DESCRIPCION DE TECNICAS FENOTIPICAS Y MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACION DE

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1 DESCRIPCION DE TECNICAS FENOTIPICAS Y MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACION DE Mycobacterium tuberculosis y micobacterias atípicas EN EL LABORATORIO CLINICO ELIZABETH CORTES SIERRA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGÍA BOGOTÁ D.C 2009

2 DESCRIPCION DE TECNICAS FENOTIPICAS Y MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACION DE Mycobacterium tuberculosis y micobacterias atípicas EN EL LABORATORIO CLINICO ELIZABETH CORTES SIERRA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de Bacterióloga DIRECTOR FREDDY GAMBOA Bacteriólogo, Ms.C, Ph.D PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGIA Bogotá, D. C. Enero del 2009

3 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

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6 DEDICATORIA Este trabajo lo quiero dedicar inicialmente al guiador de mi vida, DIOS, quien me lleno de fortaleza y de perseverancia durante todo el transcurso de mi carrera. A mi mamita, gracias, gracias. Gracias por estar conmigo tu y yo sabemos que fue un largo camino para poder culminar este gran paso, estoy segura que si en ti a mi lado no lo podría haber logrado, Dios te bendiga hoy siempre. A mi papa, que yo se que en el cielo donde esta, me esta observado. Este logro tampoco hubiera sido posible sin ti, eres mi base. Te quiero y se que siempre estarás conmigo. A los dos gracias, por enseñarme a ser quien soy, por enseñarme el valor de la responsabilidad, la lealtad, la honestidad y el amor por Dios, valores que me ayudaran a afrontar los retos de la vida. A mis hermanos Carito (mi conciencia) y Pablo, gracias por estar conmigo siempre, los quiero mucho, a mi Juan que es la alegría de mi vida. A Alex, amor gracias por estar conmigo, tu cariño y apoyo me han permitido no desfallecer, tu perseverancia por conseguir las cosas, han sido ejemplo para mi, para luchar por lo quiero, que Dios te bendiga. A toda mi familia, a Patricia y Aleja (por apartarme un pedacito de sus corazones y de su casa) gracias. A mis tíos y primos, que siempre estuvieron para darme una voz de aliento y de apoyo. Dios los bendiga. El valor de las cosas no están en el tiempo que duran, sino en la intensidad con que suceden. Por eso existen momentos inolvidables, cosas inexplicables y personas incomparables

7 AGRADECIMIENTOS 1Corintios 15:57 Mas gracias sean dadas a Dios, que nos da la victoria por medio de nuestro Señor Jesucristo. Quiero agradecerle a Dios por todo lo que me ha brindado en la vida, por la fortaleza que me da para ser mejor cada día, no existe palabra alguna que exprese la gratitud que tengo hacia ti Señor. A mis padres por brindarme su apoyo y su confianza, por el esfuerzo que han realizado durante sus vidas para ofrecerme una vida mejor. Los amo con todas mis fuerzas. Al Doctor Freddy Gamboa, que por su confianza, apoyo y gran ayuda fue posible el desarrollo de un buen trabajo en poco tiempo. Gracias a la Pontificia Universidad Javeriana por ayudarme a hacer realidad la meta de ser una profesional no solo académicamente sino integralmente, con gran sentido de propiedad por mi carrera y por mi Universidad: A todos los docentes que pusieron su grano de arena, con cada conocimiento compartido y con su amistad. A todos mis compañeros con los que compartí tantos momentos de angustias y alegrías, momentos inolvidables; tendrán siempre un pedacito de mis recuerdos y de mi corazón. A todas las personas que estuvieron a mi lado colaborándome, dándome una voz de aliento, ayudándome en tantos de momentos de confusión, gracias. A todos gracias.

8 TABLA DE CONTENIDO Pág. 1. Introducción Justificación Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos Metodología Generalidades de las micobacterias Mycobacterium tuberculosis Tuberculosis Fisiología Manifestaciones s Tuberculosis pulmonar Clínica Tuberculosis extrapulmonar Formas extrapulmonares frecuentes Tuberculosis y sistema nervioso central Linfadenitis tuberculosa (Tuberculosis ganglionar) Tuberculosis renal y de vías urinarias Tuberculosis genital Pericarditis tuberculosa Tuberculosis en aparato digestivo Tuberculosis y sistema musculoesqueletico Micobacterias atípicas (MNT) Fisiopatología de las MNT Manifestaciones s y criterios de diagnostico Muestra Esputo Envase Número de muestra Recolección de la muestra (espontanea) Otras formas de obtención de esputo Lavado u aspirado gástrico Lavado o cepillado bronquial y broncoalveolar Calidad de la muestra de esputo Otras muestras Orina Líquido cefalorraquídeo Líquidos pleural, ascítico, pericardico, articular y otros Biopsias y material desparafinado Pus Sangre 40

9 7. Aislamiento e identificación de bacilos acido alcohol resistentes Microscopía Baciloscopia Tinciones Técnica de Ziehl Neelsen Tinción con Auramina (fluorescente) Informe de resultados Sensibilidad y especificidad Actividad de la Adenosina Deaminasa (ADA) Cultivo Nutrientes en los medios de cultivo Descontaminación de las muestras N- acetil- L Cisteína- Hidroxido de sodio (NALC-NaOH) Método de Kudow Ogawa modificado Método de Tacquet-Tison o método Lauril sulfato de sosa Medios de cultivo sólidos /semisólidos Medios de cultivo líquido (Medios sensores de crecimiento) Medios de cultivo de lectura manual MB Redox Medio MGIT (Mycobacterial Growth Indicador Tube System) Medios de cultivo de lectura automática /semiautomática Medios de cultivos radiometricos (lectura semiautomática) Medios de cultivo no radiométricos Sistema ESP Culture System II Sistema MB/Bact Sistema MGIT TB Medios de cultivo bifásico no radiométrico (MB-SeptiCheck) Hemocultivos Hemocultivo manual Hemocultivo semiautomatizado. (Procedimiento para la Lisis de centrifugación) Hemocultivos automatizados Pruebas Bioquímicas Prueba de Niacina Actividad de la Catalasa Reducción de Nitratos Otras pruebas bioquímicas Otras técnicas de identificación Test de NAP en Bactec 12B Identificación por Cromatografía Cromatografía Gas- Líquido (GLC) Cromatografía por capa fina (CGS) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Diagnóstico serológico de la Tuberculosis Identificación mediante fagos específicos (Test de Luciferasa) 72

