PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

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1 PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE UN DESINFECTANTE DE ALTO NIVEL, A BASE DE PEROXIDO DE HIDROGENO, EMPLEADO EN LA ESTERILIZACIÓN DE DISPOSITIVOS E INSTRUMENTOS HOSPITALARIOS MEDINA CÓRDOBA LUZ KARIME VALENCIA MOSQUERA LIGIA LUCIA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL Bogotá D.C. 21 de Julio de 2008

2 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

3 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE UN DESINFECTANTE DE ALTO NIVEL, A BASE DE PEROXIDO DE HIDROGENO, EMPLEADO EN LA ESTERILIZACIÓN DE DISPOSITIVOS E INSTRUMENTOS HOSPITALARIOS MEDINA CORDOBA LUZ KARIME VALENCIA MOSQUERA LIGIA LUCIA APROBADO Gretty Paola Tarazona Bacterióloga Directora Janeth Arias Palácios Bacterióloga M.C Codirectora Miguel Pinzon Bello Asesor Estadístico Zulma Valbuena Bacterióloga Jurado Cindy Fernández Microbiología Industrial Jurado

4 EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE UN DESINFECTANTE DE ALTO NIVEL, A BASE DE PEROXIDO DE HIDROGENO, EMPLEADO EN LA ESTERILIZACIÓN DE DISPOSITIVOS E INSTRUMENTOS HOSPITALARIO MEDINA CORDOBA LUZ KARIME VALENCIA MOSQUERA LIGIA LUCIA APROBADO Dra. INGRID SCHULER P.h D. Decana Académica JANETH ARIAS PALACIOS MSc. Directora de Carrera

5 AGRADECIMIENTOS A Dios gracias por darnos la vida y otorgarnos el conocimiento, la fortaleza, y salud e iluminarnos en el camino para alcanzar nuestras metas. Dedicamos este proyecto a nuestros padres y familiares los cuales nos ayudaron con su apoyo y amor incondicional, por que gracias a ustedes logramos alcanzar nuestros conocimientos y estar mas cerca las metas profesionales. A la Dra. Janeth Arias Palacios nuestras codirectora del proyecto por su conocimiento, apoyo y confianza que siempre nos brindo. A la Dra. Gretty Paola Tarazona nuestras directora por su colaboración durante el transcurso de toda la investigación. A la Dra. Alba Alicia Trespalacios por felicitarnos el espacio para llevar a cabo nuestra investigación. A la Pontificia Universidad Javeriana nuestra institución por facilitarnos los materiales y medios necesarios para alcanzar nuestra metas. A todas las personas que siempre estuvieron apoyándonos A todos ellos muchas gracias

6 TABLA DE CONTENIDO Paginas 1. INTRODUCCIÓN 9 2. MARCO TERORICO DESINFECCIÓN DEFINICIONES DESINFECTANTES Generalidades Características de un buen desinfectantes Factores que influyen en la eficacia de los desinfectantes Mecanismos de acción de los desinfectantes Resistencia de los microorganismos a los desinfectantes Clasificación de los desinfectantes según su mecanismo de acción Agentes que dañan la membrana célula Agentes que desnaturalizan proteínas Agentes que modifican grupos funcionales Clasificación de los desinfectantes según su actividad Clasificación de los desinfectantes según el método de desinfección AGENTES FÍSICOS DESINFECTANTES AGENTES QUÍMICOS DESINFECTANTES Productos reductores: Aldehidos Formaldehído Glutaraldehido Agentes oxidantes Ácido peracético Ozono Peróxido de Hidrogeno Mecanismo de acción Espectro de actividad Aplicaciones Fenoles y derivados Alcoholes Halógenos Compuestos Yodados Compuestos que liberan cloro 37 6

7 Biguanidas Agentes ácidos desinfectantes Ácidos orgánicos Compuestos de amonio cuaternario Agentes desinfectantes tensioactivos anfotericos Detergentes desinfectantes Desinfectante de alto nivel de STERIS TIPOS DE MICROORGANISMOS Factores que influyen en el crecimiento de los microorganismos Microorganismos Evaluádos Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella choleraesuis Bacillus subtilis LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DEL MATERIAL HOSPITALARIO Normas generales Clasificación de los materiales según el riesgo de infección Material crítico o de alto riesgo Material semicrìtico o de riesgo intermedio Material no crítico o de bajo riesgo METODOS DE EVALUACIÓN DE LOS DESINFECTANTES Método del coeficiente fenolico Técnica de dilución en tubo Técnica de la placa de agar 6. JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS General Específicos HIPOTESIS DE ESTUDIO MATERIALES Y METODOS Materiales Diseño de la Investigación Variables del estudio Análisis de la Información Métodos y Procedimientos Preparación del Inoculo Preparación de las concentraciones del desinfectante Evaluación del desinfectante Lectura e interpretación 62 7

