PRINCIPIOS DE VALIDACIÓN PARA LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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1 CAPÍTULO PRINCIPIOS DE VALIDACIÓN PARA LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS INTRODUCCIÓN La validación consiste en la evaluación de un proceso a fin de determinar su idoneidad para un uso particular e incluye la optimización de una prueba y la demostración de las características de su realización. Un ensayo validado para una enfermedad infecciosa produce resultados que identifican la presencia de un componente concreto que se ha de analizar (por ejemplo, los componentes de un agente infeccioso o un anticuerpo inducido por dicho agente) y permite la posibilidad de formular predicciones sobre el estado de los sujetos analizados. Las pruebas realizadas en individuos o en poblaciones tienen varios propósitos, tales como ayudar a documentar la ausencia de una determinada enfermedad en un país o región, evitar su propagación a través del comercio, erradicar una infección de una zona, confirmar el diagnóstico de los casos clínicos, estimar la prevalencia de una infección para facilitar análisis de riesgo, identificar a los animales infectados con vistas a desarrollar medidas de control, y clasificar los animales según su salud o estado de inmunización tras la vacunación. Es posible validar una única prueba para uno o varios propósitos mejorando algunas características de su realización en cada caso (por ejemplo, elevando el nivel de sensibilidad del diagnóstico hasta el 99,99% y disminuyendo a la vez su especificidad para un ensayo general, o inversamente, estableciendo una alta especificidad asociada a un bajo nivel de sensibilidad en una prueba confirmativa). Los principios de validación discutidos en este capítulo se centrarán sobre todo en los métodos de detección de anticuerpos en sueros mediante, por ejemplo, la utilización del enzimoinmunoensayo (ELISA). No obstante, estos mismos principios son aplicables a la validación de ensayos para otros compuestos en sueros o tejidos. El capítulo Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas extiende los principios aquí esbozados a un método directo de detección del agente infeccioso: el ensayo de diagnóstico molecular. Si consideramos las variables que pueden afectar a la realización de un ensayo, podremos apreciar más claramente los criterios que deben tenerse en cuenta para su validación. Estas variables pueden agruparse en tres categorías: (a) la muestra que refleja las interacciones hospedador/organismo que influye en la composición y la concentración del componente a analizar en la muestra de suero; (b) el sistema de ensayo que incluye factores físicos, químicos, biológicos y técnicos que afectan a la capacidad de la prueba para detectar en la muestra un componente específico; y (c) el resultado de la prueba es decir, la capacidad del sistema de ensayo para predecir de forma precisa el estado del individuo o de la población en relación con el componente en cuestión. Los factores que influyen en la concentración y en la composición de un componente de la muestra de suero dependen en gran medida del hospedador y son factores naturales (como la edad, sexo, raza, estado nutritivo, embarazo, respuesta inmunológica), o bien factores adquiridos (como la adquisición pasiva de anticuerpos, la inmunidad activa obtenida por la vacunación o la infección). Otros factores que no dependen del hospedador, como la contaminación o el deterioro de la muestra, también pueden afectar al componente a analizar en dicha muestra. Los factores que interfieren en la precisión analítica del sistema de ensayo incluyen la instrumentación, el error técnico, la elección de los reactivos (tanto desde el punto de vista químico como biológico), la calibración, ajuste y límites de validez de los controles, los recipientes de las Manual de la OIE sobre animales terrestres

2 reacciones, la calidad del agua, el ph y la fuerza iónica de los tampones y diluyentes, las temperaturas y duración de la incubación, así como los errores que se introducen por la detección de compuestos estrechamente relacionados, del tipo de anticuerpos con reacción cruzada, factores reumatoides, o anticuerpos heterófilos. Los factores que influyen en la capacidad del resultado de una prueba para predecir de forma precisa la infección o el nivel de un componente analizado en el hospedador 1 son la sensibilidad del diagnóstico, la especificidad del mismo, y la prevalencia de la enfermedad en la población objeto de la prueba. La sensibilidad y la especificidad diagnósticas derivan de resultados de pruebas con muestras obtenidas de animales de referencia previamente seleccionados. Los métodos empleados para seleccionar a estos animales son importantes para la precisión de las estimaciones (5). El grado en que dichos animales representen todas las variables ambientales y del hospedador en la población examinada tiene una influencia fundamental en la adecuada interpretación de los resultados. Por ejemplo, los clínicos experimentados saben que un ensayo validado para un tipo de ganado vacuno del norte de Europa puede que no sea adecuado para suministrar resultados válidos cuando se aplica a poblaciones de ganado de África. La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el estado de infección y/o exposición de un animal o población es la consideración más importante para la validación de un ensayo. Esta capacidad no sólo depende de un ensayo preciso y muy fiable (que incorpore reactivos bien caracterizados y estandarizados), y de estimaciones cuidadosamente obtenidas acerca de la sensibilidad y la especificidad de diagnóstico, sino que también está muy influenciada por la prevalencia de la infección en la población sometida a análisis o por la probabilidad de que un animal esté infectado según criterios clínicos. Sin una estimación real de la prevalencia de la enfermedad en esa población o de la probabilidad de infección en un animal aislado, la interpretación del resultado positivo o negativo de una prueba puede resultar dudosa. Por supuesto, antes de considerar validado un ensayo, se deben tener en cuenta muchas variables (5, 16). Sin embargo, no hay consenso sobre si el concepto de validación de un ensayo es un proceso temporalmente limitado, en el que solamente se optimizan y estandarizan aquellos factores inherentes al ensayo, o bien si supone una validación continuada del ensayo por todo el tiempo en el que puede utilizarse el ensayo. De acuerdo con lo descrito, el término "ensayo validado" puede prestarse a varias interpretaciones entre los técnicos de laboratorio y los veterinarios clínicos. Por consiguiente, se ofrece una definición funcional de la validación de un ensayo como marco para las directrices esbozadas a continuación. En teoría, todas las pruebas diagnósticas deberían ser completamente validadas para uno o varios fines, pero en la práctica a veces existen limitaciones para una validación completa. DEFINICIÓN DE LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO Un ensayo validado proporciona de modo repetitivo unos resultados de prueba que identifican a los animales como positivos o negativos para un componente o proceso determinado (por ejemplo un anticuerpo, un antígeno, o la induración cutánea localizada en el sitio de prueba) y, por deducción, permite predecir de modo preciso el estado de infección y/o exposición de animales con un grado predeterminado de fiabilidad estadística 2. 1 A lo largo de este capítulo, los términos positivo y negativo se emplean con relación a los resultados de las pruebas y nunca para designar el estado de infección o el nivel de anticuerpo/antígeno en el hospedador. Cuando se hace referencia a infección o compuesto a analizar se supone la existencia de algún modo de exposición a un agente infeccioso que puede ser detectado de modo directo (como el antígeno) o indirecto (como el anticuerpo) por una prueba de ensayo. 