Manual de Laboratorio de Bioquímica

Transcripción

1 Manual de Laboratorio de Bioquímica Por: SILVIO ANTONIO AYALA LOPERA Químico Universidad de Antioquia Facultad de Ciencias Agrarias Escuela de Producción Agropecuaria Medellín, 2007

2 PRESENTACIÒN El objetivo inicial de este manual de bioquímica fue escribir los protocolos de una manera simple para los estudiantes que inician algún programa relacionado con Ciencias Agropecuarias tanto de la región como del país con la meta única de provocar en ellos un despertar hacia las Ciencias Básicas de una manera práctica y sencilla y que surgiera en estos el interés natural que permitiera enlazar tanto la Biología como la Química y otras ciencias con el quehacer diario, ya que es bien conocido que el aprendizaje debe ser claro, simple y ameno e incluso en ciertas ocasiones divertido. Quienes hemos pasado por las aulas de clase, sabemos que una asignatura se aprende mejor cuando existe una estrecha relación entre lo que se toma de las clases teóricas o textos y lo que en un laboratorio se experimenta ya que el contraste que se realiza en esta situación, desarrolla cierta pasión por descubrir cosas nuevas y esto como bien se conoce, es lo que desarrolla el conocimiento y despierta la motivación por seguir creciendo. En este manuscrito se ha buscado que se enfatice acerca de la importancia de las Ciencias Biológicas en el sector Agrario y lograr con esto no solo que algunos conceptos se refuercen sino además que se evidencie la necesidad de desarrollar mucho más esta área en particular, para así lograr que los profesionales apliquen con rigor el oficio de las ciencias y desarrollen la habilidad crítica de el por qué, el cómo y el para qué en su vida diaria. Con esto se pretende alcanzar un desarrollo ideal de uno de los sectores que tienen mayor relevancia en nuestro país por ser un país agroindustrial, pues vivimos en un mundo globalizado y es allí en donde debemos incursionar y aprovechar todos los recursos con que se cuenta. Espero que se logren algunos de los objetivos propuestos en este manual que, como se dijo antes, es una compilación de ensayos sencillos que combina prácticas tradicionales de química orgánica con ensayos convencionales y clásicos de bioquímica que deseo tenga el impacto y los resultados inimaginables que a la vez de propender por servir de guía de laboratorio trate además de explorar el lado que raras veces motiva a los alumnos... y es el de la imaginación. S. A. L.

3 AGRADECIMIENTOS La edición de este manuscrito no hubiese sido posible sin la inagotable paciencia tanto de los monitores que han realizado sus prácticas aquí sino además de la estudiante avanzada del programa de Medicina Veterinaria Viviana Janeth Velásquez Santana quien con su dedicación y sacrificando sus escasos momentos libres, se propuso escribir los protocolos y diagramar algunos esquemas de reacciones químicas complejas que parecían difíciles al inicio. Es también importante agradecer a los profesores del curso teórico de Bioquímica quienes en su momento realizaron la lectura cuidadosa de los protocolos que luego se implementaron y compilaron para que este manual fuera posible, esto se logró acogiendo las críticas con el fin único de mejorar no solo la redacción sino además la presentaciòn de los ensayos. Finalmente, a todas las personas que de una u otra manera, hicieron las observaciones en su momento para que esta tarea de escribir se pudiera cristalizar. El autor

4 ENSAYOS PARA PROTEÍNAS 1. Objetivos Reconocer proteínas y aminoácidos mediante reactivos químicos específicos. Comprobar el efecto de algunos factores físicos y químicos sobre la estructura de las proteínas. 2. Marco Teórico Las proteínas son moléculas de alto peso molecular, que contienen carbono, hidrógeno, oxígeno y con frecuencia, azufre. Las unidades fundamentales de las proteínas son los aminoácidos, compuestos orgánicos que contienen grupos amino y carboxilo y que por lo tanto, tienen propiedades ácidas y básicas; los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar dipéptidos, tetrapéptidos, aligopéptidos y polipéptidos. Se considera que las proteínas están formadas por polipéptidos que adquieren diferentes configuraciones espaciales determinando así su estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Las propiedades fisicoquímicas de las proteínas están determinadas por la secuencia de aminoácidos, su configuración espacial, las fuerzas interiónicas, puentes de hidrógeno, etc. Estructura de las proteínas: En las proteínas pueden reconocerse varios niveles de organización estructural. El primero de ellos es la estructura primaria, que consiste en arreglo aminoacídico en la molécula. Pauling y Corey basados en estudios de rayos X, sugirieron que la cadena péptidica puede existir en la forma de un resorte o hélice. Dichos investigadores consideraron un buen número de formas helicoidales, pero encontraron que sólo la forma α hélice llena los requisitos de máxima estabilidad. La otra forma de estructura secundaria se conoce como hoja plegada β, en la cual los enlaces de hidrógeno se encuentran entre dos cadenas peptídicas paralelas cuyos átomos de N están orientados en la misma dirección, o antiparalelas, donde sólo las cadenas alternas están orientadas en la misma dirección. La forma β se encuentra en proteínas tales como la queratina del pelo, mientras que la α hélice puede estar presente tanto en proteínas fibrosas como globulares del tipo albúmina y mioglobulina. La estructura terciaria de una proteína es la disposición en el espacio de las hélices, o en otras palabras, la forma tridimensional de la molécula de proteína. Muchas de las moléculas de las proteínas se comportan como si fueran bastante compactas y por lo tanto se conocen como proteínas globulares. Otras proteínas son más rígidas y forman hilos largos y se conocen como proteínas fibrosas. La estructura terciaria se mantiene por los enlaces que se presentan a continuación:

