2, BARCELONA

Transcripción

1 Proyecto Nº SC ESTRATEGIAS PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DEL SINDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO (SRRP) EN LINEAS CELULARES DERIVADAS DE MACROFAGOS Y SU APLICACION EN EL DIAGNOSTICO Equipo Investigador: Joan Pujols Romeu (MSc. Vet.) José Ignacio Badiola Saiz (MSc. Med.) Ana María Pérez de Rozas (L.B.) Rosa Rosell Bellsola (L.B.) Alberto San Gabriel Closas (Dr. Vet.) Amelia Fernández Villamarín (L.Far.) Equivalente de jornada completa: 2,00 Centro de Investigación: Unidad de Sanidad Animal Ctra. de Circunvalación, Tramo BARCELONA Tel: 93/ Fax: 93/ Duración: Enero Diciembre 1995 Coste: Miles de pesetas: Financiación INIA: 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Este proyecto ha pretendido abordar algunos de los interrogantes sobre el síndrome respiratorio reproductivo porcino (SRRP) que pueden ser de importancia para el control de la enfermedad. Cuando se presentó el proyecto, no era posible la multiplicación del virus en sistemas celulares distintos de los macrófagos alveolares porcinos, ello creaba serias dificultades para la obtención de preparaciones del virus para el diagnóstico de laboratorio, seguimiento epidemiológico, o para la utilización en vacunas de tipo comercial. Hasta ese momento, los antígenos obtenidos en macrófagos alveolares aplicados a las técnicas descritas de IPMA o Elisa ofrecían rendimientos bajos y económicamente inviables. A menudo la producción de antígeno basado en macrófagos de cerdos convencionales o SPF comportaba una alto nivel de reacciones inespecíficas. Este proyecto ha planteado en primer lugar estrategias para aumentar las producciones del virus con posible utilización a distintos niveles: inmunización de animales, producción de antisueros policlonales y monoclonales o antígenos para el diagnóstico serológico. En segundo lugar se ha enfocado hacia la obtención de una línea celular capaz de multiplicar el virus ya sea mediante líneas celulares estables, o las derivadas de macrófagos porcinos y así poder substraerse de la dependencia de los cultivos celulares primarios. A un tercer nivel se ha planteado mejorar las técnicas de diagnóstico existentes, principalmente para mejorar el rendimiento. Las dificultades en el diagnóstico de laboratorio han comportado una rápida extensión de la enfermedad, el desconocimiento de los problemas patológicos asociados y la imposibilidad de establecer medidas de control. RESULTADOS Se han demostrado algunas de las hipótesis propuestas, como son: la multiplicación del virus en macrófagos distintos de los alveolares, se ha comprobado que el virus SRRP puede multiplicarse a un nivel similar en los macrófagos de médula ósea y peritoneales. Se ha propuesto un método para aumentar las producciones de macrófagos con igual sensibilidad para la multiplicación del virus, también se han probado estrategias para aumentar la producción del virus en macrófagos, de ellas la que mejor resultado ha dado es la de efectuar varios pases de 24h. Tras repetidos intentos de adaptar el virus a líneas celulares y después de conocer la idoneidad de la MA-104 para multiplicar el virus se trabajó en la obtención una clona derivada de la MA-104 útil para la adaptación del virus SRRP y la producción de 2

3 antígenos. Se han adaptado a esta línea celular algunas cepas del virus para obtener títulos elevados y se ha iniciado la atenuación de una de las cepas de SRRP. De otro lado hemos trabajado en un modelo de infección experimental que aporta datos para probar la utilización de vacunas y medir sus efectos, especialmente en relación a los aspectos de eficacia y seguridad vacunal. En relación a las técnicas de diagnóstico hemos adaptado la técnica de IPMA sobre la MA-104 con resultados similares a los obtenidos utilizando la IPMA sobre macrófagos alveolares. Hemos participado en una acción concertada U.E. sobre SRRP donde se han realizado comparaciones sobre las distintas pruebas de diagnóstico serológico del SRRP y se ha establecido un banco de sueros y cepas de referencia aportados por los 6 países participantes, este material ha sido utilizado en la estandarización y comparación de pruebas de diagnóstico en España. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES. A.- Probar distintas estrategias para aumentar la producción del virus SRRP. 1.- Producción del virus sobre distintos tipos de células. Para ello se obtuvieron macrófagos alveolares, células de médula ósea y monocitos de sangre periférica, de un mismo animal. (Tabla 1). De aquí se dedujo que las células mas adecuadas para la multiplicación y la detección del virus eran los macrófagos alveolares, además (Tabla 2), el resultado nos indicaba la posibilidad de sustituir los macrófagos alveolares por macrófagos de otras localizaciones. Estos datos permiten enfocar el comportamiento del virus en distintos tipos de macrófagos y propone hipótesis alrededor de aspectos no aclarados de la patogénia, origen de las lesiones descritas en nódulos linfoides, miocarditis y encefalomielitis linfohistiocitaria, etc o la posible participación de los monocitos en la infección transplacentaria. 2.- Aumentar la producción de macrófagos alveolares Las pruebas para aumentar la producción de macrófagos alveolares se realizaron sobre cerdos de 4, 6, 9, 11 semanas (Tabla 3), aportaron su mejor resultado sobre cerdos de hasta 11 semanas, estimulados con 10 mg de Micobacterium butiricum vía intravenosa 4 días antes. Mientras que los títulos obtenidos frente a un virus de título conocido y la aptitud de los macrófagos para la producción de virus no variaban respecto de otros tratamientos. Estos datos podrían ser de aplicación para tener con una menor dependencia del sacrificio de cerdos o bien para aumentar la producción del virus en vacunas producidas sobre macrófagos alveolares. 3