2 Según esta definición, la sensibilidad y especificidad diagnósticas son características de la realización de una prueba para una población estudiada. Ambas características determinan en conjunción con la prevalencia de la enfermedad en la población- la probabilidad de que un resultado concreto de una prueba refleje el verdadero estado del animal. Puede aceptarse como validada una prueba si se dispone de estimaciones fiables de la sensibilidad y la especificidad diagnósticas para la población estudiada. Esto no implica ningún valor-umbral mínimo para esos parámetros. En las aplicaciones prácticas, los valores bajos de sensibilidad y especificidad diagnósticas o los problemas de diagnóstico debidos a una baja prevalencia de la enfermedad se compensan mediante el diseño del muestreo o combinando múltiples pruebas de diagnóstico en un sistema de pruebas en paralelo o en series de pruebas. La selección de las pruebas, el proceso de muestreo, la combinación de muchas pruebas en un sistema de aplicación de las mismas y la norma de interpretación de los resultados determinan el proceso de diagnóstico. 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

3 En esta definición se ha incluido de forma implícita el requisito de que el método de ensayo se haya elaborado, optimizado y estandarizado de forma adecuada a fin de conseguir unas características de realización que sean consistentes con el propósito al que se destina el ensayo. El presente capítulo se centrará en los principios que subyacen a la elaboración y mantenimiento de un ensayo validado. Algunas reiteraciones de este capítulo (12) son exposiciones resumidas de un artículo de una revista (9). En aquel momento, el objetivo era proporcionar principios generales de validación de pruebas. En la presente actualización, el contenido se reorganiza en partes de validación de pruebas que sean congruentes con el formato de la Plantilla de Validación de la OIE, y se enfatiza la necesidad absoluta de predeterminar el fin o fines específicos de los ensayos. Además del proceso de validación per se, se ofrece asesoramiento sobre métodos con sólidos fundamentos científicos para la elaboración, mantenimiento y difusión de criterios de validación para un ensayo concreto. Debe hacerse hincapié en que un ensayo, cuando se aplica a poblaciones, minimizará la clasificación errónea de animales como falsos positivos o falsos negativos solamente en la medida en que su validez esté garantizada en todas las fases del proceso de validación del ensayo (véase la sección B. Validación de un ensayo, Parte I). Esto supone que el ensayo es adecuado para el fin perseguido (p. ej., un ensayo confirmativo producirá muchos resultados negativos falsos si se usa como prueba tamiz). También supone que la utilización de un método de ensayo bien concebido, diseñado y documentado y de reactivos adecuados y estandarizados, en combinación con técnicos bien preparados proporcionará un ensayo estable dentro del laboratorio. Es más, también implica el empleo minucioso de un riguroso diseño experimental y de herramientas epidemiológicas y estadísticas. Estos son elementos requeridos para eliminar el sesgo, los errores aleatorios y las falsas suposiciones acerca de la población de animales sobre la que se formulan las estimaciones del ensayo (5). Finalmente, esto también supone que, en la práctica, la prueba se aplica dentro del contexto de un programa riguroso de control de calidad. A. REQUISITOS ESENCIALES PARA LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO 1. Selección de un ensayo apto para el fin perseguido La Norma de la OIE sobre Gestión y Requisitos Técnicos para los Laboratorios que Realizan Pruebas para las Enfermedades Infecciosas (14) 3 : Esa norma establece que los métodos de ensayo y los procedimientos relacionados deben ser adecuados para las aplicaciones diagnósticas específicas a fin de que los resultados de los ensayos sean pertinentes. En otras palabras, el ensayo debe ser apto para el fin perseguido. Tal como se esboza en la información básica del Certificado de pruebas de diagnóstico en la página web de la OIE ( el primer paso consiste en la selección de un tipo de ensayo que tenga posibilidades de ser validado para un uso concreto. Se ha definido ampliamente el fin o fines de un ensayo: 1) Demostrar la ausencia de infección en una población definida (país/zona/departamento/rebaño) (prevalencia de apariencia cero): 1a) Libre con y/o sin vacunación, 1b) Ausencia histórica, 1c) Restablecimiento de la ausencia después de los brotes. 2) Certificar la ausencia de infección o agente causal en animales concretos o productos utilizados para el comercio o el transporte. 3) Erradicación de la enfermedad en poblaciones definidas. 4) Diagnóstico confirmativo de casos clínicos o sospechosos (incluyendo la confirmación de pruebas de criba con resultados positivos). 5) Estimación de la prevalencia de la infección o exposición para facilitar el análisis de riesgos (encuestas, estatus sanitario del rebaño, medidas para el control de la enfermedad). 6) Determinar el estado inmune de animales concretos o de poblaciones (después de la vacunación). En la Norma de la OIE también se establece que, para que un método de ensayo pueda considerarse adecuado, debe validarse de forma apropiada, y esta validación debe cumplir con los principios esbozados en los capítulos sobre validación del presente Manual de animales terrestres. 3 Esta es una interpretación estadística de los requisitos establecidos de forma más genérica en la norma internacional de calidad ISO/IEC 17025:2005 para los laboratorios de prueba (8). Manual de la OIE sobre animales terrestres

4 Si bien el presente capítulo trata de la validación y adecuación al fin perseguido desde una perspectiva científica, debe tenerse en cuenta que existen otros factores que pueden influir en la relevancia de un ensayo respecto a la adecuación de la misma al fin perseguido. Entre dichos factores se incluyen no sólo la adecuación diagnóstica de la prueba, sino también su aceptación por las comunidades científica y reguladora, su aceptabilidad por parte del cliente, y su aplicabilidad mediante los recursos de laboratorio disponibles. La incapacidad para cumplir con los requisitos operativos de un ensayo también puede convertirlo en inadecuado para el fin perseguido. Entre tales requisitos, se pueden incluir los costes de realización, la disponibilidad de equipo, el nivel de sofisticación técnica y de las destrezas de interpretación, la disponibilidad de kits/reactivos, la caducidad de los productos, las condiciones para el transporte, la seguridad, la bioprotección, el rendimiento de la muestra, el tiempo para la obtención de resultados, los aspectos relacionados con el control de calidad y la garantía de calidad. 