Efecto Hipolipemiante de Taurina y Metformín en Ratas Insulino- Resistentes Resumen Introducción

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1 Efecto Hipolipemiante de Taurina y Metformín en Ratas Insulino- Resistentes Resumen La resistencia a la insulina es una alteración metabólica que se ha relacionado a patologías tales como la hipertensión, obesidad y diabetes mellitas, entre otras. Debido a que actualmente no se cuenta con una terapia específica y eficaz para revertir dicha alteración, el propósito del presente proyecto fue investigar el efecto de la terapia combinada de taurina y metformín sobre la dislipidemia de ratas insulina-resistentes. Para ello se utilizaron ratas Wistar sometidas a una dieta alta en fructosa con el fin de producir el estado de resistencia a la insulina y a las que después de 15 días de dieta se les suministró taurina al 2% en el agua de bebida y metformín administrado vía oral a una dosis de 50 mg/kg de peso durante un mes. Fueron valorados el consumo de alimento y agua y el aumento ponderal semanalmente durante el tiempo de experimentación; al de éste, se determinaron la prueba de tolerancia a la glucosa, insulinemia, porcentaje de hemoglobina glicosilada, perfil lipídico, colesterol en bilis, así como la cuantificación de grasa intrabdominal. Los datos resultantes indican que el suministrar la dieta alta en fructosa durante mes y medio período de tiempo más largo aun que lo reportado en la literatura- no produjo un estado de resistencia a la insulina. Asimismo, que ni la taurina o el metformín, o bien, la terapia combinada de ambos compuestos ejerce efecto sobre los parámetros determinados en las ratas alimentadas con dieta alta en fructosa. Lo anterior resulta contradictorio con estudios que se han publicado en revistas de impacto, por lo que se sugiere profundizar en la investigación para determinar las posibles causas de ello o bien, establecer a este trabajo como un precedente para debatir lo ya publicado por otros grupos de investigación. Introducción En años recientes la incidencia de diabetes mellitus en el mundo se ha incrementado, siendo ya una de las principales causas de morbilidad y mortalidad. Por otra parte, las dislipidemias, que se definen como alteraciones de la velocidad de síntesis o de eliminación de lipoproteínas en la circulación sanguínea, tienen un efecto aterogénico importante. En personas diabéticas, el riesgo cardiovascular oscila entre 2 a 4 veces más que en la población en general, y como la dislipidemia es uno de los principales factores de riesgo, el metabolismo lipídico de los pacientes diabéticos adquiere relevancia. En los diabéticos tipo 2, principalmente se observa aumento de triacilgliceroles y de colesterol- LDL, mientras que el colesterol-hdl disminuye. En la actualidad, se considera que el mecanismo fisiopatológico primario responsable de la dislipidemia en diabéticos tipo 2 que comprende a la gran mayoría de diabéticos, es la resistencia a la insulina. Lo anterior ha sido demostrado en diversos estudios tanto clínicos como preclínicos, en los que además se ha encontrado relación entre la dislipidemia derivada de resistencia a la insulina con la glucosilación no enzimática de proteínas (GNEP). Por otra parte, la taurina (ácido 2-aminoetanosulfónico) además de participar en una variedad de procesos fisiológicos, se ha utilizado para prevenir complicaciones diabéticas en estudios clínicos y preclínicos por su propiedad de inhibir la GNEP, entre otras. Así, se ha demostrado experimentalmente que el aminoácido previene de la neuropatía,