10 7.5.5 Estudios de sensibilidad Identificación genotípica Sondas de ácidos nucleicos Diagnostico molecular Técnicas de amplificación Análisis postamplificación PCR-RFLP (hsp65) Secuenciación (ADN) de la subunidad ribosomal 16S Hibridación en fase sólida Amplificación y detección a tiempo real Técnicas comerciales Amplicor y Cobas Amplicor MTB test (Amplicor; Roche Diagnostic Systems BDProbe Tec ET Gen-Probe Amplified MTD LCx MTB (Abbot Laboratorios) GenoType (Detección directa) / GenoType Mycobacterium / GenoType MTBDR plus INNO-LiPA Micobacteria v2 / INNO-LiPA Rif.TB Evaluación de métodos comerciales Método AMPLICOR MTB Método Amplified M. tuberculosis Direct (AMTD2) Método LCx MTB Método BD ProbeTec (ET) (DTB) Método INNO-LiPA RIF.TB Discusión Bibliografía 98

11 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Sistema de Clasificación de la TBC, según la Sociedad Americana del Tórax. 29 Tabla 2. Clasificación de Runyon de Micobacterias no Tuberculosas 30 Tabla 3. Criterios de diagnóstico para Infección Pulmonar dada por micobacterias no tuberculosas (NTM) 32 Tabla 4. Manera de informar los extendidos de la tinción de Ziehl- Neelsen 46 Tabla 5. Medios de cultivo 50 Tabla 6. Métodos para descontaminación de muestras 53 Tabla 7. Métodos no convencionales de cultivo de M. tuberculosis 60 Tabla 8. Reacciones bioquímicas selectivas para cinco micobacterias 66 Tabla 9. Técnicas comerciales para la detección de micobacterias 83 Tabla 10. Comparación de estudios de CDATs disponibles para la detección de MTB en muestras 87 Tabla 11. Evaluación del método AMPLICOR (PCR) para la detección de MTB en muestras s. 89 Tabla 12. Evaluación del método AMTD2 para la detección de MTB en muestras s. 91 Tabla 13. Evaluación del método LCx para la detección de MTB en muestras s. 92 Tabla 14. Evaluación del método BD Probe Tec (DTB) utilizado en la detección de MTB en muestras s. 93

12 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Esquema de las envolturas de una eubacteria Acido-Alcohol Resistente 20 Figura 2. Acontecimientos cronológicos después de la inhalación de M. Tuberculosis 23 Figura 3. Tuberculosis primaria y secundaria 25 Figura 4. Envase para la muestra 35 Figura 5. Tipo de muestra 38 Figura 6. Técnicas de tinción especificas para la detección de bacilos acidoalcohol resistentes en muestras s 43 Figura 7. Sistemas no radiométricos para la identificación de micobacterias 56 Figura 8. Prueba de Niacina 64 Figura 9. Prueba de Catalasa inhibida a 68ºC 65 Figura 10. Reducción de Nitratos 65 Figura 11. Cromatografía por capa fina para detección de ácidos micolicos 68 Figura 12. Algoritmo que refleja el manejo de las muestra de esputo. 69 Figura 13. Modelo de GLC para M. avium 70 Figura 14. Modelo representativo de HPLC 71 Figura 15. Algoritmo para la identificación de micobacterias por el método de amplificación de ácidos nucleicos 78 Figura 16. Algoritmo de muestras sospechosas de micobacteria 80 Figura 17. Ciclos de amplificación de BDProbe Tec ET 81 Figura 18. Descripción esquemática del método LCx M. tuberculosis 84 Figura 19. Método de INNO-LiPA MYCOBACTERIA V2 86

13 Resumen En la actualidad las especies que integran Mycobacterium tuberculosis complex son consideradas como el agente etiológico de la tuberculosis humana. Sin embargo, las especies del género Mycobcaterium en general son capaces de producir enfermedad en el humano, como lo son las llamadas micobacterias no tuberculosas o atípicas. A pesar que la identificación y el aislamiento de las micobacterias están basados en métodos tradicionales como la baciloscopia, tinciones, cultivos, pruebas bioquímicas, entre otros, han aparecido métodos moleculares que han generado gran impacto en el manejo de micobacterias en el laboratorio, ya que son rápidos, sensibles y específicos. Estos adelantos han reducido los tiempos de detección de las micobacterias, lo cual promueve al rápido diagnostico de la infección. En este trabajo se realiza una revisión y un análisis de las técnicas utilizadas en el aislamiento e identificación de micobacterias tuberculosas y no tuberculosas en muestras s. Abstract At present the species that comprise Mycobacterium tuberculosis are considered as the etiologic agent of human tuberculosis. However, the species of the Mycobacterium genus in general are capable of causing disease in humans, such as the so-called nontuberculous mycobacterial or atypical diseases. Despite the identification and isolation of mycobacteria are based on traditional methods such as smear, staining, culture, biochemical tests,among others, as well molecular methods have emerged which have generated great impact on the handling of mycobacteria in the laboratory, as they are fast, sensitive and specific. These advances have reduced the time of detection of mycobacteria, which promotes the rapid diagnosis of infection. In this paper is performed reviews and analysis of the used techniques in the isolation and identification of tuberculous and nontuberculous mycobacteria in clinical samples.

