Primera parte: Observación de mutaciones alares en Drosophila melanogaster

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1 Primera parte: Observación de mutaciones alares en Drosophila melanogaster Departamento de Genética i Microbiología Alba.Garcia.Rodriguez@uab.cat Curso Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès

2 OBJETIVOS Introducción al ensayo de mutación y recombinación somática SMART para la evaluación de posibles efectos genotóxicos de agentes químicos o físicos. Observación de fenotipos en alas de D. melanogaster debido a distintos eventos mutacionales. Estudiar la importancia de efectos biológicos que pueden inducir la expresión de alelos mutantes. INTRODUCCIÓN Para esta práctica hay tres conceptos básicos a tener en cuenta: Genotoxicidad, daño en el DNA y mutación. Genotoxicidad; Capacidad de un agente físico o químico para DNA. dañar el Daño en el DNA; Lesiones en la molécula de DNA como roturas o modificaciones químicas. Ejemplos: - Roturas de cadena simple o de doble cadena. - Modificaciones químicas en las bases nitrogenadas por mecanismos como oxidación, alquilación, etc. Existen muchos agentes genotóxicos, unos más potentes que otros, por ejemplo, la luz ultravioleta puede causar hasta 1x10⁵ lesiones por día (Hoeijmakers, 2009). También, se ha estimado que el humo del cigarrillo causa 1000 lesiones en el DNA por célula (Phillips et al., 1988) Figura 1. Colección de tipos de daño del DNA (Modificado de Lord y Ashworth, 2012)

3 Mutación: Cambio en la secuencia del DNA. Ejemplo 1: La secuencia de DNA en una célula es: ATGCCTGAA... Sin embargo, después de la división celular las células hijas presentan una modificación en dicha secuencia: ATGGCTGAA... Ha ocurrido un cambio en la cuarta posición de la secuencia; donde había citocina (C), ahora hay guanina (G). Ejemplo 2: ATGCCTGAATGCTGCGGAA (secuencia original) ATGGCTGCGGAA (secuencia en la descendencia, que ha perdido 7 bases, indicadas con negrita en la secuencia original) El daño en el DNA no se considera una mutación, sin embargo, se debe tener en cuenta que el daño en el DNA incrementa la probabilidad de aparición de una mutación. Ensayo de mutación y recombinación somática (SMART) Los ensayos de mutación y recombinación somáticas en D. Melanogaster son ensayos in vivo que permiten la detección rápida y barata de agentes genotóxicos. Se basan en la detección y cuantificación de eventos mutacionales y recombinacionales en células somáticas de un organismo eucariota. Se han descrito dos sistemas de ensayo diferentes, uno que emplea marcadores de las alas (Graf et al.,1984) y el otro que emplea marcadores que afectan a la pigmentación de los ojos (Vogel y Zijlstra, 1987).

4 Estas pruebas se basan en la pérdida de heterocigosidad de los genes normales en las células de los discos imaginales de las larvas, lo que causa la formación de clones o sectores de células mutantes, expresándose fenotípicamente en clones mutantes en las alas o en los ojos de las moscas adultas. Así, el ensayo SMART permite determinar, de manera rápida, el potencial de un agente químico o físico para inducir la pérdida de la heterocigosidad (LOH, del inglés Loss of Heterozygosity). La pérdida de heterocigosidad (LOH) es un mecanismo genético por el cual una célula somática heterocigota pasa a un estado homocigoto o hemicigoto debido a la pérdida del otro alelo en el cromosoma homólogo (Happle, 1999). De esta manera, puede llevar a la expresión de alelos recesivos (Figura 2). Una célula puede sufrir la pérdida de heterocigosidad debido a una mutación génica, reordenamiento cromosómico, rotura cromosómica o pérdida cromosómica. (Rodrigues de Andrade et al., 2004)

5 Figura 2. La pérdida del alelo silvestre (A, en nuestro ejemplo) de una célula heterocigota permite que la expresión del alelo recesivo (a) sea evidente en el fenotipo. SMART en alas (wing spot test) Este ensayo fue desarrollado por Graf et al, (1984) y constituye el único ensayo descrito que utiliza marcadores de alas para el estudio de mutación y recombinación somática. Este ensayo se lleva a cabo sometiendo a larvas de Drosophila melanogaster a una exposición con el agente a evaluar (por ejemplo, diferentes concentraciones de un compuesto químico). En el interior de la larva existen poblaciones celulares llamadas discos imaginales que durante la metamorfosis darán lugar a las diferentes estructuras de la mosca adulta, como ojos, antenas, patas, etc. (Figura 3).

