrollo de métodos rápidos para el diagnóstico de psoriasis-ringspot Los métodos biológicos propuestos en el apartado anterior para el diagnóstico de la enfermedad son específicos de la misma pero son caros y lentos, lo que supone una limitación importante para establecer estrategias de control de la enfermedad. En este proyecto nos propusimos desarrollar métodos de diagnóstico del virus basados en la detección de la proteína o del ácido nucleico viral. A.2.1. Obtención de anticuerpos policlonales para el diagnóstico de psoriasis Para la realización de este objetivo se purifico proteína capsídica de varios aislados de psoriasis de la colección del IVIA por el método puesto a punto en nuestro laboratorio. El mismo consistía en la semipurificación del virus mediante homogeneización del material vegetal, extracción con un tampón adecuado, filtración a través de gasa y clarificación del extracto, fraccionamiento mediante centrifugación en un gradiente de sacarosa y purificación de la fracciones seleccionadas en un gel de agarosa. En esta fase del proceso, la proteína capsídica se encuentra atrapada como nucleoproteina dentro del gel de agarosa a una concentración muy baja (solo se detecta mediante tinción de plata) y contaminada con otras proteínas de la planta. Para concentrar la proteína capsídica y purificarla de otras proteínas, se eliminó la agarosa haciéndola pasar por las unidades ultrafree MC de millipore, se precipitaron las proteínas con acetona y se separaron mediante electroforesis en un gel de acrilamida (SDS-PAGE). Las bandas proteicas se visualizaron mediante tinción en azul Comassie y se corto una banda de 47 kd, que es el tamaño de la proteína capsídica descrita para este virus, que estaba en extractos de planta infectada con psoriasis y que no era detectable en extractos idénticos procedentes de planta sana. Con una mezcla de bandas de distintas purificaciones se inmunizó un conejo. El suero obtenido se ensayó mediante western blot y ELISA frente a varios aislados de Psoriassis de la colección del IVIA. Por ambas técnicas el suero reaccionó frente a extractos procedentes de planta enferma y de planta sana. La reacción frente a extractos de planta fue ligeramente más intensa que frente a planta sana, pero estas diferencias no fueron suficientes para utilizar este suero de una forma rutinaria para el diagnóstico de la enfermedad. Estos resultados indican que las bandas cortadas del gel de electroforesis a parte de la proteína del virus debían contener una proteína contaminante procedente de la planta que estaba en menor concentración pero debía ser mucho más antigénica. Aunque el suero no tiene utilidad para el diagnóstico rutinario del virus mediante la técnica ELISA, si que se puede utilizar para el diagnóstico del virus mediante western blot y en un futuro cuando se disponga de iniciadores específicos para el diagnóstico mediante Inmuno-PCR. A.2.2. Obtención del cdna para el diagnóstico de psoriasis-ringspot Todos los intentos de purificar el RNA viral a partir de distintos aislados españoles fue fallida y nunca se pudo detectar dicho RNA mediante electroforesis y tinción con bromuro de etidio. Esto impidió obtener una librería de cdna. Para la preparación de sondas de cdna de siguió el siguiente protocolo. Se semipurificó el virus como se indica en el apartado anterior. Los ácidos nucleicos se separaron del gel de agarosa conteniendo el virus mediante tratamiento con fenol-cloroformo y posterior precipitación con alcohol. A partir de extractos de planta sana y enfermos se sintetizó cdna utilizado iniciadores al azar. A partir de estos cdna se realizaron amplificaciones mediante PCR utilizando iniciadores del tipo RAPDs. Uno de los iniciadores amplificó sistemáticamente una banda de cdna a partir de planta enferma que no se detectaba en amplificados idénticos de plantas sanas. Esta banda se purifico y clonó. Este clon se ensayó frente a varios aislados de psoriasisringspot, españoles, utilizando como diana extractos de RNA de plantas enferma y sana. Debido a la baja concentración que se debe encontrar el virus los resultados no fueron lo suficientemente claros para utilizar la hibridación molecular como técnica rutinaria de diagnóstico. Este clon se ha secuenciado y a partir de las secuencias se han diseñado iniciadores para el diagnóstico de la enfermedad mediante RT-PCR. 203 AREA DE PRODUCCION AGRICOLA

