El Laboratorio en el diagnóstico de las tuberculosis y Micobacterias atípicas: Herramientas diagnósticas disponibles en Chile

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1 El Laboratorio en el diagnóstico de las tuberculosis y Micobacterias atípicas: Herramientas diagnósticas disponibles en Chile Dra. Patricia González A. Médico Microbiólogo Laboratorio Clínica Alemana Facultad de Medicina Clínica Alemana-Universidad del Desarrollo

2 LABORATORIO DE MICOBACTERIA 24 Marzo 1882 Robert Koch descrubre tincion 1890 Robert Koch descrubre Tuberculin Métodos nuevos para identificación y clasificación Laboratorios de referencia y manuales Métodos nuevos de cultivo, sondas genéticas y análisis de ac. micólicos Métodos amplificación genética para detección, genotipificación PCR tiempo real, GIRA secuenciación.

3 Diagnóstico Microbiológico de enfermedad tuberculosa Detección de agente Directa de la muestra Microscopía (masa crítica) Amplificación ácidos nucleicos Aislamiento del agente Cultivo convencional Cultivo automatizado

4 Diagnostico Microscópico

5 BACILOSCOPIA Muestra directa Técnica fácil y rápida Sin procesamiento de muestra Permite tamizaje de pacientes Evalúa grado de infectividad Muestra procesada Técnica de referencia Necesita equipamiento básico Requiere procesamiento de muestra Descarta paciente bacilífero

6 Rendimiento microbiológico en infección por M. tuberculosis complex Clínica Alemana baciloscopia 35% cultivo 65%

7 Optimización del rendimiento en cultivo de micobacterias Aumentar el aislamiento o Obtención de muestra representativa o Reducir la contaminación de la muestra o Selección de una adecuada técnica de descontaminación Aumentar velocidad de crecimiento o Reducción del efecto de descontaminación o Selección de medio de cultivo o Sistema de detección de crecimiento

8 Procesamiento de una Muestra Contaminada Acción mucolítica Acción descontaminante Tiempo de exposición Fase de neutralización Centrifugación etapa crítica

9 Métodos de Descontaminación o Petroff: NaOH 4% min o NALC-NaOH 2% 15 min o Ac. oxálico 5% 30 min o Ac. sulfúrico 4% min

10 % MUESTRASPOSITIVAS Comparación de dos métodos de descontaminación para estudio de Micobacterias 4 3,6 3,5 3 2,8 2,8 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1,8 2001(1075) 2002 (1008) baciloscopia cultivo

11 Aumento de aislamiento Micobacterias Adecuada toma de muestra (representatividad, contaminación) Selección de una técnica de procesamiento adecuada a realidad local Incorporación de nuevos medios de cultivos Método de cultivo automatizado

12

13 Sistema automatizado de detección VENTAJAS Mayor Sensibilidad que medios sólidos Aumenta recuperación de M. No tuberculosa Mayor Rapidez en detección de crecimiento M. tuberculosis 2-3 semanas M. No tuberculosas 1-2 semanas Monitoreo continuo de crecimiento Micobacterias Permite identificación a partir de botella Estudio de sensibilidad a drogas antituberculosas

14 % cepas Velocidad detección de crecimiento de cultivo automatizado de micobacterias 100% >30 dias 90% < 30 dias 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% M. avium complex (6) M. gordonae (3) M. kansasii (3) M. tuberculosis complex(68) Otras micobacterias (6) Clinica Alemana

15 Sistema automatizado de detección Micobacterias LIMITACIONES Mayores tasas de contaminación Dificultad para reconocer cultivos mixtos Incapacidad de observar morfología y cuantificación Obliga a tener sistema de identificación rápida No reemplaza a sistema convencional

16 Pacientes con infección por Micobacterias Diciembre Abril 2010 M. genovese, 1 Mycobacterium spp, 2 M. abscessus, 1 M. kansasii, 1 M. tbc, 5 MAC, 11