2 neuropatía, retinopatía y dislipidemia diabéticas, así como de la destrucción de las células beta de los islotes de Laghergans, además de disminuir la hiperglucemia y mortalidad de animales diabéticos. En roedores diabéticos, así como en ratas y humanos insulinoresistentes se ha comprobado que la taurina (Tau) ejerce un efecto benéfico sobre el metabolismo de lípidos, la obesidad y la sensibilidad a la insulina, lo que se presumiblemente se debe a que el aminoácido se une al receptor de la insulina y estimula la captación de glucosa y aminoácidos en células de músculo esquelético y adiposas, disminuye la GNEP de lipoproteínas y el daño oxidativo, favorece la eliminación de triacilgliceroles y colesterol vía biliar aumentando la expresión de la 7-alfa hidroxilasa y reduce la actividad de la acil-coa:colesterol aciltransferasa. El metformín (Met), por otro lado, es un agente hipoglucemiante oral que se ha utilizado en diferentes países durante aproximadamente 30 años para el tratamiento de la diabetes tipo 2; su eficacia clínica se debe principalmente a que reduce la salida de la glucosa hepática a través de la disminución de la gluconeogénesis, y en menor grado a que aumenta la sensibilidad a la insulina en hígado y músculo. Se ha encontrado que el metformín activa la proteínkinasa activada por adenosín monofosfato (AMPK), lo que resulta en la fosforilación e inhibición de la acetil CoA carboxilasa y por tanto, en la disminución de la lipogénesis y la promoción de la oxidación de ácidos grasos. Además, la activación de la AMPK disminuye la expresión de la proteína 1 enlazante de elementos regulatorios de esterol (SREBP-1), factor de transcripción involucrado en la patogénesis de la resistencia a la insulina, dislipidemia y diabetes. Así, el AMPK es el principal regulador del metabolismo de glucosa y lípidos, razón por la cual se le atribuyen los efectos benéficos del metformín. El presente proyecto tiene como finalidad investigar el efecto del tratamiento concomitante de metformín y taurina sobre el perfil lipídico de ratas resistentes a la insulina. Métodos y Materiales Con el fin de montar el modelo de resistencia a la insulina se utilizaron 20 ratas Wistar macho de peso aproximado de 170 g a las que después de aclimatarlas por un período de una semana, se asignaron aleatoriamente en dos lotes, uno que fue alimentado con dieta normal y otro al que se suministró dieta especial con alto contenido de fructosa de acuerdo a lo que marca la literatura para obtener la resistencia a la insulina; lo anterior durante un mes, al final del cual se determinó previo ayuno de 16 horas la curva de tolerancia a la glucosa, insulinemia y perfil lipídico en muestras sanguíneas de los animales. Para valorar el efecto de la terapia combinada de taurina y metformín sobre la dislipidemia ocasionada por la resistencia a la insulina se utilizaron ratas Wistar con las mismas características mencionadas anteriormente a las que después de aclimatarlas en un local con condiciones controladas de luz, temperatura y humedad, se asignaron aleatoriamente a ocho lotes: 1) Testigo, 2) Taurina 2% (Tau), 3) Metformín, 50 mg/kg de peso (Met), 4) Tau + Met (TM), 5) Insulina-resistentes (IR), 6) IR+ Tau, 7) IR + Met, 8) IR+TM. A los primeros 4 lotes se les proporcionó ad libitum una dieta balanceada tal