14 1. INTRODUCCION La tuberculosis en todo el mundo es la segunda enfermedad en orden de importancia de las enfermedades infecciosas responsables de la mortalidad de adultos (71). Es una enfermedad infecciosa crónica, causada por Mycobacterium tuberculosis, el cual es un bacilo aeróbico, intracelular, y, excepcionalmente, por M. bovis y otras micobacterias atípicas. Se caracteriza fundamentalmente por la formación de granulomas en los tejidos. Aunque se trata principalmente de una enfermedad pulmonar, que afecta también a otros órganos y tejidos. Puede ser mortal si el paciente no recibe el tratamiento adecuado y se han reportado muertes ocasionadas por cepas multidrogorresistentes (71). De acuerdo a los datos que ofrece la Organización Mundial de la Salud, un tercio de la población mundial se encuentra infectada con M. tuberculosis, aunque la mayoría de los sujetos (un 90%) (71) no desarrollarán la enfermedad, de igual manera, los individuos inmunodeprimidos se han presentado como altamente susceptibles a la infección. La epidemiología de la enfermedad ha cambiado radicalmente en años recientes, principalmente (pero no exclusivamente) en zonas geográficas marginadas de África, Asia y América, este cambio se presento después de la aparición del SIDA, y debido al descuido de los programas antituberculosos y a la resistencia creciente de M. tuberculosis ante los fármacos de elección (71,92). La reemergencia de la tuberculosis como problema de salud pública a nivel mundial, hace imperativo el diseño de estrategias de diagnósticos rápidos, sensibles y específicos para detectar tempranamente el patógeno (40).El diagnóstico inicial de las infecciones micobacterianas se basa en la observación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) y el aislamiento por cultivo, seguido de identificación bioquímica. La sensibilidad de la baciloscopia varía entre 30 y 80% y depende tanto del aislamiento en cultivo como de los métodos de recuperación utilizados y de la población evaluada. Por otra parte, debido al prolongado tiempo de duplicación de las micobacterias, las técnicas de aislamiento basadas en medios de cultivo a base de huevo coagulado requieren 3 a 8 semanas y su sensibilidad es muy baja cuando se analizan muestras biológicas que contienen un pequeño número de microorganismos (40). Las limitaciones que presentan los métodos tradicionales utilizados en el proceso de diagnostico de infecciones por micobacterias han creado la necesidad de 14

15 implementar nuevas estrategias para disminuir el tiempo necesario para el aislamiento e identificación de M. tuberculosis remitidas al laboratorio clínico (71,92). En la actualidad es necesaria la implementación de nuevos métodos en el laboratorio clínico para la detección rápida de M. tuberculosis en muestras biológicas como medios de cultivo no radiométricos y técnicas moleculares, las cuales son útiles no solo en la identificación rápida a partir de muestras s, sino que permiten además la detección de la susceptibilidad antimicrobiana de la micobacteria en estudio. 15

16 2. JUSTIFICACION La Tuberculosis (TB), es una enfermedad de origen bacteriano causada por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), se ha presentado como un problema no solo a nivel de salud pública nacional, sino también a nivel mundial. La continua movilización de la gente, el VIH/SIDA como infección de base, el bajo manejo de programas de prevención entre otros factores, han hecho que aumenten los casos de infección por micobacterias tuberculosas y atípicas (71,130). Para el control de la TB es necesario el diagnostico rápido de los casos a fin de interrumpir la cadena de transmisión. Los métodos microbiológicos tradicionales son poco eficientes dada su lentitud, adicionalmente en muchos casos es imposible realizar la identificación de la especie (5, 31). Las técnicas cromatografícas y moleculares demuestran ser mas eficientes, aunque no dejan de ser métodos complejos que requieren de una infraestructura costosa y gran entrenamiento, constituyendo una alternativa útil de identificación básicamente solo en aquellos centros con la dotación y experiencia suficiente (40). Para el personal de salud es muy importante conocer las técnicas que actualmente se manejan en la identificación de M. tuberculosis y otras micobacterias. Debido a lo anterior y con el fin de seleccionar las técnicas más apropiadas según las condiciones de trabajo, se presenta esta monografía con el fin de brindar una visualización general de las técnicas actualmente utilizadas en la identificación para estos microorganismos, y ofrecer una herramienta de información ágil y confiable. 16

17 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Compilar, definir y describir las diferentes técnicas microbiológicas y moleculares que son utilizadas actualmente en el aislamiento e identificación de micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Describir las características generales de las micobacterias tuberculosas y micobacterias atípicas. Mencionar la importancia de cada una de las técnicas utilizadas en el aislamiento e identificación de micobacterias Evaluar la utilidad diagnostica de las técnicas que se utilizan en la identificación de micobacterias tuberculosas y no tuberculosas, de acuerdo a la literatura revisada. 17

18 4. METODOLOGIA Para el desarrollo de esta monografía se realizó una búsqueda de artículos relacionados con las técnicas utilizadas en el aislamiento e identificación de micobacterias, en diferentes bases de datos, como lo son SCIENCE DIRECT, MEDLINE, MDCONSULT, Medical Lybrary (Proquest) y MedLatina (EbscoHost). Se seleccionaron aquellos artículos que fueron publicados dentro de los diez últimos años. Esta búsqueda se realizó en ingles y en español, por medio de las siguientes palabras claves relacionadas con los temas: Micobacteria /Mycobacteria Micobacterias atípicas/nontuberculous Mycobacterial Pulmonary / Nontubercolous mycobacteria Técnicas de aislamiento e identificación de micobacterias / Molecular techniques in Mycobacterial detection. Baciloscopia / Acid fast stain Técnicas Moleculares/ Molecular techniques 18

19 5. GENERALIDADES DE LAS MICOBACTERIAS Las micobacterias son bacterias de la familia Mycobacteriaceae, del orden actinomicetales, son bacilos aeróbicos, inmóviles y no esporulados, rectos o ligeramente curvos, a veces ramificados, que pueden presentar crecimiento filamentoso. La pared de las micobacterias posee un alto contenido de lípidos y ácidos micolicos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o Gram negativos. Las Micobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl- Neelsen (Tinción Acido-Rápida o Acid-Fast Stain), una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR) (46, 49,112,). Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias (Figura 1). Por encima de esta membrana se encuentra el rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina (57,71). Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc.) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón, porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de micobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente micobacteriano del lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de micobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manlam) a diferencia de las cepas no virulentas que no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos, denominadas PPD que significa derivado proteico purificado (59). 19