8 10. Resultados Análisis de la Información Análisis estadístico de los resultados Discusión de resultados Conclusiones Recomendaciones Cronograma de trabajo Presupuesto Bibliografía ANEXOS 8

9 INDICE DE TABLAS Paginas Tabla N 1. Definición de términos 12 Tabla N 2. Agentes químicos desinfectantes y Antisépticos 15 Tabla N 3. Mecanismos de Acción de Antisépticos y Desinfectantes 19 Tabla N 4. Efectividad de Desinfectantes Químicos 42 Tabla N 5. Niveles de desinfección o esterilización 50 Tabla Nº 6. Materiales de laboratorio 56 Tabla N 7. Equipos de Laboratorio 56 Tabla N 8. Reactivos y medios de cultivos 57 Tabla Nº 9. Patrón de Mc Farland 60 Tabla N 10. Preparación de las concentraciones del desinfectante 61 Tabla N 11. Porcentaje de Inhibición para Staphylococcus aureus 63 Tabla N 12. Porcentaje de Inhibición para Pseudomonas aeruginosa 65 Tabla N 13. Porcentaje de Inhibición para Salmonella choleraesuis 66 Tabla N 14. Porcentaje de Inhibición para Bacillus subtillis 67 Tabla N 15. Comportamiento de las cepas con la concentración de 0.02% 68 Tabla N 16. Comportamiento de las cepas con la concentración de 0.04% 68 Tabla N 17. Comportamiento de las cepas con la concentración de 0.08% 69 Tabla N 18. Comportamiento de las cepas con la concentración de 1% 69 Tabla N 19. Comportamiento de las cepas con la concentración de 2% INDICE DE FIGURAS Figura 1. Comportamiento del desinfectante ante Staphylococcus aureus 64 Figura 2. Comportamiento del desinfectante ante Pseudomonas aeruginosa 65 Figura 3. Comportamiento del desinfectante ante Salmonella choleraesuis 66 Figura 4. Comportamiento del desinfectante ante Bacillus subtillis 67 9

10 RESUMEN En el presente estudio se evaluó el desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno, empleado en la desinfección de equipos e instrumentos hospitalarios. El método utilizado para evaluar la eficacia del desinfectante, fue la técnica de placa en agar mediante la siembra en estría, por medio de este procedimiento se logró determinar el porcentaje de inhibición del desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno, frente 4 microorganismos con propiedades y características diferentes: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (Beta-Hemolitico CMDM 227), Salmonella choleraesuis (Kuznedorf CMDM 074) y Bacillus subtilis (ATCC 6633). Se determino la eficacia de cinco concentraciones del desinfectante (0.02%, 0.04%, 0.08%, 1% y 2%) y se valoraron en tres tiempos diferentes 5, 10 y 15 minutos, para cepas vegetativas y 3, 6 y 9 horas para la cepa esporulada. Según el ensayo experimental, la reducción de la población microbiana en promedio fue del 100% para las concentraciones de 0.08%, 1% y 2%. De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio se demostró que el desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno es efectivo en un 100% cuando se emplea la concentración recomendada por la casa comercial (2%) en el menor tiempo de exposición al desinfectante. La mínima concentración de efectividad del desinfectante ensayado fue de 0.08%, sin embargo, si emplean concentraciones menores no se garantiza la destrucción total de los microorganismos. 10

