LA DETERMINACIÓN DE INTERFERÓN GAMMA COMO ALTERNATIVA AL TEST TUBERCULÍNICO. Dr. Carlos Rivas Chetto.

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1 LA DETERMINACIÓN DE INTERFERÓN GAMMA COMO ALTERNATIVA AL TEST TUBERCULÍNICO. Dr. Carlos Rivas Chetto. Hasta el año 2001 el test tuberculínico (PPD) constituía el único método disponible para la detección de la infección tuberculosa latente (ITBL) y como auxiliar para el diagnóstico de la enfermedad tuberculosa (ETB) en los casos clínicamente dudosos y con bacteriología negativa; aunque el PPD es universalmente utilizado sus limitaciones son evidentes y se ha documentado la variabilidad de la interpretación de la pruebas y la existencia reacciones falsas positivas y negativas. Resultados falsos positivos pueden estar ocasionados por contactos previos con mycobacterias medioambientales (1,2) las cuales poseen antígenos comunes con M. tuberculosis (MTB) o ser el resultado de una vacunación previa con BCG. (3,4,5,6,7) siendo ésta una de las causas por las cuales, en países con baja incidencia de ETB no se recomienda la vacunación con BCG. (8) El efecto booster también debe ser considerado ya que la repetición del PPD puede determinar la conversión del mismo sin que exista una ITBL; este fenómeno de difícil valoración ha sido estudiado por los CDC de Estados Unidos (U.S.CDC) en personal de salud que es testado en forma reiterada para determinar una ITBL. (9) Sin dejar de lado las consideraciones que realizaremos mas adelante, podemos afirmar que la mayor y más frecuente causa de resultados falsos del PPD está relacionada con la subjetividad y variaciones en la realización y la lectura de la prueba (10,11) sobretodo cuando el diámetro de la pápula se ubica cerca del punto de corte de 5 milímetros (12). La sensibilidad del PPD es tan variable que no ha podido ser definida claramente (11) y se estima que se relaciona con la prevalencia de la ETB y la prevalencia de otras mycobacterias en la población testada. La importancia de establecer si un sujeto padece de una ITBL radica en que, con el tratamiento adecuado se puede evitar una posible enfermedad tuberculosa (ETB), la cual además de beneficiar al caso individual contribuye a controlar la cadena de transmisión de la enfermedad. El contacto con un enfermo bacilífero, especialmente si es positivo al examen microscópico directo, es uno de los factores de riesgo más importantes especialmente agravado cuando se asocia con la infección VIH. Se estima que entre 24 y 96 personas pueden resultar infectadas por un enfermo no tratado y el 10 % de ellas sufrirá una ETB en el transcurso de su vida (13) y que la presencia de la coinfección VIH/SIDA incrementa entre un 5 y 10 % por año el riesgo de contraer una ETB. (14) Para el diagnóstico de la ITBL y de la ETB sin confirmación bacteriológica, se está intentando el reemplazo del PPD por técnicas de mejor especificidad y sensibilidad, de segura realización, interpretación y lectura objetivas; que eviten evitar el efecto booster y ser independientes de la respuesta posible por una inmunización con BCG o por frecuentes contactos con micobacterias medioambientales. Sin duda que la evaluación de estos nuevos metodos ya existentes en plaza es muy dificultosa ya que el PPD es tan imperfecto que no puede usarse como gold standard. A la fecha existen dos procedimientos disponibles a nivel comercial ( QUANTIFERON TB GOLD y T-SPOT.TB ); ambos, con fundamentos similares, han sido evaluados en diferentes países y ya existe, para determinadas situaciones, información suficiente 1