4 3.- Métodos de cultivo que permitan aumentar la producción de virus En una primera prueba se añadió suero inmune para aumentar la producción del virus ( Tabla 4). El aumento de título obtenido oscilaba entre 0,3 a 0, 8 log. Mas tarde, de entre las cepas de campo recogidas se decidió escoger la que presentase un mayor título. Esta cepa se sometió a 5 pases rápidos, sobre macrófagos alveolares (Tabla 5). De esta forma se comprobaba que la adaptación del virus a un lote de macrófago en particular aumentaba la producción del virus de hasta 2 log. Sin embargo el VP19 (A32) permitió la producciones de virus y título medio de 10 6,4 DICC 50% /100mL. Con esto se había logrado una cepa de alto nivel de multiplicación con un número relativamente bajo de pases (<10) por macrófagos, útil para otras aplicaciones. 4.- Obtención de una línea celular sensible a la infección del virus SRRP En un inicio recogimos todas las líneas que estaban congeladas en el centro y sobre cada una de ellas se sometió a infección con la cepa VP19 a 3 pases ciegos con un MOI de 1. Las líneas celulares que utilizamos fueron: PK-15, MDBK, Hep2, Vero, IBRS-2, BHK-21, GBK, RK-13. Después del último pase, en todos los casos, fue negativa la presencia del virus por lo que se orientó el estudio en otra dirección. También se probó la obtención de una línea celular derivada de macrófagos, primero por fusión entre la línea de mieloma de ratón SP2/0 y macrófagos alveolares y después con monocitos de sangre periférica. Tambien se intentó la transformación de macrofagos alveolares con el virus SV40, en todos casos no se obbtuvieron resultados. Tras conocer, en la literatura, la adaptación del virus SRRP al crecimiento en la línea celular MARC-145, obtuvimos la línea celular origen esta es la MA-104 de riñón de mono. La estrategia fue clonar la línea MA-104, se obtuvieron 23 clonas y de estas se seleccionaron 17 por su buena capacidad de multiplicación. Las distintas clonas multiplicaron entre 2 y 11 aislados de campo tras el primer pase, de estas se escogió la MA-104 (clon10). Posteriormente, al obtener la línea celular MARC-145 se comparó con la MA-104(clon10) (Tabla 6). De esta prueba se dedujo que la línea MARC-145 se mostraba superior para multiplicar las distintas cepas en el primer pase, aunque en muchos casos y en las diferentes células solo se observó la tinción específica de un numero reducido de células positivas. 4