5 Figura 1. Tipos de interacciones químicas en las proteínas 1 y 2: Enlaces de hidrógeno 3: Enlace iónico 4: Enlace disulfuro 5 y 6: Enlaces hidrofóbicos Algunas proteínas poseen subunidades de polipéptidos, que no están ligados por enlaces covalentes y la asociación de dichas subunidades para formar la molécula completa confiere una estructura cuaternaria a la proteína. Muchas proteínas de peso molecular por encima de g/mol parecen tener estructura cuaternaria. Desnaturalización: Es cualquier proceso por el cual el ordenamiento espacial de una proteína cambia de la estructura ordenada de la molécula original hacia una configuración tridimensional más desordenada. Durante la desnaturalización se rompen los enlaces de hidrógeno y los hidrofóbicos y hay un incremento en la entropía o grado de desorden de la molécula con pérdida de la actividad biológica. La desnaturalización puede ser reversible, por ejemplo, la quimotripsina pierde su actividad al calentarla pero puede ganarla de nuevo al enfriarla, sin embargo, en la mayoría de los casos no es posible restituir a su estado nativo luego de haber sido desnaturalizada. Después de la desnaturalización, la proteína se vuelve menos soluble y pierde su actividad biológica. La desnaturalización puede ocurrir debido a un buen número de causas, algunas de las cuales se detallan a continuación: Físicas: Se pueden enumerar varias tales como calor, presión, congelamiento, fuerzas de superficie, rayos X, rayos ultravioleta, ultrasonido, etc. Químicas: Valores extremos de ph, solventes orgánicos, amidas y sus derivados. Biológicas: Enzimas proteolíticas (la desnaturalización parece ocurrir antes de la hidrólisis). La propiedad que tienen las proteínas de desnaturalizarse, constituye el

6 fundamento de uno de los métodos para su determinación. Las proteínas desnaturalizadas tienden a formar agregados de moléculas y seguidamente se precipitan; esto se conoce con el nombre de coagulación. No todas las proteínas son susceptibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para separar ciertas proteínas de una mezcla por medio de la coagulación. Temperatura: Generalmente un aumento en la temperatura causa un descenso en la solubilidad. El calentamiento cuidadoso puede usarse para desnaturalizar y separar proteínas indeseadas, pero debe hecerse con precaución. ph: La solubilidad de una proteína depende del ph y es mínima en el punto isoeléctrico. El ph de la solución debe ser controlado cuidadosamente puesto que una proteína puede hacerse 10 veces más soluble con un cambio de ph de sólo una unidad por encima o por debajo del punto isoeléctrico. Al igual que con el calor, los cambios en el ph pueden usarse para desnaturalizar proteínas indeseadas, por ejemplo, al ajustar a 3 el ph de un extracto de malta, se destruye la α amilasa, pero la β amilasa continúa intacta. Solventes orgánicos: Muchas proteínas se desnaturalizan por interacción con solventes orgánicos, especialmente cuando se usan a temperatura ambiente, por esto se recomienda que cuando deban usarse para el aislamiento de proteínas, este se haga en frío. El alcohol, la acetona y el metanol son los solventes que más se utilizan y su calidad puede ser crítica para los resultados obtenidos, que pueden ser totalmente diferentes con reactivos altamente puros o menos purificados. 3. Reactivos y Equipos HCl 0.1M Etanol NaOH 0.1M, 10M y al 20% Cloroformo Aminoácidos en solución HNO 3 (c) Ninhidrina 0.2% Reactivo de Millon Nitrito de Sodio 1% p/v Acido pícrico 10% CuSO 4. 5H 2 O 1% 0.1M Acido tricloroacético 20% Nitroprusiato de sodio 2% m/v Hidróxido de amonio 12 tubos de ensayo HCl (c) Baño de agua hirviendo NaOH 10% Pb (CH 3 COO) 2, 0.1 M FeCl M Preparación de una solución de albúmina: Batir una clara de huevo durante unos instantes y mezclarla después con 5 veces su volumen de agua. La mezcla se filtra a través de una tela y el filtrado su guarda para realizar los ensayos.

7 4. Análisis Cualitativos 4.1. Para aminoácidos Solubilidad: Examinar la solubilidad de los aminoácidos en agua, ácido 0.1M, álcali diluido 0.1 M, en etanol y cloroformo. Interpretar los resultados. Reacción de la ninhidrina: La ninhidrina, un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los α aminoácidos a un ph entre 4 y 8 para dar un compuesto de color púrpura (ver figura 2). Método: Colocar 1 ml de solución de aminoácido en un tubo de ensayo y ajustar el ph cerca de la neutralidad; agregar 5 gotas de solución de ninhidrina y dejar hervir por dos minutos. Figura 2. Diagrama esquemático de la reacción de la ninhidrina Reacción Xantoproteica: Los aminoácidos que contienen un núcleo aromático forman derivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de éstos derivados son de color naranja. Observación: Evitar la salpicadura en la piel, ocurre la misma reacción.

8 Método: Agregar volúmenes iguales de ácido nítrico a aproximadamente 0.5 ml de solución de aminoácido, dejar enfriar y observar el cambio de color. Agregar suficiente NaOH 10 M hasta que la solución alcance alcalinidad. El cambio de coloración de amarillo en solución ácida a naranja brillante en solución álcali, constituye un resultado positivo. Reacción de Millon: Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reacción positiva. Método: A 1 ml de la muestra agregar 5 gotas de reactivo de Millon y calentar en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar 5 gotas de solución de nitrito de sodio 1%. La aparición de un color ladrillo indica un resultado positivo. Prueba del nitroprusiato: Los grupos tioles reaccionan con nitroprusiato de sodio (NaFe (CN) 5NO) en presencia de un exceso de amoniaco para dar un color rojo. Método: Mezclar 0.5 ml de una solución fresca de nitroprusiato de sodio1% con 2 ml de la muestra. Adicionar 40 gotas de hidróxido de amonio. Observar Reacciones generales de las proteínas Desnaturalización por calor y ph extremos: Colocar 1.0 ml de solución de proteína en un tubo de ensayo. Calentar gradualmente y anotar la temperatura a la cual tiene lugar la coagulación. A 2 ml de la solución de proteína, agregar lentamente por las paredes del tubo 2 ml de HNO 3 concentrado hasta que se formen dos capas; luego mezclar cuidadosamente. Anotar sus observaciones. Colocar 1.0 ml de solución de prueba en 3 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos así: al primero, 1 ml de etanol, al segundo unas gotas de HCl (c) y al tercero 10 gotas de NaOH al 20%. Registrar los casos en los cuales hubo coagulación. Precipitación por metales pesados: A ph de 7 y por encima de él, las proteínas están cargadas negativamente, así que la adición de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la proteína se precipita. La precipitación por metales pesados es, por lo tanto, más efectiva a valores de ph neutros o ligeramente alcalinos, pero la solución no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que se precipiten hidróxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en un exceso de iones de metal pesado ya que tal exceso confiere a las partículas cargas positivas estables. Método: Colocar 2.0 ml de solución de prueba y 5 gotas de NaOH al 10% en cada uno de tres tubos de ensayo y adicionar al primero 2 gotas de CuSO M, al segundo 2 gotas de Pb(CH 3 COO)2 0.1M y al tercero 2 gotas de FeCl 3 0.1M. Qué sucede cuando se añade un exceso de reactivo?.