2. Consideraciones iniciales sobre la elaboración de ensayos En este capítulo utilizaremos un enzimoinmunoensayo indirecto (técnica ELISA) para la detección de anticuerpos a fin de ilustrar los principios de validación de un ensayo. Es un formato de prueba que puede resultar difícil de validar debido a la amplificación de la señal de los componentes específicos y los inespecíficos (2). Esta metodología sirve para destacar los problemas a los que hay que enfrentarse en cualquier proceso de validación. Los mismos principios básicos se utilizan en la validación de otros formatos de ensayo simples o complejos. Sin embargo, para cada tipo único de prueba, como la detección de antígenos por la prueba ELISA, puede necesitarse una recogida de muestras y unas condiciones de almacenaje diferentes. En este capítulo se asume que quien elabora un ensayo tiene un alto nivel de conocimiento científico experto relevante para lograr una adecuada preparación y utilización de los protocolos y los reactivos, que conduzcan a un ensayo validado que sea publicable en revistas que cuenten con revisión por pares. En el capítulo , sobre validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la polimerasa que se usan para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, se describen los principios para validar técnicas de amplificación de genes. La selección de muestras adecuadas, la instrumentación calibrada y la metodología pertinente para lograr el fin perseguido son elementos de importancia crítica en la validación de pruebas. La continuidad de los experimentos queda asegurada cuando se escogen las muestras y los reactivos, se preparan de forma adecuada, divididas en alícuotas y almacenadas para su uso en cada experimento. Eso reduce al mínimo el número de variables y ayuda a prevenir fallos una vez iniciado el proceso de validación. Este enfoque reduce la variabilidad y proporciona los datos necesarios para establecer controles adecuados a fin de asegurarse de que cada aplicación de la prueba es válida. a) Estudios de viabilidad selección de muestras Se necesitan muestras para los experimentos a fin de determinar si la prueba propuesta es viable. Para este paso preliminar, resulta útil seleccionar cuatro o cinco sueros (en nuestro caso) que difieran en cuanto al nivel de anticuerpos contra el agente infeccioso en cuestión. Además, se requiere una muestra que no contenga anticuerpos. En teoría, las muestras deberían representar tanto a los animales que se consideran infectados como a los no infectados dentro de la población que finalmente va a ser objeto de la prueba una vez que esta se haya validado. Por otra parte, las muestras deben haber dado los resultados esperados en uno o más ensayos serológicos distintos al que se está validando. Preferiblemente, las muestras deben proceder de animales individuales, aunque también pueden derivar de la acumulación de muestras de varios animales. Estas muestras pueden utilizarse en experimentos para determinar si la prueba es capaz de distinguir diferentes cantidades del componente analizado (el anticuerpo en nuestro caso) y para optimizar las concentraciones de reactivos y perfeccionar el protocolo. Una práctica que resulta adecuada consiste en preparar un gran volumen de cada muestra (por ejemplo, 10 ml o más, si es posible) y dividirlo en alícuotas de 0,1 ml para almacenamiento a 20 C o por debajo de esta temperatura. Luego, se descongela una alícuota de cada muestra, se utiliza para los experimentos y después, a ser posible, se desecha. Si resulta poco práctico descartar la alícuota, se puede mantener la misma a 4 C para experimentos sucesivos hasta unas de 2 semanas, aunque en estas circunstancias existe la posibilidad de que la muestra se deteriore. A continuación, se descongela otra alícuota para la experimentación posterior. Este método proporciona una misma fuente de suero con idéntico número de ciclos de congelación-descongelación para todos los experimentos (la congelación y descongelación repetida del suero puede desnaturalizar los anticuerpos, de modo que debería evitarse). Además, la variación se reduce cuando el investigador utiliza la misma fuente de suero para todos los experimentos en vez de cambiar de suero entre los distintos experimentos. Este enfoque tiene la ventaja añadida de generar una serie de datos válidos para muestras que se ensayan repetidamente. La repetición de aplicaciones utilizando estas muestras puede además proporcionar valoraciones preliminares de la repetitividad dentro de una aplicación y entre distintas aplicaciones de una prueba. Cuando se comparan con estándares internacionales para establecer su actividad (concentración o título), una o varias de estas pruebas pueden servir también como estándares secundarios; esos estándares proporcionan la seguridad de que la realización de los ensayos produce datos precisos (16). 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

5 Finalmente, estas combinaciones de sueros pueden utilizarse como controles en futuras realizaciones rutinarias de la prueba una vez que se hayan completado todos los pasos del proceso de validación. Es muy deseable incluir los sueros internacionales estandarizados de la OIE u otros sueros estandarizados (si puede disponerse de ellos) en un estadio inicial de la elaboración de la prueba. Su uso proporcionaría una adecuada armonización entre el ensayo en desarrollo y cualquier otro método normalizado que use normalmente sueros de tipo estándar internacional (15). b) Selección del método para lograr resultados normalizados La normalización ajusta los resultados directos de la prueba para todas las muestras con relación a los valores de los controles incluidos en cada desarrollo del ensayo (no confundir esto con una transformación de datos para lograr una distribución normal [de Gauss]). El método de normalización y expresión de los datos debería determinarse, preferiblemente, antes del final de los estudios de viabilidad. Las comparaciones de resultados día a día y entre laboratorios son más precisas cuando se usan datos normalizados. Por ejemplo, en los sistemas ELISA, los valores directos de densidad óptica (absorbancia) son medidas absolutas influenciadas por las temperaturas ambientales, los parámetros de comprobación y la instrumentación fotométrica. Para tener en cuenta esta variabilidad, los resultados se expresan en función de la reactividad de una o más muestras de suero control que se incluyen en cada desarrollo del ensayo. En el ELISA indirecto, la normalización de los datos se logra expresando los valores de absorbancia en una de las varias formas posibles (16). Un método simple y útil es expresar todos los valores de absorbancia como porcentaje de un único control de suero fuertemente positivo que se incluye en cada placa (muestra/positivo o ratio m/p) (Este control debe dar un resultado que se halle en el rango lineal de la medición). Este método resulta adecuado para la mayoría de las aplicaciones. El procedimiento de normalización puede resultar más riguroso si se calculan los resultados a partir de una curva estándar generada por varios controles de suero. Esto requiere un algoritmo más sofisticado, tal como un ajuste de regresión lineal o un análisis de tipo log-logit. Este método es más preciso porque no descansa solamente en una muestra control fuertemente positiva para la normalización de datos, sino que usa varios controles de suero, ajustados a valores esperables, para obtener una curva estándar desde la que puede extrapolarse el valor de la muestra. Este método también permite la exclusión de un valor control que puede caer fuera de los límites de confianza esperados. Para ensayos de punto final por titulación de la muestra, como la neutralización (vírica) del suero, cada ensayo realizado se acepta o se rechaza en función de si los valores control caen dentro de unos límites predeterminados. Ya que los valores de la muestra no se ajustan normalmente a un valor control, los datos no resultan normalizados en estricta definición del término. Sea cual sea el método usado para la normalización de los datos, es esencial incluir controles adicionales para cada reactivo que pueda introducir variabilidad y que pueda limitar, por tanto, los intentos de lograr un ensayo validado. Los valores normalizados para tales controles tienen que caer dentro de unos límites predeterminados (dentro de un múltiplo apropiado de la desviación estándar de la media de muchas aplicaciones de cada control). Los límites escogidos deberían reflejar una tasa tolerable de rechazo de aplicaciones del ensayo y un riesgo aceptable de que algunas muestras de prueba puedan estar mal