17 METODOS PARA IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS Fenotípicos Velocidad crecimiento Fotorreactividad Niacina Morfología de la colonia Expresión antígeno MPT64 Moleculares

18 Morfologia de la colonia

19 Detección de antígeno MPT64 Método inmunocromatograficos (lateral flow) Ac. monoclonales contra antígeno MPT64 Medio solido o líquido M. tuberculosis y algunos M. bovis En Chile MGIT TBc ID BD TB Ag MPT64 SD

20 Métodos genéticos para identificación de micobacterias Hibridación mediante sondas genéticas AccuProbe MYCO Gene Probe PCR M. tuberculosis complex M. avium complex M. kansasii M. gordonae Análisis cromatográfico HPLC Secuenciación

21 PCR mediante tecnología de DNA en tira Speed-Oligo Mycobacteria 12 especies M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum), M avium-intracellulare- scrofulaceum M. chelonae-abscessus, M. kansasii, M. fortuitum M. gordonae.

22 PCR mediante tecnología de DNA en tira

23 GenoType Mycobacterium CM (GTM-CM) assay (Hain Lifescience, Nehren, Germany) The GenoType Mycobacterium CM permits the simultaneous molecular genetic identification of the M. tuberculosis complex and 14 of the most common NTM species

24 Tiempo de respuesta en estudio de Micobacterias Cultivo tradicional: De L a J 3 a 5 semanas Identificación bioquímica 2-3 semanas adicional Estudio susceptibilidad en agar 2-3 semanas adicional Cultivo automatizado: 3 días a 3 semanas Identificación mediante sonda genética: 1 a 2 días Susceptibilidad en medio automatizado: 5 días adicionales PCR para detección e identificación 1-2 días

25 Control de tuberculosis Fase 1 Control Enfermedad Epidemiológico: Cortar cadena trasmisión Individual: Terapia Fase 2 Control Infección Epidemiológico: Erradicación de potencial reservorio futuro Individual: Prevenir la enfermedad por reactivación endógena

26 Infección tuberculosa Definición: Presencia de M. tuberculosis en ausencia de síntomas ni de evidencia radiográficas de enfermedad tuberculosa Detección dirigida a Pacientes en riesgo de infección reciente Pacientes en riesgo de reactivación de infección latente Propósito: Terapia

27 Detección de infección tuberculosa Test cutáneo: PPD Evoca respuesta de hipersensibilidad retardada en personas con infección por M. tuberculosis Test en sangre Mide la liberación de - interferón como respuesta a estímulo con antígenos específicos de M. tuberculosis.

28 Test cutáneo con PPD Mide la respuesta de hipersensibilidad a un derivado de proteína (antígenos crudos compartidos por: M. tuberculosis, M. bovis, cepa BCG y por otras micobacterias no tuberculosas ) Inoculación intradérmica de 2 U de RT23 No permite discriminar entre enfermedad e infección latente.

29 Técnica de PPD

30 Evaluación in vitro de liberación de -INF Muestras deben ser procesadas dentro de las 12 horas. de extraída la sangre Utilización de antígenos de expresión precoz de M. tuberculosis Proteínas secretadas de bajo peso molecular (ESAT-6 y CFP-10 ) Antígenos no compartidos con M. bovis, BCG y otras micobacteria no tuberculosis excepto M.kansasii, M. szulgai, M.flavescens, y M. marinum.

31 Antígenos utilizados en test ex vivo Proteínas ESAT-6 y CFP-10 : Test comerciales QuantiFERON-TB [Cellestis Limited, Victoria, Australia] T SPOT-TB [Oxford Immunotec, Oxford, United Kingdom] No distingue tuberculosis activa de infección latente. Sensibilidad para tuberculosis activa 74% Nivel cae luego de 3 meses de terapia efectiva

32 jit Lalvani T cell-based diagnosis of childhood tuberculosis infection Current Opinion in Infectious Diseases 2007, 20:

33 Elispot CONTROL NULO ESAT-6 CFP-10 CONTROL POSITIVO

34

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