6 Figura 3. Los discos imaginales se encuentran dispuestos en el interior de la larva. Se indican las estructuras que darán lugar en el individuo adulto (Morgan, D. (2007). The Cell cycle: principles of control) Si durante los ciclos de división mitóticos el agente a evaluar es capaz de dañar el DNA de las células que forman los discos imaginales se generaran m utaciones en los alelos silvestres, de modo que se puede esperar la expresión de los alelos recesivos de los genes marcadores. La(s) células(s) que sufran la pérdida de heterocigosidad darán origen a un clon celular de tipo mwh o flr 3 siendo visibles en la superficie del ala de un individuo adulto en forma de sectores o spots (Figura 4). La mutación mwh se ubica en el cromosoma 3, es recesiva, su origen es espontáneo y resulta viable en homocigosis. Su manifestación fenotípica se caracteriza por la aparición de tres o más tricomas en cada célula alar en lugar de uno por célula, que es el fenotipo normal. La mutación flr 3 está situada también en el cromosoma 3, es recesiva y originalmente se obtuvo por tratamientos con metanosulfonato de etilo; produce letalidad en homocigosis en la línea germinal, pero no en las células somáticas. El fenotipo es bastante variable ya que se pueden observar desde pelos cortos, gruesos y deformes, hasta pelos amorfos con aspecto globular.

7 Figura 4. Dentro de las circunferencias se muestran los sectores o clones mutantes en la superficie del ala. Note el la diferencia con los pelos normales alrededor del clon. (Rodrigues de Andrade et al, 2004) La aparición de sectores simples (mwh o flr 3 ) indican la ocurrencia de una mutación puntual, una alteración cromosómica o recombinación mitótica. Los sectores simples se dividen en sectores pequeños (1 ó 2 células mutantes) y sectores grandes (3 ó más células mutantes). Los sectores pequeños se producen durante los últimos ciclos mitóticos en la pupa, mientras que los sectores grandes lo hacen en la etapa larvaria (etapa de ingestión del alimento). Sin embargo, estas diferencias no son completamente exactas debido a las variaciones en el tiempo de desarrollo, a las diferentes propiedades farmacocinéticas de los agentes (ingestión, transporte, bioactivación, tasa de excreción, etc.) o, incluso porque ciertos clones pueden tender a permanecer pequeños (Graf et al,1984).

8 Los sectores dobles (clones mwh y flr 3 adyacentes) aparecen únicamente debido a recombinación mitótica, por lo que indican la acción recombinogénica de un compuesto evaluado (agente químico o físico). El número total de clones inducidos en un grupo de individuos (larvas) permite obtener datos cuantitativos en relación a la actividad genotóxica total del compuesto, mientras que el tipo y tamaño de los clones pueden revelar los mecanismos mutacionales involucrados en la producción del clon (Figura 5). Figura 5. Mecanismos que explican la aparición de los diferentes sectores mutantes en el ala (Graf et al, 1984)

9 Observación microscópica 1. Anotar y numerar la disposición de las alas en la lámina portaobjetos. 2. Colocar la lámina con el extremo biselado hacia la derecha de la platina. 3. Buscar y centrar la primera ala del extremo superior izquierdo utilizando el objetivo de 10 aumentos (10X) 4. Identificar los sectores en los que se divide el ala. Figura 6. Ubicación aproximada de las alas en la lámina portaobjetos. Figura 7. El ala se divide en 7 sectores. Teniendo en cuenta la línea vertical en la figura, la parte del ala que se encuentra a la izquierda, presenta pelos pequeños que no permiten observar la presencia de los fenotipos flr o mwh. 5. Girar el revólver del microscopio hacia el de 40 aumentos (40X) 6. Obsérvese minuciosamente cada uno de los sectores del ala siguiendo el orden establecido en el paso La observación microscópica para cada ala se realiza desde el sector A hasta el E desplazándose como se indica a continuación:

10 Si se está evaluando la capacidad genotóxica de un agente, se realiza una comparación entre los grupos de tratamiento (que fueron sometidos a diferentes dosis del agente) con respecto a un grupo control (que no fue sometido al agente). Bibliografía Graf U., Wurgler F.E., Katz A.J., Frei H., Juon H., Hall C.B., Kale P.G. (1984) Somatic mutation and recombination test in Drosophila melanogaster. Environ. Mutagen., 6: Rodrigues de Andrade H.H., Reguly M.L., Lehmann M. (2004) Wing somatic mutation and recombination test. En: Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson D.S. ed. Humana Press Happle R. Loss of heterozygosity in human skin. J Am Acad Dermatol Aug;41(2 Pt 1): Morgan, D. (2007) The Cell cycle : principles of control. London. New Science Press. Hoeijmakers JH. DNA damage, aging, and cancer. 8;361(15): N Engl J Med Oct Phillips DH, Hewer A, Martin CN, Garner RC, King MM. Correlation of DNA adduct levels in human lung with cigarette smoking. Nature Dec 22-29;336(6201): Lord CJ, Ashworth A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature Jan 18;481(7381):

11 Segunda parte. Observación de cromosomas humanos OBJETIVOS Observar la morfología y número de los cromosomas humanos usando una metodología de tinción convencional. Conocer las ventajas y desventajas de las técnicas citogenéticas y su aplicación en la clínica y en la investigación.

12 INTRODUCCIÓN Los cromosomas (del griego, chroma, color y soma, cuerpo) son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresión dinámica en las distintas fases del ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactación que alcanza su máximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tiñen fácilmente cuando están condensados y pueden ser individualizados con el microscopio óptico. Cada cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas proteínas y el contenido de genes es variable aunque está en relación con su tamaño. Por eso, cualquier alteración en el número o la estructura de los cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la detección de estas alteraciones se desarrollaron numerosas técnicas y todas ellas requieren de un observador entrenado que las interprete. La citogenética es la rama de la biología que se encarga del estudio de la estructura, organización y función de los cromosomas, así como de sus anomalías. Los avances en las técnicas de biología molecular han permitido establecer el desarrollo de la citogenética molecular, sin embargo la citogenética convencional acompaña siempre de forma paralela los nuevos estudios. Cariotipo Los humanos tenemos un número total de 46 cromosomas y este número varía según las especies. Los 46 cromosomas están constituidos por 23 pares de homólogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El cariotipo es el conjunto cromosómico de un individuo que se puede conocer por medio de la fórmula cromosómica o de una imagen que muestra los cromosomas, conocida como cariograma. Los cariotipos se pueden informar presentando todos los pares cromosómicos ordenados de acuerdo a su tamaño, que en un principio eran recortados de la fotografía de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automáticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se señala por

13 separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el número total de cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma. Así, el cariotipo normal de un varón se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Las anomalías cromosómicas son una causa más importante de abortos espontáneos, retardo mental y malformaciones. Ejemplos: 1. El cariotipo de un varón con un cromosoma 21 adicional se describe con la siguiente fórmula: 47,XY,+21 (Trisomía 21) 2. Una célula que presenta 45 cromosomas, siendo un cromosoma 4 el que ha perdido, se describe: 45,XY, -4 (Monosomía del cromosoma 4). Las normas para la descripción del cariotipo se encuentran en el manual ISCN (en la bibliografía se cita la versión 2009). Cromosomas metafásicos Durante la interfase del ciclo celular, los cromosomas se mantienen sin dividirse y sin un grado de condensación elevado. Sin embargo, después de la fase S (síntesis de DNA) y al iniciar la etapa de división celular, el grado de condensación es mayor. Al alcanzar la etapa de metafase, los cromosomas se encuentran en su máximo grado de organización y es en esta etapa donde pueden ser fácilmente visibles al microscopio óptico bajo una tinción con un colorante básico. Cada cromosoma metafásico está constituido por dos cromátides unidas por el centrómero. Este centrómero o constricción primaria divide al cromosoma en dos brazos que se designan p (pequeño) para el brazo corto y q para el brazo largo. De esa manera, por ejemplo, 7p es el brazo corto del cromosoma 7; e Yq es el brazo largo del cromosoma Y. La posición del centrómero nos permite clasificar a los cromosomas en tres tipos principales: 1. Metacéntricos: cuando el centrómero es más o menos central y los brazos son de aproximadamente igual longitud.