20 Figura 1. Esquema de las envolturas de una eubacteria Acido-Alcohol Resistente. Septiembre 10.21:18 Existen aproximadamente 54 especies de micobacterias, de las cuales 25 se han aislado de infecciones en el hombre (12,52). Mycobacterium tuberculosis causa la TB y es un patógeno muy importante para los humanos. Mycobacterium avium intracellulare (complejo M. avium o MAC; del ingles M. avium complex) y otras micobacterias atípicas con frecuencia infectan a pacientes con SIDA, son patógenos oportunistas en otras personas inmunodeficientes, y en ocasiones producen enfermedad en pacientes con sistema inmunitario normal (62, 92). Debido a la enorme importancia de la tuberculosis, los especialistas han separado el complejo Mycobacterium tuberculosis (formado por M. tuberculosis, M. bovis, y M. africanum, M. ulcerans) de las otras micobacterias. A excepción de M. leprae, las otras micobacterias se conocen como micobacterias atípicas o micobacterias no tuberculosas (2, 13,). 5.1 Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis es un bacilo aerobio obligado, no móvil, de crecimiento muy lento. No produce cápsula de polisacáridos. Presenta una membrana citoplásmica cubierta por una capa extensa de peptidoglicanos unidos a polisacáridos, los cuales se encuentran esterificados con los ácidos micólicos (60% del peso de la 20

21 pared celular), formados por lípidos libres, glucolípidos y peptidoglucolípidos; tal estructura, que le brinda una apariencia cerosa, le confiere una alta hidrofobicidad, resistencia a detergentes, a un buen número de antibióticos, a las tinciones habituales y le da afinidad por la tinción ácido alcohol resistente de Ziehl Neelsen y Kinyoun (33).Por otra parte, las cadenas de péptidos son antígenos responsables, de manera importante, de la estimulación de la respuesta inmune celular del hospedero (de hecho, se utilizan para preparar derivados proteicos purificados - PPD - útil como prueba de reactividad cutánea para evaluar la exposición a M. tuberculosis) (16, 52,101,115) Tuberculosis La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica, de incidencia creciente a nivel mundial, que representa un severo problema de salud pública. Se estima que la tercera parte de la población mundial está infectada, mueren 1.8 millones de personas, y aparecen de 8 a 9 millones de infecciones nuevas por año (90,96). La tuberculosis, es una de las enfermedades aguda o crónica más antiguas que afectan al ser humano, está causada por las bacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis. Esta enfermedad generalmente afecta al aparato respiratorio, pero puede afectar a otras partes del cuerpo como los nódulos linfáticos, huesos, articulaciones y riñones y también puede causar meningitis. Si se trata correctamente, la tuberculosis debida a cepas sensibles se cura prácticamente en todos los casos, pero sin tratamiento en más de la mitad de los casos puede ser mortal en 5 años. El contagio suele ocurrir por vía aérea, a través de las gotitas que expulsan los pacientes con tuberculosis pulmonar contagiosa. Sin embargo, la tuberculosis generalmente se disemina sólo a través de contactos próximos y prolongados con una persona infectada (16, 78, 105) Fisiopatología La interacción de M. tuberculosis comienza cuando las gotitas infecciosas de los pacientes infecciosos son inhaladas por alguna persona, es difícil establecer cuántos bacilos se necesitan para producir infección, pero se estima que entre 5 y 200 bacilos. La mayoría de los bacilos quedan atrapados en las vías respiratorias superiores y son expulsadas por el barrido ciliar de las células de la mucosa pero una parte de ellos, generalmente menos del 10 % llega hasta los alveolos (16). Estando la partícula infectante (bacilos tuberculosos) en el alveolo pulmonar de un individuo sin contacto previo, son fagocitados inespecíficamente por los 21

22 macrófagos alveolares no activados. Esa invasión de los macrófagos por las micobacterias puede deberse en parte a la unión C2a a la pared celular bacteriana, seguida de la opsonización de las bacterias por el C3b y de su reconocimiento por los macrófagos (16, 78). Los bacilos tuberculosos dentro del macrófago suelen multiplicarse libre y lentamente dando lugar a una inflamación con abundante fibrina, macrófagos, y en general, escasos polimorfonucleares produciendo la liberación de citoquinas que, a su vez, atraerán a más macrófagos y monocitos que de nuevo fagocitarán los bacilos (16, 78, 80,100). Se produce una acumulación de monocitos y bacilos intracelulares entre los días 7 y 21. La posterior necrosis tisular y de los macrófagos hace que se cree un medio desfavorable para la multiplicación de los bacilos. Esto se produce alrededor de la tercera semana, coincidiendo con la positivización del PPD. Adicionalmente a este hecho, parte de los macrófagos alveolares pueden alcanzar vía linfática, y desde aquí, ocurrir la diseminación vía hematógena, al resto del organismo, a órganos donde la presión de oxigeno es alta y favorable al crecimiento de las micobacterias, como los vértices pulmonares, los riñones, las suprarrenales los ganglios, las epífisis y metafisis de los huesos largos (44,72). En estas zonas se producen focos de multiplicación (granulomas) y se presenta una necrosis caseosa, hasta que de 2 a 10 semanas después de la primoinfección el sistema inmune detiene esta multiplicación y previene una futura diseminación (se produce la conversión de la prueba del PPD) (Figura 2.), por lo que estas zonas podrán ser en el futuro focos de posible reactivación (16,44, 96). En la mayoría de casos ni el complejo primario ni la diseminación hematógena ni ninguna de estas localizaciones causaran enfermedad aparente sino que serán subclinicas, es decir, que la infección puede progresar a enfermedad rápidamente en años después, o nunca reactivarse; en conjunto se calcula que alrededor del 10% de las personas infectadas acabara padeciendo la enfermedad (13,126). Una vez que se produce la infección, esta puede evolucionar a una de estas situaciones: que la infección se resuelva por sí misma. que en las siguientes semanas o meses se desarrolle una tuberculosis activa. que la infección se mantenga asintomática a lo largo de un tiempo (infección durmiente, latente o silente) y se active más tarde causando tuberculosis cuando se debilite el sistema inmunitario a causa de la edad o de otras enfermedades (reactivación) (56, 76). 22