9 Precipitación por reactivos acídicos: Algunos compuestos ácidos poseen una carga negativa grande que neutraliza una proteína cargada positivamente formando una sal insoluble. Los reactivos ácidos son, por lo tanto, más efectivos a valores de ph ácido en los que las proteínas poseen carga positiva. Método: Verter 1.0 ml de solución de prueba en sendos tubos de ensayo y agregar al primero 5 gotas de ácido pícrico (2, 4,6-trinitrofenol) al 10% y al segundo 5 gotas de ácido tricloroacético al 20%. Prueba de Biuret para enlaces peptídicos: El sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos produciendo un complejo de coloración violeta. La intensidad del color obtenido es una medida del número de enlaces peptídicos presentes en la proteína. La reacción no es absolutamente específica para los enlaces peptídicos, ya que cualquier compuesto que contenga dos grupos carbonilo unidos por un átomo de nitrógeno o de carbono da un resultado positivo. Método: A 2 ml de la muestra agregar 5 gotas de sulfato de cobre 10% m/v y luego 2 ml de NaOH 10 M; mezclar vigorosamente y observar los colores formados. Reactivo de Sakaguchi para arginina: Método: Colocar 2 ml de una mezcla de proteínas en tubo de ensayo, adicionarle 1 ml de hidróxido de sodio 2 N, mezclar bien para luego verterle 2 gotas del reactivo de Sakaguchi (alfa naftol/etanol al 1% y 4 gotas de hipoclorito de sodio, observar el fenómeno y repetir con leche. 5. Consulta 5.1. Haga la diferencia entre un L - aminoácido, un péptido y una proteína. Cite un ejemplo de cada uno Ilustre la formación de un enlace peptídico a partir de dos aminoácidos diferentes Es la nucleoproteína una proteína conjugada?, por qué?, consulte la estructura Consulte la relación que existe entre las proteínas con el DNA, RNA Dibuje las distintas estructuras de las proteínas.

10 AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE LA LECHE 1. Objetivo Separar las proteínas de diferentes tipos de leche mediante la coagulación y cuantificar el rendimiento de los procesos. 2. Procedimiento En un vaso de precipitados de 400 ml, colocar 200 ml de leche descremada, calentar al baño a 38 C. Agregar en forma lenta (mientras se agita suavemente con una barra magnética) solución de ácido acético 10% v/v, hasta obtener un ph de 4.6 (utilizar ph-metro). Nota 1: Procurar mantener la temperatura entre 30 y 38 C, a fin de obtener una cuajada de buena granulación, ya que bajas temperaturas y débil acidez producen un cuajo fino, blando y semi-líquido difícil de separar del suero. Una vez conseguido el ph, agitar con la misma suavidad por dos (2) minutos más, y dejar reposar por otros diez (10). Filtrar la caseína con agua, dos o tres veces, eliminando las aguas de lavado. Exprimir, secar con papel absorbente y pesar la caseína obtenida. Calcular el rendimiento, así: Calcular el % de nitrógeno, así: Medir el volumen de suero; neutralizarlo con NaOH 0,5 N hasta ph de 7,2 (obtener dicho valor utilizando un ph-metro). Dividir el suero neutralizado en dos fracciones. A una de las fracciones, adicionar lentamente igual volumen de (NH 4 )2SO 4 50%, con agitación constante, y dejar en reposo mínimo media hora, para separar las globulinas insolubles. Nota 2: Si se considera conveniente, puede centrifugarse, para obtener una separación más nítida. Filtrar la globulina; secarla y pesarla. Calcular el rendimiento.

11 A la segunda fracción, agregar (con agitación suave), solución de NaOH 10% p/v, hasta alcanzar un ph de 10.5, en el ph-metro. Llevar el contenido al baño maría y agregar solución de ácido sulfúrico 5% v/v, para lograr la precipitación de la albúmina. Centrifugar. Nota 3: Debe agitarse permanentemente, durante la adición del ácido sulfúrico. Filtrar, secar y pesar la albúmina. Calcular el rendimiento. Observación: Aplicar el ensayo de Biuret, para las tres proteínas, así: En un tubo de ensayo, colocar una pizca de la muestra, agregar 10 ml de agua desmineralizada, agitar para disolver, adicionar 3 ml de NaOH al 33% y tres gotas de CuSO 4 al 1%, mezclar bien; observar coloración, y posibles cambios en ella. Para las mismas proteínas, determinar solubilidad, en NaOH 1.25% p/v, y agua desmineralizada, en la siguiente forma: En un tubo de ensayo colocar una pizca de muestra y 10 ml del respectivo solvente. Agitar y observar. 3. Consulta 3.1. Qué utilidad tiene el proceso de separación de las proteínas de la leche? 3.2. Cuál será la fracción de mayor importancia que usted separó y por qué? 3.3. Cuándo se determina la eficiencia en el proceso, cuál será la etapa más crítica y como se podría mejorar el rendimiento? 3.4. Diagrame un proceso que permita reducir las pérdidas en el proceso sin sacrificar la calidad de los productos obtenidos. PUNTO ISOELÉCTRICO 1. Objetivo Determinar el punto isoeléctrico de algunas proteínas de la leche y deducir su menor solubilidad. 2. Reactivos y Equipos Ácido acético 1 N Ácido acético 0.01 N Hidróxido de sodio 1 N Ácido acético 0.1 N Caseína 3. Fundamento Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del ph de la solución en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitación proteica.

