Anexo X Técnicas disponibles en el Centro Nacional de Microbiología (CNM) para el Diagnóstico del SRAS

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2 Técnicas disponibles en el Centro Nacional de Microbiología (CNM) para el Diagnóstico del SRS 1.- islamiento en cultivos celulares Técnica de aislamiento de coronavirus-srs en cultivos celulares Técnica de aislamiento de otros virus respiratorios en cultivos celulares Cuando el caso lo requiera, por sus características epidemiológicas y clínicas o por haberse confirmado un diagnóstico especifico de alguno de los virus respiratorios incluidos en las técnicas moleculares de rt-nested PCR, se inocularán lineas celulares diferentes para análisis de otros virus respiratorios. 2.- Técnicas moleculares. Detección de ácidos nucleicos virales Diagnóstico etiológico de SRS Diagnóstico diferencial con otros virus respiratorios 3.- Técnicas de microscopía electrónica La identificación mediante estas técnicas se realiza por las características ultra estructurales de los virus, por lo que no sólo se detecta la presencia del virus del SRS, sino de cualquier otro virus presente en la muestra en concentración adecuada 4.- Diagnóstico serológico de SRS Métodos específicos para la detección de anticuerpos frente a coronavirus-srs Métodos para el diagnóstico diferencial de otros agentes productores de neumonía dicionalmente se dispone de un ensayo de ELIS para la identificación de antígenos solubles de L. Pneumophila en orina 1

3 1.- ISLMIENTO EN CULTIVOS CELULRES TÉCNIC DE ISLMIENTO DE CORONVIRUS-SRS EN CULTIVOS CELULRES Las muestras clínicas se inoculan en las siguientes lineas celulares: Vero E6: células de riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops clon E6. FP: Fibroblastos de pulmón humano. LLC-MK2: células de riñón de mono Rhesus monkey y Macaca mulatta MDCK: células de riñón de perro TÉCNIC DE ISLMIENTO DE OTROS VIRUS RESPIRTORIOS EN CULTIVOS CELULRES Cuando el caso lo requiera, por sus características epidemiológicas y clínicas o por haberse confirmado un diagnóstico especifico de alguno de los virus respiratorios incluidos en las técnicas moleculares de RT-nested PCR, se inocularan lineas celulares diferentes para análisis de otros virus respiratorios: Hep-2: células de carcinoma epidermoide humano 549: células de carcinoma de pulmón humano NCI-H292: células de carcinoma mucoepidermoide humano RD: células de rhabdomyosarcoma BGM: células de riñón de mono Buffalo verde 2.- TECNICS MOLECULRES. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS VIRLES DIGNÓSTICO ETOLÓGICO DE SRS a) Ensayo 1: RT- nested PCR (de elección por su elevada sensibilidad) Primers: Diseñados por Dr. Christian Drosten (Hamburgo, lemania). Se recibieron las secuencias especificas de los primers el 26 de Marzo de El protocolo enviado por el Dr. Drosten ha sido modificado y adaptado a nuestro laboratorio para obtener la máxima 2

4 sensibilidad. b) Ensayo 2: RT-nested PCR (complementaria al ensayo 1) Se utiliza para comparación de los resultados con el Ensayo 1. Primers: Diseñados por el grupo Canadiense. Se publicaron las secuencias el 31 de Marzo de 2003 (www.nejm.org, Poutanen et al. The New England Journal of Medicine). El protocolo publicado ha sido modificado y adaptado a nuestro laboratorio para obtener la máxima sensibilidad. c) Ensayo comercial de PCR a Tiempo Real: PCR cuantitativa Ensayo comercial realizado según las instrucciones del fabricante Real rt HP-Coronavirus LC RT PCR DIGNÓSTICO DIFERENCIL CON OTROS VIRUS RESPIRTORIOS a) Ensayo 1: Multiplex 1 RT- nested PCR (Coiras et al. JMedVirol 2003, 69: ) Virus detectados: Influenza, Influenza B, Influenza C, RSV, RSV B, denovirus Diferenciación especifica de los virus en función del tamaño de los respectivos productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa. b) Ensayo 2: Multiplex 2 RT- nested PCR (Coiras et al. JMedVirol, en prensa). Virus detectados: Coronavirus 229E, Coronavirus OC43, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3, Parainfluenza 4a, Parainfluenza 4b, Enterovirus, Rinovirus Diferenciación especifica de los virus en función del tamaño de los respectivos productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa. c) Ensayo de RT- nested PCR para detección de Metapneumovirus humano 3.- TÉCNICS DE MICROSCOPÍ ELECTRÓNIC 3

5 La identificación mediante estas técnicas se realiza por las características ultraestructurales de los virus, por lo que no sólo se detecta la presencia del virus del SRS, sino de cualquier otro virus presente en la muestra en concentración adecuada a) Ensayo 1: Técnica rápida de Tinción Negativa El método detecta particular víricas completas o subcomponentes característicos en muestras directas de pacientes o en cultivos celulares infectados en el laboratorio con dichas muestras. La Tinción Negativa es una técnica rápida: el resultado de una muestra se puede obtener en menos de 2 horas. b) Ensayo 2: Inclusión en resina y Ultramicrotomía Se utiliza en algunas muestras como complemento a la técnica rápida de tinción negativa. El método de cortes ultrafinos detecta componentes internos de las particular víricas, que en determinados casos son fundamentales para la caracterización especifica del virus. Las técnicas de inclusión y ultramicrotomía requieren varios días de procesamiento. 4.- DIGNÓSTICO SEROLÓGICO DE SRS MÉTODOS ESPECÍFICOS PR L DETECCIÓN DE NTICUERPOS FRENTE CORONVIRUS-SRS. a) Ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la detección cualitativa de IgM especifica frente a coronavirus-srs (Euroimmun, lemania) b) Ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la detección cuantitativa de IgG especifica frente a coronavirus-srs (Euroimmun, lemania) En la actualidad resultados obtenidos con estos ensayos están siendo contrastados con la colaboración del Dr Matthias Niedrig (Instituto Robert Koch), coordinador del European Network for Viral Imported Diseases MÉTODOS PR EL DIGNÓSTICO DIFERENCIL DE OTROS GENTES PRODUCTORES DE NEUMONÍ 4

6 a) Técnica de fijación del complemento para detección cuantitativa de anticuerpos frente a gripe, gripe B, adenovirus, virus respiratorio sincitial, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Coxiella burnetti, citomegalovirus. b) Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección cualitativa de IgM frente a Chlamydia psitacci, C. pneumoniae y C. trachomatis. c) Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección cuantitativa de IgG frente a C. psitacci, C. pneumoniae y C. trachomatis. d) Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección cualitativa de IgM frente a Legionella pneumophila. e) Técnica de inmunofluorescencia indirecta para la detección cuantitativa de IgG frente a L. pneumophila. f) Técnica de ELIS para la detección cuantitativa de anticuerpos IgG frente a Hantavirus (virus Hantaan y Puumala) g) Técnica de ELIS para la detección cualitativa de anticuerpos IgM frente a Hantavirus (virus Hantaan y Puumala) dicionalmente se dispone de un ensayo de ELIS para la identificación de antígenos solubles de L. pneumophila en orina 5

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