23 Inhalación de M. tuberculosis Destrucción inmediata de MTB (PPD*) Complejo primario (PPD+) Estabilización Enfermedad localizada Diseminación de MTB Estabilización Enfermedad crónica Reactivación Figura 2. Acontecimientos cronológicos después de inhalación de M. Tuberculosis (MTB). Después de la inhalación de las gotitas de MTB se pueden presentar varios eventos. La micobacteria puede ser destruida por los macrófagos alveolares, en el caso de que no haya una verdadera infección. O bien, M. tuberculosis puede ser destruida inmediatamente y entonces se desarrollara un complejo primario que consiste en un pequeño infiltrado pulmonar con su nodo linfático de drenaje. Pequeñas calcificaciones pueden ser observadas por el examen radiográfico y en la prueba de PPD como marcador de una respuesta de células T especificas para M. tuberculosis.. Por lo general la infección es estabilizada en este punto. En una minoría de casos se puede desarrollar la enfermedad (tuberculosis primaria [TB]), en los pulmones o en otra parte después la diseminación hematógena de M. tuberculosis. Meses o años después, por lo general en condiciones de falla de la vigilancia inmune, la infección latente puede reactivar (TB postprimario) (24). Traducción de Reinout van Crevel,et.al.Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis-. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2002, p Manifestaciones s Antes del inicio de la epidemia del VIH, aproximadamente el 85% de los casos reportados estaban limitados a los pulmones, con el 15% restantes afectando sitios extrapulmonares o ambas. Sin embargo, las manifestaciones s de la tuberculosis pueden ser muy variables y dependen de muchos factores. El diagnóstico puede pasarse por alto en ciertos pacientes, en particular en los pacientes inmunosuprimidos quienes pueden tener hallazgos atípicos tanto en su presentación como en la radiografía de tórax donde pueden encontrarse infiltrados básales sin la presencia de cavidades (16,44, 55, 96). 23

24 La tuberculosis suele dividirse en pulmonar y extrapulmonar. Antes de que se conociera la infección por VIH, más del 80% de todos los casos de tuberculosis se localizaba en los pulmones. Sin embargo, en la actualidad los pacientes infectados por el VIH y que enferman de tuberculosis pueden padecer una enfermedad tuberculosa pulmonar y extrapulmonar, o solo extrapulmonar (16) Tuberculosis pulmonar La tuberculosis pulmonar esta dada por varias fases (figura 3). Tuberculosis fase primaria: Los macrófagos fagocitan los bacilos. En este caso pueden pasar dos cosas. Primero que los macrófagos impidan la multiplicación del bacilo a través de la producción de enzimas proteolíticas. Y por otro lado, que el bacilo comience a multiplicarse dentro del macrófago, lo que produce lisis celular. En este último caso, los monocitos no activados llegan al sitio de infección y fagocitan los bacilos liberados. Después de la infección suele aparecer una lesión periférica que se acompaña de adenopatías hiliares que pueden pasar desapercibidos en la radiografía de tórax. En la mayoría de los casos, la lesión cura espontáneamente y más tarde puede descubrirse por un pequeño nódulo calcificado (lesión de Ghon), la diseminación hematógena es acontecimiento frecuente y muchas veces asintomático, puede ser la manifestación más grave de esta primoinfección Es una fase generalmente asintomática (4, 46,65). Fase de respuesta tardía: ocurre de 2 a 4 semanas después de la infección. En esta fase se activan dos nuevas respuestas: respuesta de lesión tisular, producto de una respuesta de hipersensibilidad de tipo IV, en la cual se produce una destrucción de los monocitos que contienen bacilo en fase de replicación. Respuesta de activación de macrófagos, que corresponde a una respuesta mediada por células en la cual se activan nuevos macrófagos para la fagocitosis de los bacilos. El equilibrio entre ambas respuesta es el que va a determinar el tipo de TBC que aparecerá con posterioridad (4, 46). Fase granulomatosa, corresponde a una fase final, la que comienza después del desarrollo de la inmunidad específica y en la que hay una acumulación de gran cantidad de macrófagos activados en la zona de lesión. Se forma así el granuloma tuberculoso que corresponde a una acumulación de linfocitos y macrófagos alrededor de la infección primaria, se produce una necrosis caseosa del centro del tubérculo en la cual es posible distinguir algunos microorganismos. El bacilo puede sobrevivir en este ambiente, aunque su crecimiento queda inhibido por el ambiente necrótico (3, 41,91). 24

25 TBC Primaria: Proliferación de los organismos especialmente en la periferia y justo debajo de la pleura, se forma el foco de Ghon. Generalmente hay diseminación a los ganglios peribronquiales. Foco de Ghon + compromiso ganglios peribronquiales. Complejo Primario Cicatrización Progresión del complejo Figura 2. Tuberculosis primaria (77) Diseminación Bronquial Diseminación Hematógena TBC Secundaria: Se forma lesión apical. Lesión de Assmann, histológicamente igual al foco de Ghon. Generalmente no hay afectación de los ganglios peribronquiales. Foco de Assmann Curación por fibrosis Progresión Focal Contención de la infección Reactivación por el rompimiento de la pared fibrosa Diseminación Figura 3. Tuberculosis secundaria (77) Importante: A pesar de que exista una curación con cicatrización y contención de infección, tanto en la TBC primeria como en la secundaria, es posible que se produzca una reactivación muchos años después de la infección, generalmente por la disminución de las defensas, por ejemplo por inmunosupresión, malnutrición o por infección por VIH. Figura 3. Tuberculosis primaria y secundaria. KUMAR, Vinay Robbins y Cotran, patología estructural y funcional. 7a ed. Madrid, España ; Amsterdam : Elsevier, Clínica En las primeras fases evolutivas de la enfermedad las manifestaciones s suelen ser inespecíficas e insidiosas, consistiendo sobre todo en fiebre y sudores nocturnos, perdida de peso, anorexia, malestar general y debilidad, sin embargo, 25