12 4. Procedimiento Preparar una solución de caseinato de sodio tomando 250 mg de caseína, 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N. Cuando la solución sea perfecta, se agregan 5 ml de ácido acético 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 ml con agua destilada. Si la solución no está suficientemente clara, se puede filtrar. Preparar los siguientes tubos (ver tabla): Tubo Reactivo Agua Destilada 8,38 7,75 8,75 8, ,4 Acido acético 0.01 N 0,62 1,25 Acido acético 0.1N 0,25 0, Acido acético 1 N 1,6 Solución de caseína (ml) ph 5,9 5,6 5,3 5 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5 Mezclar bien. Esperar 30 minutos. Reportar el punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor precipitación. Centrifugue si es necesario. ESTUDIO DINÁMICO DE LOS NIVELES DE COLESTEROL EN HEMBRAS BOVINAS 1. Marco Teórico El estudio de los parámetros bioquímicos en los animales debe realizarse de una forma dinámica y no estática, puesto que los valores metabólicos están condicionados por múltiples factores que varían de acuerdo a la edad, estado fisiológico, estado nutricional y productivo de los animales; en la hembra bovina es fácil observar este tipo de respuestas metabólicas, es por esto que en esta prueba se estudiará la dinámica del metabolismo del colesterol en vacas a través de las fases del ciclo productivo. Es entonces de especial importancia comprender la variabilidad en los parámetros bioquímicos de tal forma que se puedan establecer patrones de comparación que se constituyan en ayudas para el diagnóstico del estatus metabólico. Con esta actividad se pretende que el estudiante comprenda el carácter dinámico del metabolismo, interrelacionándolo con los factores determinantes.

13 2. Fundamento Con el anhídrido acético y el ácido sulfúrico concentrado, el colesterol forma compuestos de color verde parduzco intenso a temperatura ambiente, estas soluciones siguen la ley de Beer-Lambert, lo que permite la cuantificación del colesterol total. 3. Metodología Cuatro delegados del grupo con la dirección del profesor, se encargarán de realizar la toma de muestras de sangre a tres (3) vacas, cada una de las cuales estarán en diferente fase de producción: preparto, inicio de lactancia y final de la lactancia. Se tomará en dos tubos de ensayo previamente rotulados, un mínimo de 20 ml de sangre por vaca, esta muestra se llevará a refrigeración para su conservación; luego en el laboratorio se hará extracción del suero para iniciar el análisis de colesterol a partir de este. 4. Procedimiento Preparar de acuerdo a la siguiente tabla, tres (3) tubos de ensayo y roturarlos así: blanco, estándar y colesterol total (ver tabla). Tubo Reactivo Blanco Estándar Colesterol total Agua destilada 0.1 ml X Solución estándar 0.1 ml X Suero sanguíneo 0.1 ml X Reactivo de colesterol 5 ml X X X Mezclar muy bien, dejar 10 minutos en baño maría. Volver a mezclar. Leer a 560 nm en el espectrofotómetro. Calcular la concentración de colesterol total a través de la ley de Beer-Lambert. Compare los resultados encontrados con los reportados en la literatura para tal efecto apóyese en los resúmenes bibliográficos del curso. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE 1. Marco Teórico La determinación de glucosa en sangre se puede realizar por varios métodos, tales como el de glucosa oxidasa, el de Folin Wu, el de Somogy Nelson y otros totalmente automatizados. Debido a esto generalmente cada reporte de laboratorio trae entre paréntesis los valores normales de referencia según el método aplicado.

14 En ésta ocasión se utilizará el método de Somogy Nelson. Este método utiliza sangre total para preparar un filtrado libre de proteínas mediante su interacción con hidróxido de bario y sulfato de zinc. Una vez obtenido el filtrado libre de proteínas se hace reaccionar la glucosa presente en el filtrado con Cu++ en presencia de calor para producir una oxidación del grupo hemiacétalico de la glucosa y una reducción del Cu++ a Cu+ obteniéndose en esta reacción óxido cuproso (Cu 2 O), éste compuesto en presencia de reactivo de color (arsenomolibdato) produce un complejo de color que tiene una absorción máxima en la longitud de onda 540 nm. A mayor complejo, mayor presencia de óxido cuproso y por ende mayor oxidación de la glucosa. Un método más específico es el enzimático. En este método, la glucosa reacciona con la enzima glucosa oxidasa para producir ácido glucónico y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno se hace reaccionar con ortotoluidina en presencia de peroxidasa, produciéndose un complejo que se mide fotocolorimétricamente. 2. Procedimiento 2.1. Preparación de filtrado libre de proteínas En un tubo de ensayo, mezcle con suavidad 1 ml de sangre oxalatada y 5 ml de agua destilada. Al tubo anterior adicione 2 ml de hidróxido de bario 0.3 N y mezcle hasta obtener un color oscuro. Posteriormente agregar 2 ml de sulfato de zinc al 5%. Mezcle vigorosamente hasta obtener un color chocolate; filtre en un tubo de ensayo. El filtrado debe ser transparente de lo contrario vuelva a filtrar Cuantificación de la glucosa Marque tres (3) tubos de ensayo: blanco, estándar, problema (ver tabla). Tubo Reactivos Blanco Estándar Problema Agua destilada 1 ml Solución estándar de glucosa 1 ml Filtrado libre de proteínas 1 ml Solución cuproalcalina 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar. Colocar los tubos en agua hirviendo por 20 minutos enfriar en un baño a temperatura ambiente, agregar Arsenomolibdato 1 ml 1 ml 1 ml Agite cada tubo hasta expulsión completa de CO 2 producido. En una probeta complete el contenido de cada tubo a 25 ml con agua destilada. Mezcle y en el fotocolorímetro lea las densidades ópticas (problema y estándar) a 540 nm previa calibración con el blanco.