3 como lo marca la literatura; los animales de los lotes 5 a 8 fueron alimentados con dieta alta en fructosa, uno de los pocos modelos para estudiar la resistencia a la insulina. Los animales continuaron con las dietas respectivas durante todo el experimento. A partir del día quince de iniciado el protocolo experimental se iniciaron los tratamientos con el aminoácido y la biguanida. La taurina fue suministrada disuelta al 2% en el agua de bebida. El metformín fue administrado vía oral diariamente. La terapia comprendió un período de 31 días para después de someter a los animales a un ayuno de 12 horas y efectuar las determinaciones pertinentes, sacrificarlos. Veintiocho días después de iniciados los tratamientos, se obtuvieron muestras sanguíneas por punción retrorbital para determinar en ellas haciendo uso de un glucosímetro Ames (Bayer) la glucemia basal y una curva de tolerancia a la glucosa después de administrar vía oral una carga de dextrosa disuelta al 30% en agua a una dosis de 2 g/kg de peso, tomando las muestras a los tiempos de 30, 60, 90 y 120 minutos después de la administración. Asimismo, se tomaron muestras para determinar el porcentaje de hemoglobina glicosilada (HbA1C) utilizando un equipo Ames DCA 2000 (Bayer) y para cuantificar los niveles de insulina, estas últimas se guardaron a -70 C para procesarlas posteriormente con el kit Accubind ELISA Microwells (Monobind Inc). El último día de experimentación, se obtuvieron muestras sanguíneas vía retrorbital para determinar el perfil lipídico en un equipo Selectra II (Wiener Lab), seguido de la canalización del colédoco para determinar el flujo biliar y su contenido de colesterol. Finalmente, se sacrificaron los animales para cuantificar la grasa abdominal (mesentérica, epidimal y retroperitoneal) y extraer el hígado del cual se tomó una muestra para determinar glucógeno. Cabe mencionar que se registraron el consumo de agua y alimento por animal diariamente y el aumento ponderal una vez a la semana. Los resultados se analizaron estadísticamente con el software Sigma Stat versión 2.07 utilizando la prueba de análisis de varianza. Resultados Meta 1. Montaje del modelo de resistencia a la insulina en ratas: Se procedió de acuerdo a lo marcado en la sección anterior, sin embargo, como se observa los animales fueron sometidos a al menos 16 horas de ayuno en lugar de las doce que marca la literatura y la experiencia que se tiene en el laboratorio. Lo anterior obedeció a causas ajenas a los profesores participantes. Todo ello condujo a la obtención de resultados poco confiables por lo que se omiten en esta sección y se tomó la decisión de proporcionar las dietas no veinte ni treinta días como lo expone la literatura, sino 45 días para asegurar que se indujera la resistencia a la insulina ya que no se tenían los recursos para repetir las actividades correspondientes a esta meta. Meta 2. Formación de lotes y tratamientos: En este respecto, no hubo inconvenientes. Se determinaron el consumo de alimento (Tabla 1), de agua y aumento ponderal (no se muestran resultados) observándose que no hubo diferencia significativa entre ninguno de los ocho lotes formados. De ahí se infiere que el proporcionar las distintas dietas y agentes terapéuticos no es un factor que afecte a los parámetros después determinados, además de que no produjeron toxicidad aparente.

4 Tabla 1. Efecto del tratamiento con taurina y metformín sobre el consumo de alimento de ratas con dieta alta en fructosa. Lote Semana 1 (g) Semana 2 (g) Semana 3 (g) Semana 4 (g) Semana 5 (g) Semana 6 (g) Testigo ± ± ± ± ± ± 4.3 Tau ± ± ± ± ± ± 5.6 Met ± ± ± ± ± ± 17.7 TM ± ± ± ± ± ± 15.4 IR ± ± ± ± ± ± 6.2 IR+Tau ± ± ± ± ± ± 7.8 IR+Met ± ± ± ± ± ± 19.4 IR+TM ± ± ± ± ± ± 22.6

5 Meta 3. Valoración del estado de resistencia a la insulina: Se efectuaron las valoraciones de la curva de tolerancia a la glucosa y de insulinemia, no así la de tolerancia a la insulina, por considerar que con las dos primeras bastaba. Los resultados derivados tanto de la tolerancia a la glucosa (Tabla 2) y como la insulinemia (no se muestran datos) determinada en las mismas muestras derivadas de tolerancia a la glucosa, indican que no se alcanzó un estado de resistencia a la insulina como se suponía produciría el consumo de una dieta alta en fructosa, por lo que a pesar de preparar el alimento tal y como se indica en determinadas investigaciones previas publicadas por otros grupos de investigación, en este procedimiento experimental no se reprodujo tal modelo. Tabla 2. Curva de tolerancia a la glucosa de ratas alimentadas con dieta alta en fructosa y tratadas con taurina y metformín. Lote 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min Testigo 76.0 ± ± ± ± ± 22.6 Tau 79.3 ± ± ± ± ±11.7 Met 76.8 ± ± ± ± ±16.6 TM 75.4 ± ± ± ± ± 9.9 IR 75.3 ± ± ± ± ± 6.6 IR+Tau 75.7 ± ± ± ± ±32.6 IR+Met 71.1 ± ± ± ± ± 12.4 IR+TM 78.1 ± ± ± ± ± 8.5 Meta 4. Cuantificaciones en sangre completa: La glucemia basal obtenida de muestras sanguíneas de los animales en ayunas corresponden a la columna a tiempo cero de la Tabla 2. De las mismas muestras se tomaron 10 microlitros para determinar el porcentaje de hemoglobina glicosilada (HbA1C) obteniéndose los siguientes resultados: Testigo, 3.6 ± 0.1; Tau, 3.7 ± 0.1; Met, 3.7 ± 0.1; TM,4.4 ± 0.6; IR, 3.6 ± 0.0; IR+Tau, 3.6 ± 0.1; IR+Met, 3.7 ± 0.1; IR+TM, 3.6 ± 0.1. Como se puede apreciar, ni las dietas, ni los tratamientos ejercieron efecto alguno sobre la glucemia ni la glicosilación no enzimática de proteínas, ya que la HbA1C se utiliza como indicador de glicación general. Meta 5. Evaluación del efecto hipolipemiante de los tratamientos: En la Tabla 3 se muestran los resultados correspondientes y se observa que el tratamiento ya sea solo o