clasificadas. B. VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARTE 1 1. Optimización y estandarización de los reactivos Utilizando diversos sueros bien definidos, los estándares propios esbozados en la sección A.2.a del presente capítulo o los estándares de referencia de procedencia exterior, las concentraciones/diluciones óptimas del antígeno en la placa, el suero, el conjugado enzima-anticuerpo y la solución de substrato se determinan mediante titulaciones de doble entrada de cada reactivo frente a todos los demás reactivos; a eso le seguirá la confirmación de la elección de los mejores recipientes para la reacción (evaluación de dos o tres tipos de placas de microtitulación, cada uno con sus diferentes características de unión, para minimizar la actividad de fondo mientras se consigue la máxima dispersión de la actividad entre las muestras negativas y las fuertemente positivas). En experimentos adicionales se determinarán las variables temporales, químicas y físicas óptimas del protocolo, incluidas la temperatura y la duración de la incubación; el tipo, ph, y molaridad del diluyente, y los tampones de lavado y bloqueo; también el equipo utilizado en cada paso de la prueba (por ejemplo, pipetas y lavadores que proporcionen la mejor reproducibilidad). La elección y caracterización de los reactivos debe abordarse de forma cuidadosa, o, de lo contrario podrán peligrar las condiciones de realización de la prueba. Por ejemplo, puede obtenerse un aumento de la especificidad de la prueba mediante una expresión recombinante del los antígenos o mediante el uso de Manual de la OIE sobre animales terrestres

6 anticuerpos monoclonales y policlonales para ensayos de captura del antígeno o de competición con anticuerpos. Otra alternativa es que el método de producción de reactivos puede dar lugar a una especificidad reducida y a un incremento de la variabilidad. Por ejemplo, si un antígeno vírico utilizado en el ensayo se deriva de un sistema de cultivo vírico, que a su vez se utiliza para producir vacunas víricas comúnmente utilizadas en la especie objeto de ensayo, puede producirse una reacción cruzada inespecífica. Es necesaria la absorción de los antígenos que producen reacción cruzada y que se hallan en la vacuna y el antígeno utilizados en la prueba, o será preciso ensayar un control de cultivo celular en cada muestra de suero en aplicaciones rutinarias de la prueba para identificar y explicar el alcance de la mencionada reacción cruzada. Es obvio que la anticipación de la influencia negativa o positiva de la elección de los reactivos en la prueba que se está elaborando/validando es una cuestión de suma importancia, y es precisa una experimentación cuidadosa para establecer un ensayo óptimo. Cuando un reactivo como una muestra de suero control está a punto de agotarse, resulta necesario preparar y probar repetidamente otro suero de repuesto antes de que el primero se agote. La nueva muestra de control se incluye en realizaciones del ensayo antes del agotamiento del control original para establecer su relación proporcional con el que se está acabando. Si la muestra en vías de desaparición era un control positivo por técnicas ELISA, donde el valor normalizado se expresa como porcentaje del control positivo, la diferencia proporcional de actividad en el ensayo ELISA entre el suero original y el de recambio debe ser convertido en un factor de normalización para mantener el mismo nivel de corte, y por tanto la misma sensibilidad y especificidad diagnóstica en el ensayo. Cuando hay que reemplazar otros reactivos, como el antígeno para captura de los anticuerpos, debería llevarse a cabo siguiendo los mismos criterios que con los reactivos originales y deberían probarse en al menos cinco realizaciones del ensayo utilizando una serie de muestras de suero diseñadas para tal fin. Hay que evaluar la consistencia de los lotes de reactivos a fin de minimizar la variabilidad durante el ensayo a medida que se necesiten nuevos lotes. Siempre que sea posible, es importante cambiar cada vez solamente un reactivo para evitar el problema de tener que evaluar simultáneamente mas de una variable. La variabilidad se minimiza cuando los reactivos están bien caracterizados mediante la utilización de métodos distintos al de la prueba diana. a) Rango operativo lineal de la prueba La mejor forma de determinar la gama de valores que constituye el rango operativo lineal de un ensayo es mediante una serie de diluciones en las que se diluye de forma seriada un suero fuertemente positivo con un suero negativo. Luego se coloca en tampón formando una dilución de trabajo óptima, y se representan gráficamente los resultados en forma de curva de dosis-respuesta. Esta curva, que a veces se conoce como curva de dosis-respuesta en aplicaciones farmacológicas, establece el rango lineal de los valores de la prueba que son válidos para su utilización en la prueba. b) Calibración frente a reactivos de referencia i) Estándares internacionales Los estándares de suero y otros reactivos, disponibles en la OIE, OMS, FAO, u otras organizaciones internacionales, pueden utilizarse para armonizar la prueba con los resultados esperados obtenidos con reactivos de referencia de actividad conocida. ii) Estándares internos Los sueros control internos (utilizados para la normalización de los datos) y los estándares de suero secundarios adicionales, como un positivo bajo, un positivo alto y los sueros negativos (utilizados para las estimaciones de repetitividad en ulteriores realizaciones rutinarias de la prueba) pueden ajustarse a la curva de respuesta a fin de lograr los valores esperados para los mencionados sueros. 2. Reproducibilidad La evidencia preliminar de la reproducibilidad (concordancia entre los duplicados dentro de un mismo ensayo y entre distintas realizaciones del ensayo) resulta necesaria para garantizar el posterior desarrollo del ensayo a validar. Esto se lleva a cabo evaluando los resultados de, como mínimo, tres de las cuatro muestras internas que representan la actividad dentro del rango lineal del ensayo. Se ensayan cuatro copias de esas muestras en al menos cuatro realizaciones del ensayo para determinar la variación (entre placas) dentro de una misma realización. Se analiza la variación entre diferentes realizaciones del mismo ensayo utilizando las mismas muestras en un mínimo de 20 realizaciones (en total), por dos o más operarios, preferiblemente en fechas diferentes. Todas las realizaciones deben llevarse a cabo de forma independiente. A efectos del informe correspondiente, en las técnicas ELISA, en esta fase de validación, se usan normalmente los valores básicos de absorbancia porque es dudoso que los resultados del suero control fuertemente positivo, que podrían usarse para calcular valores normalizados, sean reproducibles en las realizaciones iniciales del ensayo. Además, aún no se han determinado los correspondientes valores de los controles. Coeficientes de variación (CV: desviación estándar de las réplicas media de las mismas) inferiores al 20% en los valores de absorbancia de la mayoría de las muestras (muestras de baja titulación pueden tener CV mayores) indican una 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