26 casi siempre acaba apareciendo tos (que al principio puede ser seca y después se acompaña con expectoración purulenta). Con frecuencia se advierten estrías de sangre en el esputo. A veces aparece una hemoptisis masiva como consecuencia de la erosión de un vaso totalmente permeable situado en la pared de una caverna, o bien a la rotura de un vaso. Las formas extensas de la enfermedad pueden producir disnea y en ocasiones, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (16). En cuanto a los signos físicos son poco útiles en el diagnostico de la tuberculosis primaria Tuberculosis extrapulmonar La tuberculosis (TB) extrapulmonar supone el 10-20% del total de TB que padecen los enfermos inmunocompetentes, aunque esta frecuencia de presentación se incrementa notablemente en las personas portadoras de algún grado de inmunodeficiencia. Los enfermos con TB y SIDA severamente inmunodeprimidos pueden presentar localizaciones extrapulmonares hasta en un 60% de los casos (91). Si exceptuamos la afectación pleural, la localización más frecuente es la ganglionar, pleural, seguida de la urogenital, la osteoarticular, meninges y peritoneo, siendo el resto de localizaciones muy infrecuentes (46,91). En la práctica, la totalidad de los casos de TB extrapulmonar se presenta un foco primario en el pulmón, que puede ser visible o no en la radiografía de tórax. Se admite que desde este foco primario pulmonar se puede producir una diseminación, bien por contigüidad, bien por vía linfática o por vía hematógena, siendo esta última vía la causante de la mayoría de las TB extrapulmonares a excepción de la pleural y la linfática (16,33) Formas extrapulmonares frecuentes Tuberculosis y sistema nervioso central La afectación del sistema nervioso central (SNC) por la TB incluye principalmente tres formas s: Meningitis tuberculosa Tuberculoma intracraneal Aracnoiditis tuberculosa espinal De las tres formas s de presentación, en regiones donde las tasas de incidencia de tuberculosis son bajas como Norte América y Europa Occidental, la forma dominante en el SNC es la meningitis tuberculosa. Representa el 5% de los casos de tuberculosis extrapulmonar. Es más frecuente en niños pequeños, pero también afecta a adultos especialmente a aquellos con infección VIH (16,24). 26

27 En las primeras fases evolutivas de la enfermedad las manifestaciones s suelen ser inespecíficas e insidiosas, consistiendo sobre todo en fiebre y sudores nocturnos, perdida de peso, anorexia, malestar general y debilidad, sin embargo, casi siempre acaba apareciendo tos (que al principio puede ser seca y después se acompaña con expectoración purulenta). Con frecuencia se advierten estrías de sangre en el esputo. A veces aparece una hemoptisis masiva como consecuencia de la erosión de un vaso totalmente permeable (16,24) Linfadenitis tuberculosa (Tuberculosis ganglionar) Es la causa más frecuente de tuberculosis extrapulmonar. Se objetiva en más del 25 % de los casos de tuberculosis, siendo más frecuente en pacientes infectados por VIH. En EEUU se objetiva que el 31% de los casos 8 y en la India en niños mayores de 14 años alcanza el 4,4 por En los países desarrollados la mayoría de los casos de linfadenitis tuberculosa se describen en inmigrantes. En los países en vías de desarrollo el porcentaje de casos puede ascender al 43 % de los casos de tuberculosis. La linfadenitis tuberculosa es frecuente en los pacientes infectados por VIH10, ocurre hasta en el 60% de los pacientes y frecuentemente se asocia a afectación pulmonar. Generalmente esta forma extrapulmonar tiene lugar con CD4 menor de 300 células/ ml. En el pasado esta forma de tuberculosis tenía lugar típicamente en la infancia; en la actualidad la edad media es de 40 años (13, 41, 61, 71) Tuberculosis renal y de vías urinarias La tuberculosis puede afectar principalmente al sistema urinario, con infección directa al riñón y vías urinarias o produciendo secundariamente una amiloidosis renal. En los países occidentales sólo de un 8 a 10% de los pacientes con tuberculosis pulmonar desarrollan una tuberculosis renal. Es más frecuente en adultos jóvenes y varones. En el aparato genitourinario el riñón, el epidídimo y la próstata son las localizaciones de inicio de la infección; el resto de los órganos genitourinarios se pueden afectar por diseminación ascendente o descendente. Los testículos se pueden afectar por vía epididimaria (41,71) Tuberculosis genital Endometritis tuberculosa La tuberculosis con afectación del tracto genital superior es una patología muy rara en los países desarrollados. Frecuentemente ocurre en mujeres jóvenes procedentes de países endémicos y en mujeres ancianas con tuberculosis previa sin tratamiento tuberculostático adecuado. Patogenia La afectación genital generalmente se produce por siembra hematógena de un foco pulmonar. La diseminación genital desde un foco intraabdominal o vía sexual 27