15 Calcule los mg de glucosa por cada 100 ml de sangre, utilizando la ley de Beer- Lambert, teniendo en cuenta el factor de dilución (recuerde que de una mezcla de 10 ml de filtrado solo se analizó 1 ml). Realice su informe tratando de consultar y analizar los principales factores que hacen variar los niveles de glicemia en la especie que usted trabajó. Establezca criterios de discusión y análisis los cuales se presentaran en la sección grupal. FRACCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS DEL PLASMA 1. Objetivos Aplicar las propiedades de solubilidad de las proteínas del plasma para fraccionar y cuantificar sus principales componentes. Cuantificar la concentración de proteínas totales, albúminas y globulinas, en una muestra dada, utilizando la información complementaria a esta muestra para su adecuada interpretación. 2. Marco Teórico Una de las técnicas mas antiguas, pero todavía importantes de diferenciar y separar proteínas se basa un sus relaciones de solubilidad. Debido a su gran importancia para el estudio metabólico y nutricional se analizarán las principales fracciones proteicas del plasma, medio líquido en el que están suspendidos todos los componentes celulares de la sangre. El plasma se puede obtener a partir de sangre recogida con anticoagulante después de separar sus elementos celulares. El suero sanguíneo se diferencia del plasma en que no tiene fibrinogéno, este es el líquido que se desprende del coágulo cuando la sangre se recoge sin anticoagulante. Las proteínas del plasma se pueden separar en fibrinógeno, globulinas y albúminas sobre la base de sus diferentes solubilidades en soluciones salinas. En el estudio de química sanguínea es también frecuente el uso de suero en vez de plasma. El suero está compuesto de 92% de agua y 8% de solutos de los cuales las proteínas son las que están en mayor concentración (6-8 g/%). Las proteínas del plasma cumplen diversas funciones en el organismo tales como nutritivas, mantenimiento de la presión osmótica de la sangre, regulación del equilibrio ácido-base, entre otras, y sus concentraciones pueden variar de acuerdo al estado nutricional y fisiológico, conocer la concentración de las proteínas del plasma es fundamental para la comprensión integral del metabolismo.

16 3. Fundamento Fraccionamiento salino utilizando sulfato de sodio 22.5% p/v (método de Howe). Cuantificación de las diferentes fracciones por el método de Biuret, el cual consiste en la formación de un complejo de coordinación entre el nitrógeno de los enlaces peptídicos y el Cu++ de una solución cuproalcalina estabilizada con tartrato, que absorbe a una longitud de onda óptima de 540 nm. 4. Procedimiento Tome dos tubos y márquelos así: o Tubo 1 - Estándar. o Tubo 2 - Problema (de centrífuga). Continúe como se indica en la tabla siguiente: Reactivos Tubo 1 Tubo 2 Sulfato de sodio 22.5% p/v 9.5 ml 9.5 ml Suero estándar 0.5 ml 0.5 ml Tome otros cuatro tubos y márquelos así: o Tubo 3 - Estándar o Tubo 4 - Problema o Tubo 5 - Albúmina o Tubo 6 - Blanco Deposite en el tubo 3 (estándar) 2 ml de la mezcla contenida en el tubo 1. Descarte el resto. Deposite en el tubo 4 (problema), 2 ml de la mezcla contenida en el tubo 2. Conserve los tubos 3 y Albúminas A los 8 ml restantes del tubo problema (# 2), agregue, de 2 a 3 ml de éter, tape, agite y deje en reposo 5 minutos hasta que las globulinas se localicen en la interfase. Centrifugue 10 minutos a 2000 r.p.m. de tal manera que las globulinas formen un tapón en la interfase suero, sulfato, éter. Inclinando cuidadosamente el tubo para que se desprenda la capa de globulinas y tapando la pipeta para evitar su entrada en ella, se extraen 2 ml de líquido del fondo del tubo. Limpie el exterior de la pipeta y colóquelos en el tubo 5 marcado como albúmina. Al tubo 6 ó blanco adicione 2 ml de solución de sulfato de sodio 22.5% p/v. Agregue 8 ml de Biuret a cada uno de los tubos marcados con los números 3, 4, 5 y 6.

17 4.2. Resumen del procedimiento anterior Reactivos Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Estándar Problema Albúminas Blanco Mezcla tubo 1 2 ml Mezcla tubo 2-2 ml - - Albúminas - 2 ml - Sulfato de sodio 22.5% p/v ml Biuret 8 ml 8 ml 8 ml 8 ml Mezcle. Deje en reposo por 20 minutos. Calibre el Fotocolorímetro a 540 nm con el tubo blanco (# 6). Lea la densidad óptica de los tubos 3, 4, y 5. Calcule los gramos de proteínas totales y albúmina en 100 ml de muestra aplicando la formula de Beer-Lambert. Calcule los gramos de globulinas en 100 ml de muestra utilizando la siguiente fórmula: Proteínas totales Albúminas = Globulinas CUANTIFICACIÒN DE PROTEÌNAS MEDIANTE EL MÈTODO DE BIURET 1. Objetivos Separar en una muestra de suero sanguíneo, las globulinas de las proteínas totales. Calcular la concentración de proteínas totales, globulinas y albúminas en una muestra de suero sanguíneo. 2. Marco Teórico De acuerdo a los productos obtenidos durante la hidrólisis completa de proteínas, estas se pueden clasificar en dos grandes grupos: Proteínas simples: Cuando al hidrolizarse producen alfa- aminoácidos y sus derivados. Proteínas conjugadas: Cuando al hidrolizarse aparecen otros grupos denominados prostéticos, los cuales se encuentran enlazados a las proteínas. Estos grupos pueden ser carbohidratos (mucoproteínas), lípidos (lipoproteínas) o a ácidos nucleicos (nucleoproteínas).

18 Las proteínas simples se clasifican a su vez en varios tipos, distinguiéndose cada uno de ellos por sus propiedades de solubilidad en diferentes solventes, así se tienen las siguientes: Albúminas: Solubles en agua y soluciones acuosas salinas diluidas. Globulinas: Solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua destilada. Aunque una propiedad muy importante es su precipitación en soluciones semisaturadas de sulfato de amonio (NH 4 ) 2 SO 4. Prolaminas: Insolubles en agua, pero solubles en etanol en concentraciones entre el 50% y el 90%. Glutelinas: insolubles en los solventes anteriores, pero solubles en soluciones ácidas o básicas diluidas. Otras proteínas simples: No clasificables por medio de su solubilidad en determinados solventes, sino por la característica y cantidad de los aminoácidos que la conforman son las protaminas, histonas y escleroproteínas. Otra característica estructural: Establecida mediante el análisis de rayos X, permite clasificar las proteínas en: o Fibrosas: Las cuales se encuentran constituidas por largas cadenas de aminoácidos cuyos residuos forman cadenas laterales de naturaleza no polar. o Globulares: Cuando las proteínas están formadas por cadenas peptídicas, las cuales se cierran y los restos de cadenas laterales poseen propiedades polares lo cual explica su relativa solubilidad en agua. En las proteínas plasmáticas las de mayor interés biológico son las cadenas globulares destacándose especialmente las albúminas y las globulinas, estas últimas pueden ser alfa, beta y gamma globulinas. La alteración en el plasma de los valores normales de estas proteínas se denomina disproteinemia y están relacionadas con diversos casos clínicos. Las proteínas séricas totales deben estar entre valores considerados normales de 6 g/100 ml de suero, en esta concentración, las albúminas tienen un valor promedio de 4 g/100 ml y las globulinas de 3 g/100 ml. 3. Reactivos y Equipos Solución acuosa de NaCl al 0.9% Solución saturada de sulfato de amonio (750 g/l de agua) Solución patrón de albúmina (0,45 g en 100 ml de solución salina) Solución de Biuret (a 3 ml de solución de albúmina, añadir agitando 10 gotas de solución de sulfato cúprico al 5%, luego 2 ml de solución de NaOH al 10%, dejar reposar la mezcla) Muestra de suero sanguíneo bovino o de otra especie Centrifugadora clínica Fotocolorímetro