7 reproducibilidad adecuada en esta fase de elaboración del ensayo. Sin embargo, si se pone de manifiesto una excesiva variación (mayor del 30%) en la mayor parte de las muestras en una misma o en diferentes realizaciones de la prueba, deberían hacerse más estudios preliminares para determinar si es posible estabilizar el ensayo o si se debería abandonar el tipo de prueba. Esto tiene una importancia especial ya que un ensayo intrínsecamente variable tiene una alta probabilidad de no resistir las exigencias de las pruebas diarias con muestras procedentes de la población animal a estudiar. Se puede obtener evidencia adicional de reproducibilidad mediante muchas realizaciones adicionales del ensayo que se necesitarán más tarde durante el proceso de validación para conseguir la validación plena del ensayo. Para ello se llevan a cabo réplicas de cada muestra control, de muestras estándar y de muestras de prueba cuando se realizan experimentos con el fin de obtener otros parámetros de validación (véase la sección C. Validación de ensayos parte 2, más adelante). Estos datos incrementarán la confianza en las estimaciones de reproducibilidad por basarse en resultados obtenidos en las aplicaciones individuales y en el conjunto de aplicaciones de un ensayo en las que se utilizan reactivos preparados día a día, incluidos los diferentes lotes de reactivos que pueden afectar a la reproducibilidad. 3. Determinación de la especificidad y sensibilidad analíticas La especificidad analítica de un ensayo es el grado en que el ensayo no muestra reacción cruzada con otras sustancias y la sensibilidad analítica de un ensayo es la cantidad más pequeña de la sustancia en cuestión que puede detectar, i.e., el nivel más bajo de detección del ensayo. La especificidad analítica se determina utilizando un conjunto de sueros procedentes de animales que han sido expuestos a microorganismos genéticamente relacionados que pueden estimular la formación de anticuerpos con reacción cruzada, o sueros de animales con manifestaciones clínicas similares. Este análisis de vecinos próximos es útil para determinar la probabilidad de reacciones con resultados positivos falsos en el ensayo. También es adecuada la documentación de un criterio de especificidad de grupo que incluya la detección de la sustancia de interés en sueros procedentes de animales que han experimentado infecciones/exposiciones a un grupo entero o a un serotipo de microoganismos de interés. También es importante evaluar la especificidad analítica del ensayo utilizando muestras de animales que estén vacunados. Si el ensayo pretende detectar el anticuerpo producido por el virus, la vacunación contra ese virus puede producir anticuerpos que interfieran con las predicciones del ensayo sobre la infección. Además, si el antígeno vírico utilizado en el ensayo se deriva de un preparado de cultivo vírico con células completas, que contenga reactivos antigénicos (proteínas portadoras, etc.) además del virus, un animal vacunado puede dar un resultado positivo falso debido a la detección de anticuerpos no víricos. La sensibilidad analítica de un ensayo puede evaluarse mediante la cuantificación de la cantidad más pequeña de la sustancia que es detectable en la muestra. Esto puede conseguirse limitando las diluciones de un estándar de concentración conocida de la sustancia a analizar. No obstante, a menudo resulta imposible obtener una medición absoluta y objetiva debido a la carencia de muestras o estándares de concentración o actividad conocidas. Otro enfoque es el análisis, con diluciones a punto final, de muestras de animales positivos conocidos, a fin de definir la penúltima dilución de la muestra en la que ya no es detectable la sustancia, o, por lo menos, no es diferenciable de la actividad de los sueros negativos. Cuando se comparan los resultados del ensayo que se está elaborando con las realizaciones de otro u otros ensayos en los que se utilizan las mismas muestras, puede estimarse una cantidad relativa de sensibilidad analítica. Además de los estándares de la sustancia a analizar o de las muestras cuyos títulos han sido establecidos por otros ensayos, es posible crear muestras introduciendo en una matriz de muestra negativa cantidades conocidas de la sustancia en cuestión. No obstante, en ese caso, las muestras ajustadas pueden ser intrínsecamente diferentes de las muestras obtenidas de casos clínicos, pudiendo inducir a conclusiones imprecisas. Si el objetivo del ensayo es el examen de los animales para detectar la actividad de anticuerpos, la sensibilidad analítica deberá ser alta para conseguir la máxima probabilidad posible de detección de animales infectados. Si no se puede obtener una sensibilidad analítica elevada, el ensayo puede resultar inadecuado como prueba de criba. Alternativamente si el objetivo del ensayo es la confirmación de otro procedimiento diagnóstico independiente, se requiere una especificidad analítica que reduzca al mínimo la cantidad de reacción cruzada. Si no se consigue ninguno de esos objetivos, se necesitará recalibrar o sustituir los reactivos o se deberá abandonar el ensayo Manual de la OIE sobre animales terrestres

8 C. VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARTE 2 1. Determinación de las características de realización de un ensayo tras la determinación del método estándar de ensayo y los criterios para los reactivos Los valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica constituyen los parámetros más importantes que se establecen durante la validación de un ensayo. Dichos valores deben establecerse tras el ensayo y se optimizarán y estandarizarán los reactivos; la alteración de los protocolos o los reactivos puede requerir una revisión de las características de realización. Constituyen la base para el cálculo de otros parámetros a partir de los cuales se realizan deducciones sobre los resultados. Por consiguiente, es muy importante que las estimaciones sobre la sensibilidad y la especificidad diagnóstica sean tan exactas como sea posible. En teoría, estos valores derivan del ensayo de una serie de muestras procedentes de animales de referencia cuya historia es conocida, así como su estado de infección/enfermedad, y que son además animales representativos de la región o país donde se pretende usar la prueba, pero tal cosa no siempre es posible. Debe elegirse un diseño de prueba que permita estimar las características de realización diagnóstica. No obstante, se trata de un proceso complicado por causa de limitaciones de tipo logístico y financiero. También está limitado por el hecho de que puede carecerse de poblaciones y estándares de referencia. A continuación ofrecemos algunos ejemplos de poblaciones y métodos de referencia que pueden utilizarse para establecer las características de realización de la prueba a validar. a) Poblaciones de animales de referencia i) Animales de referencia infectados o expuestos y animales no infectados o no expuestos La selección de animales de referencia para evaluar las características de realización exige que las variables atribuibles a la población estudiada estén representadas en las poblaciones de animales infectados/expuestos y no infectados/no expuestos. Entre las variables que se deben considerar, se encuentran la especie, edad, sexo, raza, estado nutritivo, preñez, fase de la infección, estado inmunológico incluyendo el historial de vacunaciones, datos epidemiológicos y/o clínicos que incluyan el historial de enfermedades de la manada. ii) Estado de los animales de referencia determinado por otros ensayos En serología, el estándar de comparación es el resultado de un método o combinación de métodos con el que se compara el nuevo ensayo. Aunque se usa normalmente el término estándar de referencia para describir cualquier estándar de comparación, debería limitarse el término a métodos que clasifiquen los animales como infectados o no infectados de modo inequívoco. Algunos métodos de aislamiento tienen problemas propios de reproducibilidad y sensibilidad. Los métodos con estándar de referencia incluyen el aislamiento inequívoco del agente causal o criterios histopatológicos patognomónicos. Como es posible que se carezca de un estándar de referencia o que sea imposible obtenerlo, a menudo se necesitan estándares relativos de comparación; los más comunes incluyen resultados de otros ensayos serológicos. Los cálculos de la