28 a través de una epididimitis de la pareja es muy infrecuente. En las mujeres la localización en trompa y en endometrio es más frecuente, aunque el ovario y el cérvix pueden afectarse también. La afectación vulvar y vaginal es muy infrecuente (41) Pericarditis tuberculosa A pesar de la disminución de la incidencia global de tuberculosis y por lo tanto de la pericarditis tuberculosa en los países industrializados, la pericarditis tuberculosa sigue siendo un problema importante por su dificultad diagnóstica y las serias consecuencias que conlleva el no tratamiento de la infección. La pericarditis tuberculosa se estima que ocurre entre 1-2 % de los pacientes con tuberculosis pulmonar. Pero existe variabilidad entre países incluso desarrollados. En España en una serie publicada en 1988 realizada en 294 pacientes inmunocompetentes con pericarditis aguda se diagnosticó en 13 (4,4%) pericarditis tuberculosa (13,41). Patogenia Puede ocurrir por extensión local de la infección desde el pulmón, bronquios, ganglios linfáticos adyacentes, esternón y por siembra peritoneal. En muchos pacientes la pericarditis tuberculosa constituye una reactivación de la enfermedad sin que en muchos casos se conozca el foco primario (13,41) Tuberculosis en aparato digestivo Enteritis tuberculosa Patogenia La patogénesis se ha atribuido esencialmente a cuatro mecanismos: deglución de esputo, diseminación hematógena desde el pulmón, ingesta de comida o leche contaminada, diseminación por contigüidad. La localización más frecuente es la región ileocecal. Parece ser que esta localización no es fortuita y que se explica en parte por el estasis venolinfático y el abundante tejido linfoide. El bacilo penetra en la mucosa y se localiza en el tejido linfoide submucoso donde se inicia la reacción inflamatoria con linfangitis, endarteritis, formación de granulomas, necrosis caseosa y ulceración mucosa. Las lesiones macroscópicas se pueden caracterizar como: Ulcerativas en el 60% de los casos; este patrón se ha asociado a mayor agresividad. Hipertróficas en el 10 % de los casos; caracterizadas por lesiones pseudotumorales. Ulcerohipertróficas el 30%; es la forma más frecuente de afectación ileocecal. 28

29 Tuberculosis y sistema musculoesquelético Introducción y epidemiología En EE.UU, la tuberculosis de huesos y articulaciones es responsable del 10% de los casos de enfermedad extrapulmonar. La afectación ósea y articular por tuberculosis supone el 35% de todas las formas de tuberculosis extrapulmonar y el 2% de todos los casos de tuberculosis. La mitad de los pacientes con afectación musculoesquelética tienen como localización preferente la columna vertebral, en segundo lugar se encuentra la artritis tuberculosa seguida de la osteomielitis extraespinal. La tuberculosis vertebral, también denominada como enfermedad de Pott o espondilitis tuberculosa, afecta principalmente a la columna lumbar y a la dorsal baja. Se puede asociar a un abceso paravertebral bilateral. La artritis tuberculosa tiende a localizarse en las articulaciones que soportan peso como la cadera y la rodilla, esta afección es generalmente es del tipo monoarticular (13,41). Patogenia La infección tuberculosa primaria produce una bacilemia diseminada, los cuerpos vertebrales son vulnerables a esta siembra debido a la gran vascularización que presentan incluso en la edad adulta. Los focos de diseminación permanecen latentes controlados por mecanismos inmunes locales y en situaciones como la desnutrición, la edad avanzada, la infección por VIH, o el fallo renal en los que estos mecanismos se alteran se produce una reactivación con progresión de la enfermedad osteomuscular (13,41). Existe una clasificación de la tuberculosis, propuesta por la Sociedad Americana de Enfermedades del Tórax (ATS), basada en la patogenia de la misma. Tabla 1. Sistema de Clasificación de la TBC, según la sociedad Americana del tórax Sistema de Clasificación de la TBC Clase Tipo Descripción 0 No exposición a TBC No infectado No historia de exposición Reacción a la tuberculina negativa. 1 Exposición a TBC No evidencia de infección Historia de exposición Tuberculina negativa 2 Infección TBC No infectado Reacción positiva a la tuberculina Estudios bacteriológicos negativos ( si hecho) No existe evidencia ni, radiológica ni bacteriológica de TBC 3 TBC activa cultivo de M. tuberculosis Evidencia, bacteriológica o radiológica de TBC 4 TBC No hay actividad Historia de episodios de TBC o Hallazgos anormales pero estables en la radiografía Reacción positiva a la tuberculina Estudios bacteriológicos negativos y No hay evidencia o radiográfica de TBC activa 5 Sospecha de TBC Diagnostico pendiente TBC debería ser descartada en el plazo de 3 meses LÓPEZ Marín Luz María. Tuberculosis humana y bovina en Latinoamérica: De estudios sobre virulencia hacia herramientas para su control. Vol. 48, No. 2 Abril - Junio pp

30 5.2 Micobacterias atípicas Las micobacterias atípicas o micobacterias no tuberculosas (MNT) son bastoncillos cortos y rectos, como cocobacilos, que se reconocen clásicamente por ser acidorresistentes, es decir, que una vez teñidos, estos microorganismos no se decoloran fácilmente, ni siquiera con los ácidos o el alcohol, debido a la composición de la pared celular. La relación genética de las distintas micobacterias entre sí se manifiesta por la semejanza estructural de las secuencias de su ARN ribosómico, la cual se puede utilizar con fines diagnósticos (13, 20,41). Las MNT están ampliamente distribuidas en el medio ambiente, fundamentalmente en el agua (incluida agua del grifo), suelo, polvo, leche, alimentos, pájaros entre otros animales y en la tierra, de la misma manera que pueden habitar en superficies corporales y secreciones sin causar enfermedad (20). El reservorio como se mencionaba anteriormente es, en la mayoría de ellas, el agua por ejemplo en el caso de M. avium complex son los grifos de agua. Por su parte, M. kansasii se ha aislado de forma repetida en sistemas de conducción de agua y grifos; y M. xenopi, al necesitar temperaturas superiores a 42º C para su crecimiento, se aísla casi exclusivamente del agua caliente o sus sistemas de conducción, hecho que puede producir casos intrahospitalarios. M. marinum tiene su reservorio y se transmite a través del agua salada, pescado fresco, agua embalsada y piscinas, mientras que las MNT de crecimiento rápido, como M. fortuitum, M. chelonae y M. abscesus, se pueden aislar de la tierra y del agua, aunque la causa más común de enfermedad se produce por transmisión nosocomial (5,13.20,41). Tabla 2. Clasificación de Runyon de Micobacterias no Tuberculosas. CLASIFICACION RUNYON DESCRIPCION CRECIMIENTO PRODUCCION DE PIGMENTO I Fotocromógenas Lento Amarillo naranja. Producción de pigmento en presencia de luz. II Escotocromógenas Lento Amarillo naranja Producción de pigmento sin exposición a la luz. ESPECIE M. asiaticum M. kansasii M. marinum M. simiae M. flavescens M. gordonae M. scrofulaceum M. szulgai M. xenopi III No cromógenas Lento Sin pigmento M. africanum M. avium M. bovis M. gastri M. genavense M. haemophilum IV Rápido crecimiento Rápido crecimiento (produce colonias maduras 7 días) Sin pigmento M. fortuitum M. chelonae M. abscessus M. mucogenicum M. peregrinum M. porcinum Traducido al español de Nontuberculous Mycobacterial Infections. J.M. García Garcíaa.et.al. Infecciones respiratorias por micobacterias ambientales. Arch Bronconeumol. 2005;41(4):