19 4. Procedimiento 4.1. Separación de las globulinas del suero Colocar en un tubo de centrífuga 1 ml de suero sanguíneo y 4 ml de agua destilada. Agregar a la solución anterior 5 ml de solución saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando suave pero constantemente. Dejar reposar durante 10 minutos la solución obtenida en el numeral anterior. Luego centrifugue a 2000G durante 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas. Separe el líquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 ml de una solución salina, conserve esta solución para determinar el porcentaje de globulinas Preparación de la solución de proteínas totales Mida 1 ml de suero sanguíneo y dilúyalo hasta completar 20 ml agregándole solución salina Medición de la absorbancia en las soluciones que contienen proteínas Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se indica en la tabla siguiente. Agite cada tubo y déjelo reposar por 30 minutos. Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, programado a una longitud de onda de 540 nm luego de una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento. Tubo Blanco (ml) Patrón (ml) Globulinas (ml) Proteínas Totales (ml) Solución salina 10 Solución patrón 1,0 Solución de globulinas 1,0 Suero diluido 1:20 1,0 Solución de Biuret 4,0 4,0 4,0 4,0 Absorbancia 5. Cálculos para determinar el porcentaje de proteínas en la muestra de suero: 5.1. Dilución del patrón Calcule el porcentaje (final de la solución de proteínas aplicando la fórmula) C f = C i * V i / V f

20 5.2. Concentración de proteínas totales en suero Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón con las de proteínas totales y calcular el porcentaje de estas últimas, así: Sin embargo, esta concentración corresponde a 1 ml de solución de suero sanguíneo, el cual fue diluido primero 20 veces y luego 5, de manera que el resultado final debe ser: 20 * 5 * (Proteínas Totales) 6. Curva de calibración para soluciones de albúmina 6.1. Objetivos Determinación cuantitativa de albúmina en muestras problema Marco Teórico Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen un color violeta característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO 4 ) en solución alcalina. El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir enlaces químicos entre los pares de electrones libres del átomo de nitrógeno presente en los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas con el ion cobre. Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu +2 y las diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo tanto, se puede utilizar una proteína como patrón de calibración. La curva de calibración obtenida por este método, se hará utilizando como patrón solución de albúmina, cuya concentración es de 8 mg/ml preparada con solución salina al 0,9%.

21 6.3. Reactivos y Equipos Solución de albúmina de concentración 8 mg/ml (solución patrón) Reactivo de Biuret Solución salina al 0,9% Fotocolorímetro 6.4. Procedimiento Rotular 9 tubos de ensayo y colocar las siguientes soluciones como se indica en la tabla siguiente. Agregar en cada tubo 4 ml del reactivo de Biuret, mezclar bien y dejar en reposo durante 15 minutos. Tubo Solución patrón Solución problema Solución salina Blanco (ml) 1 (ml) 2 (ml) 3 (ml) 4 (ml) 5 (ml) 6 (ml) 7 (ml) 8 (ml) ,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1, ,5 1,0 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0 Colocar en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la práctica sobre el espectro de una solución de albúmina. Registre la absorbancia para cada uno de los tubos (recuerde, cada solución se debe leer en una celda de medición para fotocolorímetro). Calcular la concentración en cada uno de los tubos aplicando la fórmula de dilución (C i * V i = C f * V f ) y tabule los resultados de absorbancia y concentración. Grafique los resultados absorbancia y concentración tabulados en el punto anterior. La línea resultante corresponde a la curva de calibración. Se pueden utilizar como muestras problema soluciones de albúmina en huevo, caseína en leche, suero sanguíneo o gelatina Preparación Del Reactivo De Biuret A 3 ml de solución de albúmina, añadir agitando 10 gotas de solución de sulfato cúprico al 5%, luego 2 ml de solución de NaOH al 10%. Dejar reposar la mezcla.

22 ESPECTROFOTOMETRÍA 1. Marco Teórico Espectrofotómetro: Instrumento que mide la intensidad de la luz, compuesto por una fuente de energía radiante, una hendidura de entrada, un monocromador, una hendidura de salida, soporte para cubetas, detector y mecanismo de medición. Monocromador: Mecanismo utilizado para aislar una cierta longitud de onda, habitualmente se refiere a prismas o redes de difracción. Cubeta: Receptáculo donde se coloca la muestra en el espectrofotómetro. Blanco: Solución que contiene todos los componentes incluyendo solutos, solventes, excepto el compuesto a medirse. Absorbancia: Definida como A= 2-log%T. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de sustancia absorbente si sigue la ley de Lambert- Beer. Ley de Beer: La absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a su concentración. Si se lee a una longitud de onda constante. Espectro de absorción: Relación entre la Absorbancia de una sustancia y la la longitud de onda (permite determinar la longitud de onda más absorbida, denominada longitud de onda óptima). Luz visible: Energía radiante del espectro electromagnético que es visible al ojo humano (desde 390 hasta 780 milimicras aproximadamente). Radiación infrarroja: Región del espectro electromagnético que se extiende desde cerca de 780 a milimicras. Radiación ultravioleta: Región del espectro electromagnético comprendida entre 180 a 390 milimicras. Solución estándar: Muestra cuya concentración se conoce con exactitud. La concentración de una muestra problema se determina relacionando su absorbancia con la absorbancia del estándar. Transmitancia: Es la relación entre la luz transmitida por una solución y la luz incidente. La luz incidente se considera como un 100%. Espectro Milimicras Visible Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo %T Concentración