sensibilidad y la especificidad diagnósticas son más fiables cuando se basan en un estándar de referencia para la comparación. Cuando sólo se dispone de estándares relativos de comparación, las estimaciones de estos parámetros en el nuevo ensayo pueden verse afectadas debido al error previo de estos valores en el estándar relativo, que se acumula en el nuevo ensayo. Cuando se utilizan pruebas de referencia imperfectas sin esforzarse en controlar posibles sesgos, las estimaciones de realización de la sensibilidad y especificidad diagnósticas pueden estar contaminadas y ser, por tanto, inaceptables iii) Animales de referencia infectados o vacunados experimentalmente Para validar un nuevo ensayo, se han utilizado sueros obtenidos de forma secuencial de animales infectados o vacunados experimentalmente. Esas observaciones repetidas, pre- y postseroconversión, de los mismos animales no son aceptables para hacer estimaciones de la sensibilidad y especificidad diagnósticas porque se viola la exigencia estadística de observaciones independientes. Por tanto, se necesita un muestreo puntual de animales individuales de experimentación. Además, la exposición a microorganismos en condiciones experimentales o la vacunación pueden provocar respuestas de anticuerpos que no son típicos de la infección natural en las poblaciones estudiadas ni desde el punto de vista cuantitativo ni del cualitativo (9). La variedad de organismo, la dosis, y la ruta de administración a los animales experimentales son ejemplos de variables que pueden inducir a error cuando se extrapolan las estimaciones de sensibilidad y especificidad diagnósticas a la población estudiada. Por tales razones, la validación de un ensayo no debería basarse sólo en los animales experimentales. iv) Animales de referencia Estado desconocido Cuando es imposible reunir sueros de animales de estado infeccioso conocido, es posible estimar la sensibilidad y especificidad diagnósticas mediante métodos que no son de referencia o modelos de 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

9 clase latente (3, 7). Puesto que estos modelos estadísticos son complejos, debería consultarse a un experto que preste la ayuda adecuada para realizar y describir el muestreo de la población o poblaciones diana, las características de otras pruebas incluidas en el análisis, la elección adecuada del modelo y los métodos de estimación basados en la literatura revisada por pares. 2. Determinación del umbral Para llevar a cabo valoraciones de la sensibilidad y especificidad diagnósticas, primero deben categorizarse los resultados de las pruebas como positivos o negativos. Esto implica considerar un punto de corte (umbral o límite de decisión) en la escala continua de resultados de la prueba. Aunque se han descrito muchos métodos a este respecto, los tres ejemplos que siguen a continuación ilustrarán los diferentes enfoques, junto a sus ventajas y limitaciones. El primer método establece un corte basado en la distribución de frecuencias de los resultados con animales de referencia infectados y no infectados (9). Este corte se puede establecer por inspección visual de la distribución de frecuencias, por análisis de las características de tipo receptor-operador (6, 17), o por una selección que favorezca la sensibilidad o la especificidad, dependiendo del uso que se pretenda dar a un ensayo concreto (11). Un segundo enfoque consiste en establecer el corte basado sólo en animales de referencia no infectados; por ejemplo, el percentil 99 en una distribución de frecuencias de los valores de la prueba para los animales no infectados; esto proporciona una estimación de la sensibilidad diagnóstica pero no de la especificidad diagnóstica. El tercer método proporciona un corte intrínseco basado en resultados de sueros tomados al azar dentro de la población estudiada sin conocerse de antemano el estado de infección de los animales (4). Si existe una superposición considerable en las distribuciones de los valores de las pruebas con animales infectados y no infectados, resulta difícil seleccionar un punto de corte que permita clasificar adecuadamente a estos animales con relación a su estado infeccioso. Entonces, en lugar de un único corte, se pueden seleccionar dos cortes que definan una sensibilidad diagnóstica elevada (por ejemplo, con la inclusión del 99% de los valores de animales infectados) y una especificidad elevada (con el 99% de los valores de los animales no infectados). Los valores que se encuentren entre estos percentiles deberían clasificarse como sospechosos o equívocos, y podrían requerir una prueba de ensayo confirmativo u otra prueba para detectar la existencia de seroconversión. La selección del punto de corte refleja de forma típica el objetivo de la prueba perseguido. Por ejemplo, un ensayo criba diseñado para una sensibilidad alta frente a un ensayo confirmativo diseñado para una especificidad alta necesitará diferentes puntos de corte en el mismo sistema de ensayos. Aunque el objetivo perseguido determinará el punto de corte, aún es de desear un análisis de las características de tipo receptor-operador, ya que este mostrará la realización potencial del ensayo en otros ámbitos epidemiológicos. 3. Estimaciones de la realización del ensayo a) Número de animales de referencia necesarios Para establecer la sensibilidad y la especificidad diagnósticas, tanto el número como el origen de los animales de referencia y los métodos utilizados para determinar la sensibilidad y especificidad analíticas son aspectos clave cuando se intenta una validación adecuada del ensayo para su uso con la población de animales a la que va dirigido. Resulta posible calcular el número de muestras de referencia, derivadas de animales cuyo estado relativo a la infección es conocido, que es necesario para determinar la sensibilidad y la especificidad diagnóstica dentro de ciertos límites estadísticos definidos. Las fórmulas y cuadros para determinar el número de muestras requeridas se presentan en otra parte (5,9). En el cuadro 1 de la página 474 de la referencia nº 9 se muestra cómo el número de muestras ensayadas afecta a los niveles de confianza en el cálculo de las estimaciones de la sensibilidad y especificidad del ensayo. Por ejemplo, una sensibilidad o especificidad analíticas del 92% con un nivel de confianza de 75% en esa estimación requiere 161 animales positivos a la sustancia analizada (que se sabe que están infectados) procedentes de la población estudiada por el ensayo (con un margen de error de ± 2%). No obstante, para aumentar la confianza en la estimación hasta el nivel del 95%, es preciso ensayar 542 muestras/animales. El número de muestras que en teoría se necesita para obtener niveles de confianza de entre 75% y 99% pueden consultarse en ese cuadro para ensayos para los que se prevea una sensibilidad y especificidad diagnósticas de entre 80% y 99%. b) Estimaciones de la sensibilidad y especificidad diagnósticas basadas en animales de referencia con un estado de infección conocido La selección de cortes o umbrales permite clasificar los resultados de un ensayo como positivos o negativos. La determinación de la sensibilidad y la especificidad se facilita asociando los datos positivos y negativos con el estado conocido de la infección de cada animal mediante un cuadro de dos por dos (cuadro 1). Una vez establecido el corte, los resultados de las pruebas de los sueros estándares se pueden clasificar como verdaderos positivos (VP) o verdaderos negativos (VN) si están de acuerdo con los estándares de referencia (u otros estándares de comparación). Alternativamente, se pueden clasificar como Manual de la OIE sobre animales terrestres