2 como para analizar su posible inclusión como técnicas sustitutivas del PPD. LOS ENSAYOS DE LIBERACIÓN DE INTERFERÓN GAMMA. QuantiFERON TB. Este test ha evolucionado desde su aparición en el mercado, lo que debe tenerse en cuenta en el análisis de los trabajos publicados. La última versión, y a la cual nos referiremos en adelante, se ha denominado QuantiFERON-TB Gold in tube (QTBG). Es producido por la empresa australiana Cellestis y la descripción del producto puede obtenerse en la página Web: QTBG es un estudio in vitro que proporciona una ayuda al diagnóstico de la infecciónenfermedad por MTB. De acuerdo a los fabricantes si bien el QTBG es altamente efectivo para detectar una ETB activa su uso más común aparece en la detección de la ITBL. El QTBG fue aprobado por la U.S. Food and Drug Administration en el 2005 y recomendado por los U.S.CDC (15), luego de revisar la experiencia existente hasta el momento, para todas aquellas circunstancias en que se usa el PPD, incluyendo contactos de enfermos tuberculosos, evaluación de inmigrantes y vigilancia secuencial en programas de control de la infección (p ej. personal relacionado con la salud). QTBG representa un tipo de ensayo de liberación de interferón gamma. (16,17) Este tipo de pruebas miden el IFN-γ liberado por leucocitos luego de que la sangre es incubada con el antígenocorrespondiente (figura1); otros ensayos usan mononucleares aislados de sangre total los que son incubados con antígenos similares. En el QTBG se utiliza sangre fresca heparinizada de sujetos reactivos, cuando la sangre es incubada con una mezcla de péptidos sintéticos que representan dos proteínas específicas presentes en el MTB: early secretory antigenic target 6 (ESAT-6) y la culture filtrate protein 10 (CFP-10) Estas proteínas de bajo peso molecular son codificadas dentro de la región de diferencia 1 (RD1) del genoma de MTB; no se relacionan con el BCG y con la mayoría de las mycobacterias medioambientales. El QTBG es distinto de su predecesor el QTB (el cual usaba el PPD como antígeno) ya que utiliza antígenos específicos para estimular la liberación de IFN-g, cuantifica de diferente modo y los resultados se interpretan en forma distinta, Esto ha llevado al U.S.CDC a aprobar el QTBG tanto para el diagnóstico del a ETB activa como para la ITBL. T-SPOT.TB T-SPOT.TB es producido por la firma inglesa Oxford Immunotec y la descripción del producto puede verse en la pag. WEB: Se trata de un estudio similar al QTBG en cuanto a su fundamento teórico aunque con variantes técnicas; está basado en la tecnología conocida como ELISPOT ( Enzyme Linked Immunosorbent Spot.) Los ensayos ELISPOT son más sensibles (200 veces) que los ELISA. El procedimiento consiste en separar los monocitos de sangre periférica obtenidos por venopunción; después de un lavado celular -para eliminar interferencias- se hace reaccionar un número definido de células con los antígenos específicos de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) para producir la liberación de IFN-γ y capturarlo en los pocillos por anticuerpos específicos. El IFN-g fijado a los pocillos es combinado en otro sector por un conjugado de anticuerpos- enzima. El conjugado fijado con su enzima desdobla un sustrato que es agregado posteriormente y que al desdoblarse produce una reacción de color la que indica la positividad del test (figura 2). 2

3 A mas de 10 años de introducción en el mercado numerosos ensayos clínicos se han publicado. Los mismos se han desarrollado en diferentes países con distintas prevalencias de TB y en numerosos grupos de personas tanto en niños como en adultos y en diferentes situaciones epidemiológicas. Observando los análisis realizados por comites de expertos de los CDC de EEUU trataremos de aportar nuevos datos sobre las caracteristicas de estas técnicas, su relación con el PPD y la utilidad en diferentes situaciones clínicas. Diferencias entre IGRAs y PPD. A efectos de resumir las diferencias entre el PPD y estos procedimientos adaptamos la tabla publicada en la revisión de Pai. (17) El QTBG se realiza en menos de 24 horas, no es necesaria una segunda visita del paciente y no está sujeto a errores de lectura y variaciones de interpretación. Sin embargo deben mantenerse precauciones en la recolección y transporte de las muestras. El PPD y las diferentes versiones del QTB miden distintos antígenos, mientras que el PPD mide una reacción de hipersensibilidad retardada a una mezcla de antígenos (se incluyen antígenos comunes a MTB, BCG y mycobacterias medio ambientales) en un efector biológico como la piel, el QTBG mide la liberación in vitro de un mediador químico que se produce como resultado de una reacción inmune a algunos antígenos específicos de especie. El QTBG no es afectado por una vacunación anterior con BCG (cualidad indispensable para los países que tienen vacunación masiva) (17) y en principio de acuerdo los primeros trabajos publicados el QTBG sería apropiado para el estudio de los pacientes VIH/SIDA portadores de una ITBL. El descenso de los linfocitos CD4 no implicaría una falta de respuesta a los estímulos con fitohemaglutinina, productores de IFN-γ ; esta situaci ón se mantendría hasta el límite de 100 linfocitos CD4/ul. (18) Sensibilidad y especificidad La sensibilidad de los IGRAs varia ampliamente según diversos estudios publicados los cuales fueron realizados en adultos con TB confirmada bacteriológicamente En general los valores obtenidos entre IGRAs y PPD son difíciles de establecer. Cuando se realizo un meta análisis entre estudios en adultos con confirmación bacteriológica por cultivos ficha(54)del cdc) la sensibilidad pudo establecerse en 81% vs 70% a favor de los IGRAs; cuando otras serie de estudios fueron conjuntados se obtuvieron cifras de 83% vs 89%( IGRAs vs PPD) otros muestran diferencias no significativas y marcan una sensibilidad mayor al 90% para los IGRAs )en otros caso(ficha28,32,33,39 del cdc). En conclusión, los IGRAs parecen tener, en términos generales, una sensibilidad similar al PPD. De acuerdo a los antígenos utilizados (proteínas especificas de M. tuberculosis) era de esperarse que fueran altamente específicos; a pesar de existir diferencias en el diseño en los distintos estudios realizados los mismos muestran una especificidad de 99% y 85% para QTBG y PPD respectivamente (28,34 de cdc) en personas no infectadas con m. tuberculosis. La aparición de falsos positivos en los PPD pudo ser explicada por la vacunación BCG(28,55,56 del cdc) o por exposición a micobacterias ambientales. Es difícil valorar el efecto del BCG ya que esta vacuna es usada precisamente en países con altos riesgos de infección tuberculosa. Asimismo pacientes tratados por 3