23 ABS LEY DE BEER-LAMBERT Concentración 2. Procedimiento 2.1. Determinación del espectro de absorción para un colorante Coloque en un tubo de ensayo 5 ml de solución de un colorante que ya está preparada. Agréguele 5 ml de agua destilada (hágalo con pipetas volumétricas). Transfiera una porción de la solución así obtenida a una cubeta para Spectronic 20 D (el volumen en la cubeta debe ser como máximo un 70% de su capacidad). En otra cubeta coloque agua destilada (este será el tubo blanco ). Calibre con el tubo blanco el espectrofotómetro en una absorbancia igual a cero (o sea un 100% de transmitancia). A continuación mida la absorbancia y la transmitancia a intervalos de 20 milimicras desde 400 hasta 640 milimicras. Registre en la siguiente tabla los valores obtenidos: Longitud de onda (nm) Absorbancia Transmitancia (%) Longitud de onda (nm) Absorbancia Transmitancia (%) GRAFIQUE LONGITUD DE ONDA Vs ABSORBANCIA. Determine la longitud de onda óptima (ver la siguiente gráfica). El color azul representa longitudes de onda entre 451 y 500 milimicras. Esperaría usted que longitudes de onda en ese rango registren una buena Absorbancia? Explique su respuesta. El color naranja representa longitudes de onda entre 591 y 620 mµ. De acuerdo a esto, qué puede deducir usted para el colorante naranja de metilo?. En qué

24 longitud de onda este compuesto registraría buenas absorbencias? Explique por qué Absorbancia Longitud de Onda 2.2. Curva de calibración para un colorante (ley de Beer-Lambert) AZUL DE BROMOTIMOL (diluir 10 miligramos por litro) NARANJA DE METILO (preparar 100 miligramos por litro) En 5 tubos de ensayo debidamente rotulados prepare 5 soluciones de concentración diferente, de la siguiente manera: Número de tubo Solución del colorante (ml) Agua destilada (ml) Absorbancia Concentración en microgramos por 100 ml de solución Determine en el espectrofotómetro la absorbancia de cada una de las cinco soluciones a la longitud de onda obtenida de la gráfica del espectro de absorción. Debe calibrar el aparato con agua destilada como blanco. GRAFIQUE ABSORBANCIA Vs CONCENTRACIÓN (ver la siguiente gráfica) Determinación de la concentración de una muestra desconocida Reclame una muestra problema del mismo colorante con el cual esté trabajando. Transfiérala a una cubeta para Spectronic 20D. Determine la absorbancia para esa muestra problema a la longitud de onda óptima. Determine además la concentración de la muestra problema mediante la curva de calibración (Absorbancia Vs Concentración) y teóricamente. Coinciden los valores?.

25 Microgramos por 100 ml 3. Consulta 3.1. Consulte las aplicaciones de la espectrofotometría en las áreas agropecuarias Será la fotocolorimetría un método analítico apropiado para cuantificar compuestos en donde se presente interferencia por color de otros componentes presentes en la muestra que presenten reactividad hacia el acomplejante que realcen el color? 3.3. Para un compuesto coloreado que se encuentre en alta concentración y que por ende exceda la lectura en el instrumento y sature la capacidad del detector, cómo se podría cuantificar? Justifique su respuesta Cuantificar el fósforo en alimentos empleados en nutrición y alimentación animal es una de las prácticas rutinarias en fotocolorimetría, consulte otros procedimientos novedosos que se relacionen con este método. Explique el impacto ambiental del fósforo en las producciones agropecuarias Consulte otras aplicaciones de la técnica. ACCIÓN DE UNA ENZIMA PRESENTE EN TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES 1. Objetivos Estudiar el efecto de una enzima (peroxidasa) presente en tejidos animales y vegetales. Comparar la acción de la peroxidasa (catalizador presente en sistemas orgánicos) y del MnO 2 (catalizador inorgánico) sobre el mismo sustrato (agua oxigenada).

26 Estudiar el efecto de la temperatura en la intensidad de la reacción. Medir la actividad catalítica por medio del desprendimiento de burbujas y la producción de calor. 2. Reactivos y Equipos Tubos de ensayo Beakers Pinzas de madera Pipetas Licuadora o morteros Termómetros MnO 2 (dióxido de manganeso) Agua oxigenada (H 2 O 2 ) Gradillas 3. Marco Teórico Las enzimas son proteínas específicas, que actúan como catalizadores de las reacciones bioquímicas en todos los seres vivos. La actividad enzimática puede comprobarse experimentalmente mediante la identificación y cuantificación de los productos formados en la reacción que ellas regulan. La acción de estos compuestos protéicos en una reacción, se afecta por la variación de factores físicos y químicos tales como la temperatura, la concentración de la enzima y del sustrato, el ph, etc. En esta práctica, se diseñan experimentos utilizando un catalizador inorgánico (MnO 2 ) y otro orgánico (peroxidasa). Esta última se encuentra tanto en tejidos vegetales como animales y actúa sobre el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada (H 2 O 2 ). El peróxido es un producto de la actividad celular y al acumularse en exceso intoxica la célula por lo cual debe ser degradado por una enzima específica. La reacción en la cual interviene la peroxidasa se presenta de la siguiente manera: Esta reacción puede visualizarse por la formación de burbujas, las cuales se producen debido al desprendimiento de oxígeno. La cantidad de burbujas es una medida cualitativa proporcional a la intensidad de la reacción y puede utilizarse para evaluar la dinámica de la reacción. 4. Sección experimental 4.1. Acción de un catalizador inorgánico sobre el H 2 O 2 Marque tres tubos de ensayo con los números 1, 2, 3. Agréguele a cada tubo lo que pueda tomar con la punta de una espátula dióxido de manganeso y proceda de la siguiente manera: Nota: Conserve, en una gradilla, todos los tubos que utilice en esta práctica para efectuar comparaciones posteriores.