14 2. Submetacéntricos: cuando el centrómero está alejado del centro y los brazos son desiguales. 3. Acrocéntricos: cuando el centrómero está cerca de uno de los extremos y uno de los brazos es muy corto. Sobre alteraciones en los cromosomas Existen cuadros clínicos asociados a un número diferente de 46 en la especie humana, por ejemplo (probablemente los más conocidos): 47,XX,+21 o 47,XY,+21 está asociado al síndrome de Down. 45,X Síndrome de Turner. 47, XXY Síndrome de Klinefelter. 47,XX,+13 Síndrome de Edwards 47,XX,+18 Síndrome de Patau Existen alteraciones en la morfología de los cromosomas que también están asociadas a otros cuadros clínicos, por ejemplo, el Síndrome de Lejeune (cri du chat /maullido de gato). Las personas con este síndrome presentan una deleción (pérdida) de una parte del brazo p de uno de los cromosomas 5 (46,XX,5p- ó 46,XY,5p-). Un espectro amplio de alteraciones numéricas y estructurales de los cromosomas son frecuentemente observadas en células cancerígenas. En la especie humana, no todas las alteraciones en la morfología de los cromosomas están, asociadas a un cuadro clínico. Por ejemplo, la región pericéntromérica (alrededor del centrómero) de los cromosomas 1, 9 y 16, así como el brazo q del cromosoma Y suelen tener diferencias de tamaño entre los individuos. Estas variantes se encuentran en un porcentaje mayor al 1% en la población por lo que se definen como polimorfismos cromosómicos.

15 El bandeo cromosómico Con la técnica convencional de tinción con Giemsa los cromosomas se tiñen intensamente y de forma homogénea y se los puede contar y agrupar por su aspecto general y eso era lo único que se podía hacer en los primeros cariotipos. La identificación de cada cromosoma vino posteriormente con las técnicas de bandeo. Estas técnicas que generan bandas transversales permiten definir a cada cromosoma y estudiar su estructura. Cada cromosoma tiene del patrón de bandas característico y existen varias técnicas de tinción con fines específicos (Tabla I). El bandeo G es el más utilizado en citogenética clínica. El bandeo G se logra con un tratamiento controlado con tripsina antes de la coloración con Giemsa y produce bandas claras y oscuras en los cromosomas. Las bandas oscuras contienen ADN rico en bases A-T que replica tardíamente y son pobres en genes constitutivos y las bandas claras contienen ADN rico en G-C que replica tempranamente y tienen muchos genes constitutivos. Cuando un cromosoma está más elongado puede mostrar un mayor número de bandas y esto se aprovecha para estudiarlo con mayores detalles. Esta metodología que permite buscar alteraciones estructurales mínimas se conoce como bandeo de alta resolución y se logra sincronizando el cultivo y con preparaciones hechas en profase o prometafase, es decir, antes que los cromosomas alcancen su compactación máxima. Figura 1. Cromosomas humanos con tinción homogenea de Giemsa (a) y tinción por Bandas G (b).

16 Observación microscópica Una vez colocada la lámina portaobjetos en la platina del microscopio, desplace la misma de manera que el objetivo de 10X (16X en algunos microscopios) permita la observación de la primera gota desde la izquierda de la lámina como se muestra en la figura siguiente. = Lugar aproximado para iniciar la observación microscópica Mueva el revólver del microscopio para el uso del objetivo de 40X. Observe a través de los oculares y desplace la platina cuidadosamente como se indica a continuación con la finalidad de encontrar placas metafásicas. Una vez encontrada una placa metafásica, desplace el revólver del microscopio de tal manera que lo que desea observar en la lámina portaobjetos se encuentre entre los objetivos de 40X y 100X. Coloque una gota mínima de aceite de inmersión en la zona que se desee visualizar. Mueva el objetivo de 100X hacia la gota y enfoque moviendo suavemente el tornillo micrométrico. Cuente el número de c romosomas. Identifique la morfología de los cromosomas observados al microscopio usando como guía la descripción de la Figura 1 Morfología de los cromosomas metafásicos.

17 p s c q Metacéntrico Submetacéntrico Acrocéntrico Figura 2. Morfología de los cromosomas metafásicos cro: cromátida. (Cada cromosoma metafásico presenta dos cromátidas hermanas) p: brazo p q: brazo q c: centrómero (cada cromátida presenta una secuencia centromérica) s: satélite. Los satélites corresponden a regiones involucradas en la organización del nucleolo. Estas regiones se condensan tardíamente por lo que es posible observar una fibra de cromatina en cromosomas metafásicos.

18 Bibliografía Lewis (2003) Human Genetic: Concepts and Applications, 5th Edition. The McGraw Hill. Guerra, MS. Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al. Rev. Bras. Genet. 1986, 9: ISCN 2009: International System for Human Cytogenetic Nomenclature: Recommendations of the International Standing Committee on Human Cytogenetics Nomenclature. Lisa G. Shaffer (Author, Editor), Marilyn L. Slovak (Editor), Lynda J. Campbell (Editor) Harper, Peter S. First years of human chromosomes: the beginnings of human cytogenetics. Bloxham: Scion, 2006