6 combinado de taurina y metformin carecieron de efecto sobre el perfil lipídico de ratas alimentadas con dieta alta en fructosa. Tabla 3. Perfil lipídico de ratas alimentadas con dieta alta en fructosa y tratadas con taurina y metformín. Lote HDL LDL Triacilgliceroles Colesterol total (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) Testigo 5.6 ± ± ± ± 1.0 Tau 5.3 ± ± ± ± 0.8 Met 6.0 ± ± ± ± 0.7 TM 5.4 ± ± ± ± 1.1 IR 5.3 ± ± ± ± 0.9 IR+Tau 5.8 ± ± ± ± 0.9 IR+Met 6.7 ± ± ± ± 1.3 IR+TM 6.5 ± ± ± ± 0.8 Metas 6, 7 y 8. Cuantificación de glicosilación avanzada, Determinación del efecto colerético de los tratamientos y Valoración del efecto de los tratamientos sobre el glicógeno hepático: La determinación de productos finales de glicosilación avanzada se tenía planeado hacerla con un kit comercial de la marca Roche; sin embargo, a pesar de inicialmente decir que sí nos lo surtirían, finalmente no lo hicieron aludiendo que en nuestro país no lo comercializan. En cuanto al efecto colerético, no se observó efecto alguno (no se muestran resultados) de la misma manera que lo ocurrido con los demás parámetros anteriormente determinados. Finalmente, la cuantificación de glicógeno hepático no fue llevada a cabo debido a que no hubo en existencia la enzima alfa-glucosidasa, indispensable para la valoración del mismo; pese a ello, se guardaron muestras para la posterior determinación del glicógeno, una vez que llegue la enzima. Meta 9. Evaluación del efecto de los tratamientos sobre la obesidad: Después de colectar el tejido adiposo epididimal, retroperitoneal y mesentérico y comparar el peso entre los animales de los diferentes tratamientos, no se encontró diferencia significativa entre ninguno de ellos. Lo anterior en contraposición con la hipótesis de que el tratamiento con los dos agentes de manera individual o en combinación disminuiría la obesidad de los animales tratados con la dieta rica en fructosa.

7 De esta manera, se concluye que bajo las condiciones experimentales de trabajo, la dieta alta en fructosa no produjo el estado de resistencia a la insulina pese a lo indicado en la literatura. Asimismo, que ni la taurina ni el metformín mostraron actividad antiglicación o hipolipemiante en ratas alimentadas con dieta rica en fructosa, lo que rechaza la hipótesis planteada para este proyecto. Impacto Existen publicaciones en revistas de impacto en las que, por un lado, se reproduce el modelo de resistencia a la insulina en ratas Wistar al alimentarlas con dieta alta en fructosa; y por otro, en otros artículos se propone a la taurina o bien al metformín para prevenir o contrarrestar la insulina-resistencia con los fundamentos explicados en la introducción (arriba). Los resultados de este trabajo indican que la dieta no funciona para ocasionar resistencia a la insulina y que los agentes en estudio no ejercen efecto alguno sobre los parámetros determinados, por lo que habrá que profundizar en el porque de estos resultados para así poder debatir a lo ya publicado en este respecto.

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