6 B) ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD QUE PRODUCE INCOMPATIBILIDAD DEL KUMQUAT SRA-153 SOBRE CITRANGE TROYER B.1) Caracterización en invernadero B.1.1. Síntomas inducidos en plantas indicadoras a partir de distintas variedades de cítricos inoculados a partir del aislado de Kumquat SRA-153 Plantas de naranjo dulce y Dweet tangor inoculadas a partir del Kumquat SRA-153 mostraron síntomas de aclaramiento en las nerviaduras. En Dweet tangor además de este aclaramiento de los nerviaduras se observó posteriormente la aparición de un moteado. Sin embargo, plantas de naranjo dulce pineapple y de Pomelo March preinoculadas con el aislado SRA-153 no indujeron aclaramiento en las nerviaduras, pero si la aparición de moteado sobre Dweet tangor. Cuando se preinoculó con el aislado SRA-153 plantas de clementino de Nules y limón, Eureka estas plantas si que indujeron síntomas de aclaramiento en las nerviaduras y moteado al inocularse sobre naranjo dulce pineapple y Dweet tangor. Estos resultados sugieren la existencia de más de un patógeno en el aislado SRA-153 y la eliminación de alguno de los componentes al pasar por naranjo dulce pineapple o pomelo March pero no al pasar por el Clementino de Nules o limón Eureka. B.1.2. Estudio de la incompatibilidad de variedades comerciales inoculadas con el aislado de Kumquat SRA-153 Se inocularon 4 variedades comerciales (Naranjo de dulce Pineapple, Pomelo March, limón Eureka y Clementino de Nules) con el aislado de Kumquat SRA-153. A continuación se propagaron sobre citrange Troyer yemas de plantas sanas y preinoculadas. En dos de las variedades ensayadas (Clementino y limonero) se indujo a las pocos meses una frente línea de incompatibilidad. En las otras dos variedades ensayadas, hasta la fecha, no se ha observado dicha línea de incompatibilidad, pero no se descarta que pueda aparecer con el tiempo. Dado que este virus produce la incompatibilidad de las variedades comerciales cultivadas en España, su difusión podría ser catastrófica para la citricultura española, ya que el 70% de las nuevas plantaciones están sobre este patrón, por ser tolerante a tristeza y presentar unas buenas características agronómicas. 204 B.1.3.) Transmisión mecánica a huéspedes herbáceos Se ensayó la transmisión mecánica a distintos huéspedes herbáceos a partir de extractos semipurificados obtenidos a partir del Kumquat SRA- 153 En ningún caso se consiguió dicha trasmisión. Esto hace que este virus sea distinto a otro descrito en cítricos que también produce la incompatibilidad de algunas variedades y especies de cítricos con citrange Troyer ( tatter-leaf ) que si que es transmisible, entre otros huéspedes herbáceos, a Vigna unguiculata, Chenopodium quinoa, etc. B.2) Purificación del Virus Se ensayaron distintos, métodos de purificación de virus de plantas. Se ha puesto a punto un método que consiste en la pulverización del tejido con nitrógeno líquido, extracción con un tampón adecuado, filtración a través de gasa, clarificación del extracto, concentración mediante polietilenglicol, fraccionamiento mediante centrifugación en un gradiente de sacarosa y purificación en un gradiente de sulfato de cesio. En extractos purificados a partir del kumquat SRA-153 se observó unas partículas filamentosas de aproximadamente 800 mm de longitud y 11 mm de diámetro que no se observó en extractos idénticos de plantas sanas. Estas partículas llevaban asociada una proteína de aproximadamente 42KD y un RNA monocatenario con movilidad electroforética equivalente a unos 4x10 6 Daltons. Esto tiene gran importancia, ya que la purificación de virus en cítricos es bastante complicada. Así de las 14 enfermedades transmisibles por injerto que se han detectado en los cítricos españoles solo 5 son de etiología conocida, y se pueden detectar por métodos serológicos o moleculares. B.3) Ensayos de detección de RNAs de doble cadena Se ensayaron distintos métodos de purificación de dsrna. Con la metodología elegida se purificó dsrna a partir de distintos huéspedes preinoculadas con el aislado del Kumquat SRA-153 tipos de tejido. En la mayoría de las purificaciones se observó la presencia de tres bandas de aproximadamente 8,6 7 y 5 3 x 10 6 Mr que no se detectaba en extractos idénticos de planta sana. Debido a la baja concentración que se encuentran dichos RNAs en la planta, su detección no es siempre posible, lo que hace un método no práctico para el diagnóstico rutinario de la enfermedad.