27 Tome el tubo 1, agregue 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reacción para que compare con los dos tubos siguientes. Qué papel desempeña el MnO 2 en la reacción? y el agua oxigenada? Hubo desprendimiento de calor? Utilizando pinzas coloque el tubo 2, al baño de maría durante 10 minutos. Retírelo, déjelo enfriar y agréguele 2 ml de agua oxigenada. Compare la reacción con la anterior. Se presentó con mayor o menor intensidad? La temperatura afectó al catalizador? Coloque el tubo 3, en un recipiente con hielo durante 10 minutos. Retírelo e inmediatamente agréguele 2 ml de agua oxigenada. Compare la reacción con las anteriores. Cómo afectó la disminución de la temperatura, la acción del MnO 2? Explique Acción de un catalizador de origen animal sobre el H 2 O 2. Marque 4 tubos de ensayo con los números 1, 2, 3 y 4 y proceda de la siguiente manera, al tubo número 1 adicione un pedazo de hígado y 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reacción. Qué papel desempeña el hígado en ella? Cuál es la naturaleza química de la sustancia que cataliza esta reacción? Hubo desprendimiento de calor? Tome un pedazo de hígado similar al anterior, agréguelo al tubo 2 y colóquelo al baño de maría durante 10 minutos. Retírelo, déjelo enfriar y adiciónele 2 ml de agua oxigenada. Se presenta reacción? Cómo explica este resultado. Tome el tubo 3, agréguele otro pedazo de hígado en la misma cantidad anterior y colóquelo en un recipiente con hielo durante 10 minutos. Retírelo e inmediatamente adiciónele 2 ml de agua oxigenada. Ocurre reacción? Cómo es su intensidad en relación con las anteriores reacciones? Qué efecto tiene la disminución de la temperatura sobre el catalizador? Cree usted que si el agua oxigenada se agrega después de dejar que el hígado vuelva a la temperatura ambiente, la intensidad de la reacción sería como la del tubo 1? Explique. Tome el tubo 4, agréguele media cucharada cafetera de macerado de hígado y luego 2 ml de agua oxigenada. Es esta reacción mayor o menor en intensidad a la del hígado sin homogeneizar? Porqué? 4.3. Acción de un Catalizador de origen vegetal sobre el H 2 O 2 Tome el tubo 1, agréguele un pequeño pedazo de papa y luego 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reacción. Qué papel desempeña la papa en ella? Cuál es la naturaleza química de la sustancia que cataliza esta reacción? Hubo desprendimiento de calor? Explique. Tome un pedazo de papa similar al anterior, agréguelo al tubo 2 y colóquelo al baño de maría, durante 10 minutos. Retírelo, déjelo enfriar y adiciónele 2 ml de agua oxigenada. Se presenta reacción? Este resultado se explica igual que el del tubo anterior? Porqué? Tome el tubo 3, agréguele otro pedazo de papa en cantidad similar a la anterior y colóquelo en un recipiente con hielo durante 10 minutos. Retírelo e inmediatamente adiciónele 2 ml de agua oxigenada. Ocurre reacción? Cómo es su intensidad en

28 relación a los tubos anteriores? Qué efecto tiene la disminución de la temperatura sobre el catalizador? Deje el tubo en reposo por unos 5 minutos y observe de nuevo la reacción. Qué le ha ocurrido?. Qué explicación tiene este hecho? 4.4. Medición de la acción de una enzima en términos de la producción de calor Haga el montaje de tal manera que pueda proceder como se indica a continuación: Coloque un tubo de ensayo en una gradilla y agréguele media cucharada cafetera de macerado de papa, inserte en él un termómetro con la escala de tal forma que pueda leer los valores, tome la temperatura inicial. Nota: El termómetro debe dejarse descansar libremente pero de tal forma que la escala de la lectura quede visible sobre la pared del tubo en la cual está apoyado. Seguidamente, adiciónele al tubo, 2 ml de agua oxigenada y empiece a observar y anotar los valores de temperatura cada 30 segundos, las variaciones de temperatura que tengan lugar deben quedar registradas por pequeñas que éstas sean. Anote esas temperaturas en la tabla que aparece a continuación y realice una gráfica con los datos obtenidos. tiempo (minutos) Temperatura (ªC) 5. Consulta 5.1. Cómo varía la acción enzimática sobre la naturaleza física de la muestra (comparar resultados, hígado y papa macerados Vs las mismas muestras sin homogeneizar) Cuál es la función de un catalizador sobre la velocidad de reacción? Diagrame el mecanismo de acción enzima-sustrato, soportado sobre las nuevas teorías.

29 ESTUDIO DE ALGUNOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA FOSFATASA ALCALINA DE INTESTINO DE RATA 1. Objetivos Determinar experimentalmente cuál es la influencia del ph, la temperatura y la concentración de sustrato sobre la actividad catalítica de la enzima fosfatasa alcalina de intestino de rata. Calcular el valor de la constante de Michaelis Menten para esta enzima. 2. Materiales Todas las determinaciones se harán a partir de un extracto enzimático crudo, obtenido por raspado de la mucosa intestinal de rata (este extracto se suministra ya preparado al estudiante). El sustrato utilizado será el β-glicerol-fosfato, disuelto en un amortiguador de veronal. 3. Fundamento El β-glicerol-fosfato es transformado por la fosfatasa alcalina de acuerdo a la siguiente reacción: En todas las determinaciones la velocidad de la enzima se cuantificará teniendo en cuenta el fosfato liberado. 4. Procedimiento 4.1. Efecto del ph sobre la actividad enzimática Alistar 7 tubos de ensayo, cada uno con 2 ml de ácido tricloroacético al 10%. Estos tubos se llamarán recibidores y se utilizarán al final del experimento. Tomar otros 7 tubos diferentes y colocar en cada uno de ellos 2 ml de β-glicerolfosfato, M y luego agregar 7 ml de solución amortiguadora de veronal, con ph diferente para cada uno. Los ph que se van a utilizar son: Calentar los tubos durante 5 minutos a 37ºC en baño maría. Agregar 1 ml del extracto enzimático a cada tubo, con intervalo de 1 minuto entre ellos. Notas: Cada tubo debe contener hasta este momento 10 ml. El extracto debe agitarse antes de usarlo. El intervalo de un minuto entre tubo y tubo es para facilitar el procedimiento.