5 Por esta razón se realizaron tres pases de los virus en las distintas células para detectar un aumento de la multiplicación del virus. Sin embargo, en algunas cepas aumentó y en otras la multiplicación solo se observaba, de nuevo en un número reducido de células sensibles. Esto fue interpretado como que dentro de cada línea celular coexisten grupos de células sensibles y otras refractarias que aconsejarían una posterior clonación, para enriquecer estas subpoblaciones. En principio, la sustitución de los macrófagos alveolares por una de estas líneas celulares para el aislamiento del virus como método de diagnóstico no estaría demostrada, aunque puede ser útil como método para trabajar con cepas de SRRP adaptadas al cultivo en pruebas con infecciones experimentales. En comparación con la MARC-145 la clona de la MA-104 obtenida, multiplicaba también un buen número de aislados (Tabla 6). Para obtener la adaptación de una cepa de alta producción se escogió la cepa VP59, después de 6 pases por la línea MA-104(Clon10) se obtuvo un título del virus de 10 5,9 DICC50%/mL, sobre el clon10, sobre macrófagos alveolares dio un título de 10 7,2 DICC50%/mL (Fig1, Fig 2). Los resultados de los primeros 10 pases, indicaron la tendencia a estabilizar la producción alrededor de 10 6 DICC50%/mL (Fig3). Con ello se había obtenido una clona y una cepa del virus apta para producción de antígenos, recientemente se han iniciado pases seriados sobre el clon 10 con objeto de conseguir la atenuación, y su posterior aplicación en una cepa vacunal. De otro lado, se planteó que parámetros se podrían utilizar para determinar la atenuación del virus SRRP en los animales, para ello se propusieron dos aspectos: por un lado conocer la excreción del virus en animales infectados y la persistencia en tejidos y de otro lado la duración de la lesión característica en pulmón. Los resultados fueron los siguientes: tras la infección experimental se encontró que los órganos donde se encuentran títulos mas elevados de virus son los pulmones y órganos linfoides (bazo, nódulos linfáticos y tonsilas). La excreción máxima del virus se determinó hasta día 38 en 3 de 7 cerdos, por hisopo tonsilar, la duración máxima de detección de virus fue de 53 días en el suero en 4 de 7 cerdos y las lesiones microscópicas no se habían resuelto, sobre 4 cerdos a los 28 días posinfección. B. Mejorar los métodos de diagnóstico actuales 1.- Producción de anticuerpos monoclonales frente al virus SRRP A partir de la cepa Vp-19 (A3), titulo final de 10 7,3 DICC50%/100mL, se inocularon ratones Balb/c con un protocolo de tres inoculaciones y 56 días de duración, 5

6 ninguno de los animales presentó títulos de anticuerpos a IPMA, por el contrario presentaron reacción inespecífica frente a macrófagos alveolares. En el segundo intento se utilizó un protocolo consistente en inmunosuprimir los ratones, frente a macrófagos alveolares con ciclofosfamida, seguido del protocolo de inmunización. En esta ocasión varios ratones del grupo inoculado con células presentó títulos bajos entre 1/16 y 1/64 a IPMA, aunque de nuevo con elevada tinción inespecífica. Las clonas que se obtuvieron no presentaron reacción positiva. La revisión del método utilizado nos indicaba que, aunque teníamos un titulo elevado de virus, había sido un error haber procesado sobrenadantes y células conjuntamente, posiblemente la purificación a partir de sobrenadantes sin congelar nos hubiera evitado una incorporación elevada de restos celulares y la inespecificidad frente a macrófagos. Esto nos ha llevado hacia dos caminos en los que continuamos trabajando. De un lado, hemos obtenido heterohibridomas de cerdo a partir de cerdos infectados experimentalmente con elevado título de anticuerpos y baja reacción inespecífica en la detección por IPMA. La fusión ha sido realizada con la línea SP2/0 ha dado un buen resultado en cuanto al producción de hibridomas, pero tampoco se han obtenido hasta el momento clonas positivas. De otro la inoculación de ratones con una de las cepas de SRRP adaptadas a la línea celular MA-104(clon10). 2. Aplicación de los resultados a las técnicas de diagnóstico Se han sustituido los macrófagos alveolares en la técnica de IPMA por el Clon10 de la MA-104 con pequeñas variaciones de la técnica. Los cambios efectuados afectaron principalmente el método de fijación de las células. La comparación de las dos pruebas se realizó con 37 sueros de referencia Fig. 4. La concordancia de los resultados cualitativos fue del 100%, mientras que los títulos de los sueros presentaron pequeñas diferencias. Por último, la participación el proyecto AIR ha permitido obtener un conjunto de sueros y cepas de referencia que han sido utilizados para comparar las distintas pruebas serológicas, frente a la técnica de referencia IPMA (Tablas 7 y 8). 6

7 PUBLICACIONES Artículos de divulgación Pujols, J., Badiola, J.I., Sitjar, M., Carrera, J. y Rosell, R., Diagnóstico de laboratorio del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP). Laboratorio Veterinario. 1.1: 2-6. Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Pujols, J., Perez de Rozas, A., Rosell, R., Badiola, J.I., Ramos, J., Domingo, A. y San Gabriel, A. Duration of PRRS virus sedding in oronasal secretions of experimental infected weaner pigs. III Concerted action meeting on PRRS. Tübingen (Alemania) Rosell, R., Ferrer, A., Martínez, M., San Gabriel, A., Espuña, E., Sanbí, N., Alemany, R. y Pujols, J. The aplication of MA-104 cell line on PRRS serology diagnosis. III Concerted action meeting on PRRS. Tübingen (Alemania) Rosell, R., Pujols, J., Martínez, M. y Ferrer, A. Evaluation of a comercial ELISA kit to detect PRRS antibodies. IV Concerted action meeting on PRRS. Ploufragan (Francia)