10 falsos positivos (FP) o falsos negativos (FN) si no concuerdan con el estándar. La sensibilidad diagnóstica se calcula como VP/(VP+FN), mientras que la especificidad diagnóstica se expresa como VN/(VN+FP); los resultados de ambas determinaciones se suelen indicar como porcentajes (cuadro 1). Cuadro 1. Cálculo de la sensibilidad y especificidad diagnósticas utilizando un cuadro de 2 2 en el que se combina el estado infeccioso con los resultados de una prueba en la que se utilizaron animales de referencia Animales de referencia con un estado infeccioso conocido Infectados (n = 600) No infectados (n = 1.400) Positivo Resultados de la prueba VP FN FP VN Negativo Sensibilidad diagnóstica Especificidad diagnóstica VP VP FN % VN VN FP % c) Estimaciones de la sensibilidad y especificidad diagnósticas basadas en animales con un estado infeccioso no definido Se puede estimar la sensibilidad y especificidad diagnósticas cuando el estado de los animales con respecto a la infección o a la sustancia analizada no está definido; no obstante, estos modelos estadísticos de clase latente son complejos. Debería buscarse asesoramiento experto no sólo para el diseño del estudio de evaluación sino también para la interpretación de las estimaciones de la sensibilidad y especificidad diagnósticas. Se le ha recomendado a la OIE que forme un grupo de expertos que se encargue de la aplicación de modelos de clase latente y que redacte las directrices para dicha aplicación en los ensayos de validación y certificación de la OIE. 4. Comparación y armonización de los ensayos Normalmente, se elaboran nuevos ensayos para mejorar las técnicas existentes. Para demostrar que un nuevo ensayo supone una mejora de una técnica ya existente, debe existir alguna forma de comparación que demuestre esa mejora. La comparación puede estar relacionada con las características de realización analítica y/o diagnóstica. También puede estar relacionada con características de tipo operativo como el coste, la robustez, el tiempo para la obtención de resultados, el rendimiento, etc. Si el nuevo ensayo se va a integrar en un régimen de diagnóstico que incluye otros métodos de prueba, debería establecerse la razón de ser de su utilización, la interpretación de los datos y la toma de decisiones. Cuando para la determinación de un componente existe ya un método estándar internacional (15), es posible comparar dicho método con el que se está elaborando. Este proceso requiere el uso de los mismos controles de suero y/o estándares en ambos ensayos. Si se dispone de sueros estandarizados de la OIE o de otros sueros estándar internacionales, se deberían incluir al menos tres de ellos (uno negativo, otro con una positividad baja, y otro con positividad alta) en el estudio comparativo de los ensayos. Esto podría conducir a un nuevo ensayo que aparezca indexado a un método estándar internacional y a sueros estándar internacionales (15). Entonces sería posible la armonización de los dos ensayos. Es de suma importancia el control adecuado de todas las muestras, los reactivos de la prueba y el protocolo o las instrucciones para realizar el ensayo. Si los reactivos no provienen de un mismo proveedor, los laboratorios deben producir y caracterizar los reactivos de forma independiente. Eso permitirá determinar la adecuación del protocolo para la producción y caracterización del reactivo. Con ello se obtienen los datos necesarios para determinar si es preciso establecer una única fuente compartida de reactivos bien caracterizados. Parte de la evaluación consiste en determinar que el protocolo o las instrucciones son completas, claras y precisas. Si se necesitan instrucciones verbales, quien elabora la prueba debe contemplar la revisión del protocolo para asegurarse de que aquellas son comprensibles. Si se determina que el protocolo o las instrucciones se interpretaron de forma equivocada, deben re-escribirse y quizás haya que restablecer la reproducibilidad utilizando el protocolo o las instrucciones revisadas. 10 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11 D. VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARTE 3 1. Determinación de la reproducibilidad y aumento de las estimaciones de repetitibilidad del ensayo Debe evaluarse la reproducibilidad de cualquier ensayo que se vaya a distribuir a muchos laboratorios (como un kit comercial), la cual se define como la capacidad de un método de prueba para proporcionar resultados consistentes cuando aquél se aplica a alícuotas de las mismas muestras que se ensayan en laboratorios diferentes. Eso se consigue ensayando un conjunto de sueros en por lo menos tres laboratorios utilizando el mismo método de prueba y los mismos conjuntos de sueros. Para ese fin, se reúne un conjunto de prueba que conste de al menos 20 muestras. Lo ideal es que se trate de muestras individuales obtenidas de animales de la población estudiada, que representen el rango de actividad de la prueba previsto para esa población. Si no se dispone de esas muestras, se acepta, aunque no sea lo mejor, una dilución de un suero de positividad alta con un suero negativo para lograr el rango de actividad. Se necesitan réplicas de aproximadamente el 20% de las muestras para comprobar la repetitividad en cada uno de los laboratorios participantes. Cada muestra se divide en alícuotas, dando lugar a una serie de conjuntos idénticos para su distribución a otros laboratorios. Se codifica la identidad de la muestra para un ensayo ciego y cada conjunto se manipula y transporta a los laboratorios participantes de forma idéntica. La estadística descriptiva de los datos de los paneles de prueba procedentes de los laboratorios incluye la media entre laboratorios, la desviación típica y el rango de resultados para cada muestra y para los controles. La evaluación de la precisión y exactitud en cada laboratorio se obtiene mediante gráficas de Youden. Los datos servirán para justificar la legitimidad de los límites de control altos y bajos del ensayo tal como lo determinó el autor de su elaboración. Además, cuando se ensaya un conjunto de muestras en cada laboratorio, es aconsejable usar cada muestra por duplicado o triplicado. Eso proporciona una buena base para el análisis expandido de la repetitividad en cada uno de los laboratorios que aplican el ensayo. Además, cuando se empieza a utilizar el ensayo de forma rutinaria, la repetitividad también se monitoriza mediante la inclusión de, por lo menos, duplicados para los controles y, preferentemente, también para cada muestra 1. Implementación del programa E. VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARTE 4 La prueba decisiva de la utilidad de un ensayo consiste en la aplicación o aplicaciones eficaces del mismo). Estas incluyen los programas internacionales, regionales o nacionales. A medida que se elaboran y se dan a conocer mejores ensayos, estos terminarán por sustituir a los ya existentes si se demuestra que los primeros son más aptos para el fin perseguido. No obstante, eso sólo ocurrirá si se utilizan de forma rutinaria y se documenta su utilidad con a medida que transcurre el tiempo. En la progresión natural de la mejora del diagnóstico y/ los medios tecnológicos, algunos ensayos nuevos se convertirán en los nuevos estándares para la comparación. Como tales, poco a poco obtendrán el reconocimiento nacional, regional e internacional. Como estándares reconocidos, estos ensayos comenzarán a utilizarse para elaborar reactivos de referencia para el control de calidad, eficiencia y armonización. Esos reactivos de referencia también pueden convertirse en estándares internacionales. El último nivel de validación en el Registro de la OIE exige la documentación relacionada con la aplicación y los niveles de reconocimiento del ensayo en cuestión. Con lo anterior se pretende proporcionar a los usuarios potenciales una fuente de información imparcial y fiable. 2. Monitorización de la validez de la realización de un ensayo a) Interpretación de los resultados de un ensayo factores que afectan a la validez de un ensayo Los resultados de un ensayo sólo son útiles si las deducciones que permiten alcanzar son correctas. Un error muy común consiste en suponer que un ensayo con un 99% de sensibilidad y un 99% de especificidad originará aproximadamente un solo positivo falso y un negativo falso en los resultados de cada 100 ensayos con animales de una determinada población. Tal ensayo puede ser preciso y exacto, pero puede, sin embargo, producir resultados que no permitan predecir adecuadamente el estado de infección. Por ejemplo, si la prevalencia de una enfermedad en una población analizada por el ensayo es solo de 1 entre animales, y la tasa de positivos falsos en la prueba es de 1 por cada 100 animales (especificidad diagnóstica 99%), entonces en cada pruebas sobre esa población habrá 10 positivos falsos y sólo uno será positivo verdadero. Por tanto, tan sólo aproximadamente el 9% de los resultados positivos de la prueba Manual de la OIE sobre animales terrestres