7 B.4) Desarrollo de métodos rápidos para el diagnóstico de la enfermedad Se ha obtenido una genoteca de cdna frente a RNAs bicatenario purificado a partir de plantas de Kumquat inoculada con el aislado SRA-153. Algunos de los clones obtenidos reaccionan frente a extractos de dsrna de plantas enfermas pero no con extractos paralelos de planta sana. Estas sondas también reaccionan en Northerm blot frente al RNA monocatenario del virus. Esta hibridación diferencial ha sido observada a partir de extractos de RNAs bicatenario obtenida a partir del Kumquat SRA-153, así como a partir de extractos idénticos obtenidos de plantas de variedades comerciales preinoculadas con el aislado SRA-153. Esta hibridación diferencial se ha detectado con sondas marcadas por métodos radiactivos y no radiactivos. Algunos de los clones obtenidos se han secuenciado y a partir de las secuencias obtenidas se han diseñado unas cebadores específicos para la detección del virus mediante RT-PCR. Tanto por hibridación molecular como mediante RT-PCR el diagnóstico de la enfermedad se pudo realizar a partir de plantas de distintas especies comerciales cultivadas en invernadero. Estos métodos de diagnóstico aún no se han ensayado en condiciones de campo. Hasta la fecha, este virus se ha detectado en varios orígenes de kumquat y en una serie de variedades procedente de Japón introducidos por la Estación Nacional de Cuarentena, pero no se sabe si este virus se halla en plantaciones comerciales, ni si está relacionado con la incompatibilidad de algunas variedades sobre citrange Troyer detectadas en campo, ya que aún no se han realizado prospecciones masivas. C) ESTUDIO DE LA INCOMPATIBILIDAD SOBRE LIMONERO RUGOSO C.1) Caracterización Biológica C.1.1. Inoculación en distintas plantas indicadoras Se inoculó distintas plantas indicadoras a partir de cultivares que muestran línea de incompatibilidad sobre limonero Rugoso. Ninguna de las plantas mostró síntomas ni en invernadero frío ni en caliente. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por otros autores estudiando enfermedades parecidas. C.1.2. Estudio de la incompatibilidad de variedades comerciales preinoculadas a partir de los cultivares de naranjo dulce portadoras del factor de incompatibilidad Se propagó sobre limonero rugoso distintas variedades comerciales (clementino, limonero, pomelo y naranjo dulce) preinoculadas a partir de los cultivares de naranjo dulce portador del factor de incompatibilidad. Un grupo de estas plantas se mantuvo en invernadero frío, otro en caliente y otro se plantó en campo. Solo las plantas de naranjo dulce sobre limonero rugoso se produjo la incompatibilidad, y esta apareció primero en campo, después en invernadero frío y por último en caliente. Los síntomas en campo aparecieron a partir del segundo año de propagación. Hasta la fecha, no existe ningún método biológico o de laboratorio más rápido para el diagnóstico de esta enfermedad. C.2) Tratamiento de eliminación de patógenos Se eliminó mediante la técnica de microinjerto el patógeno que produce la incompatibilidad sobre limonero Rugoso. Propagaciones de naranjo dulce obtenidas por microinjerto sobre limonero Rugoso después de diez años desde su propagación, no muestran síntomas de incompatibilidad, mientras que plantas idénticas inoculadas a partir de los cultivares de naranjo dulce portadores del factor de incompatibilidad si que lo muestran. Estos resultados demuestran que las anormalidades en la unión observadas en varias variedades de naranjo dulce sobre limón rugoso están inducidos por un patógeno que puede ser eliminado por microinjerto. C.3) Purificación del virus Se ensayaron distintos métodos para intentar purificar el agente que produce la incompatibilidad de algunas variedades de naranjo dulce sobre limonero Rugoso. Hasta la fecha no se ha encontrado ninguna partícula viral en los distintos ensayos de purificación realizados. FORMACION DE PERSONAL Elaboración de la tesis doctoral de Luis Galipienso Torregrosa, titulada Caracterización de un virus asociado con la incompatibilidad del Kumquat Nagami con citrange Troyer. Desarrollo de métodos de diagnóstico rápidos. 205 AREA DE PRODUCCION AGRICOLA

8 PUBLICACIONES Artículos científicos Navas-Castillo, J., Moreno, P Filamentous flexuaus particles and serologically related proteinas of variable size associated with citrus psorosis and ringspot diseases. European Journal of Plant Pathology, Navas-Castillo, J., Moreno, P., Durán-Vila, N Citrus psorosis, ringspot, cristacortis and concavegum pathogens are maintained in callus culture. Plant Cell Tissue and Orgam Culture, Trabajos prsentados a congresos, reuniones o simposios Galipienso, L., Moreno, P., Navarro, L., Guerri, J. Caracterización parcial de un virus asociado con la incompatibilidad del Kumquat Nagami injertado sobre citrange Troyer. VIII Congreso de la Sociedad Espanola de Fitopatología. Córdoba (Espana). Septiembre,