4 una ETB que persisten con PPD positivo son pasibles de ser sospechosos de una ETB curada clínicamente pero con bacilos viables en sus lesiones o sea con persistencia de una ITBL. Según Pathan (19) aproximadamente 3 años después de la cura de una ETB la respuesta inmune celular declina, pero, por distintas razones los PPD pueden dar falsos positivos: a) reacciones cruzadas por contacto con M. medioambientales o b) reactivación de las células T por realización de PPD repetidos u otros factores, con el posterior desencadenamiento de la respuesta a nivel de efectores. La presencia de células efectoras de IFN-γ -activadas in vivo- se detectan por el QTBG sin estímulos reactivadores de la inmunidad T de esta manera se podría establecer la persistencia o no de una infección post tratamiento. Harada y col. (20) utilizando un punto de corte de 0.35 UI/ml - determinado como punto óptimo- encuentran una sensibilidad del 89 % y una especificidad del 98 % para la detección de la ITBL, sin hallar una influencia destacada del BCG sobre los resultados. Sin embargo debe tenerse en cuenta que los efectos adversos que puede tener el BCG sobre el PPD dependen de la cepa de BCG usada, edad de la vacunación, frecuencia de dosis y tiempo transcurrido desde la vacunación (19). 4

5 Tabla. Desempeño y características operacionales del PPD y del los procedimientos basados en el IFN-γ (adaptada de la revisión realizada por Pai). Rendimiento y características operacionales Test tuberculínico Ensayos de liberación de IFN-γ Sensibilidad estimada (en pacientes con ETB) 75-90% (menor en inmunodeficiencias) 80-90% Especificidad estimada ( sujetos sanos) 70-95% % Reacción cruzada con BCG Y MNT SI Menos marcada - NO Asociación entre positividad del test y riesgo de ETB durante el seguimiento Moderada a fuerte asociación. Fuerte asociación Correlación con la exposición a MTB SI SI (superior al PPD) Beneficio del tratamiento a los positivos Reducción del 60% de ETB Sin evidencias firmes. Parece superior al PPD Resultados en VIH/SIDA Valor muy limitado Buena correlación con CD4 a partir de 100. Reproducibilidad Moderada Alta Fenómeno Booster SI NO Reacciones adversas Raras Raras Costos de la prueba Bajo Moderado - Alto Visitas del paciente 2 1 Infraestructura requerida SI (a nivel periférico) SI ( a nivel de laboratorio) Tiempo para el informe de resultados 2-3 días 1 2 días Requerimientos de personal calificado SI ( personal experto) SI (técnicos de laboratorio) 5

6 Conclusiones. De acuerdo con Pai (17) si bien la aparición de los nuevos tests in vitro que determinan la liberación de IFN-γ contribuyen a aumentar la disponibilidad de pruebas destinadas a una mejor y más exacto diagnóstico de ETB y de ITBL, no es posible aun descartar el PPD. Existen situaciones que favorecen la aplicación de una u otra prueba en forma selectiva; la decisión de realizar uno u otro test dependerá de la población y del objetivo planteado. Por su alta especificidad los estudios de IFN-γ son muy apropiados en poblaciones de baja prevalencia de TB con vacunación masiva con BCG, en pacientes con VIH/SIDA, en donde es necesario la repetición de estas pruebas (seguimientos de contactos), donde no existe la infraestructura a nivel periférico que asegure la realización correcta del PPD y en todos aquellos sujetos donde la segunda visita (para lectura del PPD) puede ser dificultosa.. 6

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9 Figura 1. Como funciona QuantiFERON 2 TB Gold In Tube. 9

10 Figura 2. Como funciona T-SPOT.TB 10

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