12 permitirá predecir de manera exacta el estado del animal en cuanto a infección; los resultados de la prueba clasificarán erróneamente al animal el 91% de las veces. Esta situación ejemplifica que la capacidad de un resultado positivo o negativo de una prueba para definir el estado de infección depende de la prevalencia de la infección en la población estudiada (10). Por supuesto, la prevalencia probablemente se habrá determinado a su vez mediante el uso de una prueba serológica con el error de clasificación de resultados que la misma conlleva. La determinación de la prevalencia en la población resulta necesaria para calcular los valores predicativos positivos (VPr+) o negativos (VPr-) del ensayo. Cuando los valores de la prueba se indican sin disponer de datos acerca de la especificidad o de la sensibilidad, no es posible inferir predicciones sobre el estado infeccioso a partir de los resultados (9). Por consiguiente, es muy conveniente disponer de una especie de interpretación adicional, acompañando los resultados con un pequeño cuadro que indique VPr+ y VPr- en un intervalo de prevalencias posibles en la población. Sin dicha información, es posible que los resultados de los ensayos de la prueba no permitan clasificar con exactitud el estado de infección de los animales y, por tanto, no reflejarán un ensayo completamente validado. b) Mantenimiento de los criterios de validación Un ensayo validado necesita un constante seguimiento y un mantenimiento para conservar tal designación. Una vez que el ensayo se empieza a utilizar de forma rutinaria, hay que realizar un control interno de calidad comprobando repetidamente el ensayo en cuanto a repetitividad y exactitud (1). La reproducibilidad entre laboratorios debería comprobarse al menos dos veces por año. Es deseable formar parte de un consorcio de laboratorios interesados en evaluar los resultados. En un futuro próximo, una buena práctica de laboratorio que incluya la aplicación de un programa para asegurar la calidad total será un requisito esencial para aquellos que intenten un reconocimiento nacional o internacional (véase el capítulo Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias. El examen de aptitud es una forma de control externo de calidad para una determinada prueba. Normalmente se lleva a cabo por un laboratorio de referencia que distribuye lotes de muestras, recibe resultados de los laboratorios, analiza los datos, y devuelve los informes a los laboratorios implicados. Si los resultados de un determinado laboratorio están dentro de límites aceptables y muestran evidencias de exactitud y reproducibilidad, el laboratorio puede disponer de un certificado emitido por agencias gubernamentales o laboratorios de referencia que lo acreditan como laboratorio oficial para dicha prueba (13). Las muestras de suero para el examen de aptitud deberían contener una representación completa de la concentración de la sustancia a analizar en los animales de una población bajo estudio. Si las muestras representaran sólo sueros fuertemente positivos o débilmente positivos (con ninguna muestra próxima al nivel de corte del ensayo), el ejercicio sólo pondría en evidencia la reproducibilidad en los extremos de concentración de la sustancia analizada, pero no aclararía si los resultados de pruebas rutinarias en la población permiten clasificar de modo conveniente el estado de infección de los animales. c) Mejora y extensión de los criterios de validación Debido al extraordinario número de variables que inciden en la realización de las pruebas de serodiagnóstico, es conveniente ampliar el número de sueros estándar correspondientes a animales con infección reconocida debido a que la confianza en las estimaciones de sensibilidad y especificidad mejora cuando aumenta el tamaño de las muestras. Además, cuando se pretende aplicar el ensayo a una región geográfica completamente distinta, es esencial efectuar una nueva validación del ensayo para el nuevo uso, ajustándolo a sueros de poblaciones de animales adaptados a las condiciones locales. Lo mismo cabe decir a la hora de establecer la sensibilidad y especificidad diagnósticas para subpoblaciones (ej., grupos de edad, vacunado/no vacunado, etc.). REFERENCIAS 1. CEMBROWSKI G.S. & SULLIVAN A.M. (1992). Quality control and statistics. In: An Introduction to Clinical Chemistry, Bishop M.L., Duben-Engelkirk J.L. & Fody E.P., eds. Lippincott, Philadelphia, USA, CROWTHER J.R. (1995). ELISA theory and practice. In: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, USA, ENOE C., GEORGIADIS M.P. & JOHNSON W.O. (2000). Estimating the sensitivity and specificity of diagnostic tests and disease prevalence when the true disease state is unknown. Prev. Vet. Med., 45, Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

13 4. GREINER M., FRANKE C.R., BOHNING D. & SCHLATTMANN P. (1994). Construction of an intrinsic cut-off value for the sero-epidemiological study of Trypanosoma evansi infections in a canine population in Brazil: a new approach towards unbiased estimation of prevalence. Acta Trop., 56, GREINER M. & GARDNER I. (2000). Epidemiologic issues in the validation of veterinary diagnostic tests. Vet. Prev. Med., 45, GREINER M., PFEIFFER D. & SMITH R.D. (2000). Principles and practical application of the receiver operating characteristic (ROC) analysis for diagnostic tests. Vet. Prev. Med., 45, HUI S.L. & WALTER S.D. (1980). Estimating the error rates of diagnostic tests. Biometrics, 36, INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION/INTERNATIONAL ELECTROTECHNICAL COMMISSION (ISO/IEC) (2005). ISO/IEC 17025:2005, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. 9. JACOBSON R.H. (1998). Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, JACOBSON R.H. (1991). How well do serodiagnostic tests predict the infection of disease status of cats. J. Am. Vet. Med. Assoc., 199, SMITH R.D. (1991). Clinical Veterinary Epidemiology. Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, USA, WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (1996). Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. In: OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Third Edition. OIE, Paris, France, WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2002). OIE Standard for Management and Technical Requirements for Laboratories Conducting Tests for Infectious Animal Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, WRIGHT P.F. (1998). International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardization and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, ZWEIG M.H. & CAMPBELL G. (1993). Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin. Chem., 39, * * * Manual de la OIE sobre animales terrestres