31 Se han identificado más de 125 especies de MNT, de las cuales se dice que 60 de estas producen enfermedad importante (20,21,41). Su importancia ha ido en aumento en relación con la mejora de los medios diagnósticos y la descripción de los cuadros clínicos que producen, así como por la predisposición a su desarrollo evidenciada en los pacientes inmunodeprimidos, fundamentalmente por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (20,21). Tradicionalmente, MNT ha sido agrupado en 4 amplias categorías según el sistema Runyon (Tabla 2). En esta clasificación, MNT es dividido por la producción de pigmento en los medios de cultivo sólidos e índices de crecimiento (13, 21,41), de igual manera por las reacciones bioquímicas (71). Sin embargo, esta clasificación no agrupa las micobacterias descubiertas más recientemente, sí es útil para clasificar las especies más importantes desde el punto de vista clínico. Además, se ha observado que en la mayoría de las nuevas micobacterias hay una gran correlación entre sus características genotípicas y las fenotípicas, formando árboles filogenéticos que agrupan a las diferentes micobacterias (21) Fisiopatología de las MNT Todavía no es muy clara la fisiopatología de la infección y enfermedad producida por MNT; diversos estudios sugieren que la transmisión persona-persona es rara, produciéndose la mayoría de los casos a partir de MNT distribuidas en el medio ambiente (16), se forman lesiones granulomatosas indistinguibles de las producidas por M. tuberculosis, por lo que se presume que la patogenia es similar (31). El mecanismo de transmisión más aceptado es el de la aerosolización de microorganismos procedentes del agua natural o de los sistemas de agua domésticos o de instituciones en la afección respiratoria o por su ingestión por vía digestiva a través de la cual se puede desarrollar infección diseminada, como en el caso de la linfadenitis en niños y en las formas diseminadas en pacientes con SIDA (colonización del tracto digestivo) (2, 20,21). En pacientes con infecciones de partes blandas se ha descrito la inoculación directa de microorganismos a partir del agua y otros materiales (20). Se desconoce aún si existe un periodo de latencia tras la infección, pero las formas s de presentación más habitualmente descritas siempre han sido la pulmonar, linfadenitis, abscesos de piel y partes blandas; y osteomielitis, siendo los agentes más frecuentemente involucrados M. avium complex, M. intracellulare, M. kansasii, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae y M. scrofulaceum (13,20,23) Manifestaciones s y criterios de diagnóstico Las infecciones diseminadas por MNT aparecen casi exclusivamente en los pacientes con inmunodeficiencias graves, generalmente en los pacientes con SIDA (2324). Además, hay que destacar la forma diseminada en estas 31

32 enfermedades producidas por MNT. Existen dos posibles presentaciones. La primera de ellas afecta a pacientes sin SIDA pero que son inmunodeprimidos (neoplasias, trasplantados, tratamiento prolongado con esteroides, etc.), siendo los gérmenes aislados con más frecuencia M. avium complex y M. kansasii. M. avium complex produce un cuadro de fiebre alta de origen desconocido, mientras que las otras especies de micobacterias atípicas producen nódulos y abscesos subcutáneos que drenan espontáneamente. La mortalidad está relacionada directamente con el tipo y la gravedad de la enfermedad subyacente (16,19, 30). Tabla 3. Criterios de diagnóstico para Infección Pulmonar dada por Micobacterias no (NTM) *. Criterios de diagnóstico de enfermedad pulmonar producida por las MNT 1. Clínicos: Síntomas y signos compatibles (tos, fiebre, perdida de peso, hemoptisis, Disnea) con deterioro del estado clínico. Exclusión de otras enfermedades o tratamientos de otras patologías que pudieran producir un deterioro clínico. 2. Radiológicos: En radiología simple de tórax: Infiltrados con o sin nódulos, cavitación, nódulos únicos o múltiples. En tomografía computarizada de alta resolución del tórax: Múltiples nódulos de pequeño tamaño y bronquiectasias multifocales con o sin pequeños nódulos pulmonares. 3. Bacteriológicos. Siempre que se cumpla uno o más de los siguientes apartados: Siempre que se puedan obtener, al menos, 3 muestras de esputo o lavado broncoalveolar (LBA) en un año: 3 cultivos positivos con baciloscopias negativas, ó 2 cultivos positivos y una baciloscopia positiva. Ante la incapacidad de obtener esputos, un LBA: Con cultivo positivo (2+, 3+, 4+), ó Cultivo positivo con una baciloscopia positiva (2+, 3+, 4+). Biopsia: Cualquier crecimiento en los cultivos de muestras obtenidas a partir de biopsias broncopulmonares. Granulomas y/o visión de bacilos ácido-alcohol resistentes en una biopsia pulmonar con uno o más cultivos positivos de esputo o LB A. Cualquier crecimiento obtenido de muestras extrapulmonares estériles. Revisado por American Thoracic Society..M. García Garcíaa.et.al. Infecciones respiratorias por micobacterias ambientales. Arch Bronconeumol. 2005;41(4):