11 1. INTRODUCIÓN La limpieza y desinfección son las herramientas para controlar los factores relacionados con el medio ambiente hospitalario. Los objetos, equipos, instrumentos médicos y quirúrgicos utilizados para el cuidado del paciente pueden comportarse como vehículos de transmisión de agentes infecciosos a huéspedes susceptibles. Estos objetos primero deben limpiarse cuidadosamente y posteriormente desinfectarse o esterilizarse para prevenir la contaminación cruzada y una posible transmisión de microorganismos. Una adecuada política de desinfección y esterilización, junto con el lavado de manos y las precauciones de barrera, son las medidas más eficaces para prevenir la infección hospitalaria. Un aspecto importante del control de las infecciones son los principios que rigen la limpieza, desinfección y esterilización. Evitar la transmisión de microorganismos potencialmente patógenos, ya sea entre enfermos, del personal sanitario a aquéllos o a la inversa, debe considerarse como una prioridad en todos los centros sanitarios. Es necesario diferenciar claramente, según el uso a que esté destinado el mismo, el material que necesita una esterilización del que necesita una desinfección o simplemente una limpieza adecuada. La limpieza es obligada en cualquier caso, pudiendo después optar por una esterilización o por una desinfección de mayor o menor nivel. Es cierto que en el hospital la creación de fuentes nuevas de infección es permanente y que la propagación de la contaminación es igualmente continua, en consecuencia, la aplicación de las medidas higiénicas debe ser también metódica, programada y continua (diaria); por tal motivo la limpieza y la desinfección, constituyen, junto con la esterilización, los elementos primarios y más eficaces para romper la cadena epidemiológica de la infección. Teniendo en cuenta que La infección hospitalaria constituye un tema de extraordinaria actualidad por su frecuencia, gravedad y repercusión económica. El objetivo de este estudio es evaluar la eficacia del desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno. El cual es empleado en la desinfección de equipos, dispositivos e instrumentos críticos y semicríticos hospitalarios, teniendo como referencia 6 microorganismos contaminantes. En el presente trabajo se evaluó el desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno, empleado en la desinfección de equipos e instrumentos hospitalarios. El método de evolución de la eficacia del desinfectante fue la técnica de placa en agar mediante la siembra en estría, en el cual se logró, el porcentaje de inhibición del desinfectante de alto nivel de STERIS a base de peróxido de hidrogeno, frente 4 microorganismos con propiedades y características diferentes: Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (Beta-Hemolitico CMDM 227), Salmonella choleraesuis (Kuznedorf 11

12 CMDM 074) y Bacillus subtilis (ATCC 6633). Se determino la eficacia de cinco concentraciones del desinfectante (0.02%, 0.04%, 0.08%, 1% y 2%) y se valoraron en tres tiempos diferentes 5, 10 y 15 minutos. Según el ensayo experimental el desinfectante, es efectivo contra los microorganismos estudiados a la concentración recomendada por la casa comercial y a un menor tiempo. 12

13 2. MARCO TEORICO 2.1. DESINFECCION La desinfección se puede definir como el acto de eliminar todos los microorganismos sobre objetos inanimados, pero no necesariamente toda forma de vida microbiana, por ejemplo, las esporas bacterianas y los hongos. La desinfección no tiene el margen de seguridad que proporciona la esterilización, además de que la desinfección es afectada por muchos factores, cada uno de los cuales tiene un efecto importante en el resultado final. (Navarrete et al, 1998). La razón principal de la aplicación de una efectiva etapa de desinfección es reducir los contaminantes microbianos a un nivel aceptable en el equipo, utensilios y del ambiente de producción del alimento. Esta debe realizarse sobre superficies limpias. (GTC 85, 2003). La desinfección puede ser considerada como el complemento y perfeccionamiento de las operaciones de limpieza a las que vuelve incluso más eficaces, ya que reduce los inconvenientes debidos a la presencia de microorganismos. (Vélez y Cuadrado, 2005). Otro aspecto importante es la elección del desinfectante, el cual debe ser eficaz en ese caso determinado, en aquel lugar, en aquellos materiales, tener un buen espectro de acción y carecer de toxicidad. Entre los factores que condicionan la eficacia de un desinfectante esta: Propios del desinfectante: la concentración a la que se utiliza, la estabilidad de las soluciones desinfectantes y el ph de actividad optimas del mismo. Propias de la resistencia microbiana: el tipo y ciclo vital de los microorganismos, la densidad de la población y el tiempo de contacto. Propios del material a tratar: la naturaleza del material en especial el contenido de materia orgánica, la constitución del material, la compatibilidad con el desinfectante, el tipo de tratamiento al cual está sometido al mismo tiempo que se usa el desinfectante, la cantidad de suciedad adherida a la superficie a tratar y la calidad del agua empleada. (Vélez y Cuadrado, 2005). 13

14 2.2. DEFINICIONES En la esfera de la desinfección y la esterilización se utilizan muchos términos diferentes. En la tabla N se encuentran los términos más comunes: Tabla 1. Definición de términos relacionados con los procedimientos de limpieza, desinfección y esterilización. TERMINO DEFINICION Antimicrobiano Agente que mata los microorganismos o suprime su crecimiento y proliferación. (OMS, 2005) Antiséptico Sustancia que inhibe el crecimiento y el desarrollo de microorganismos pero no necesariamente los mata. Los antisépticos suelen aplicarse a las superficies corporales. (OMS, 2005) Antibiótico Sustancia química natural procedente del metabolismo de los microorganismos y sus derivados sintéticos que destruyen (biócida) o inhiben el crecimiento de bacterias u otros microorganismos Bactericida Sustancia química que, bajo condiciones definidas, destruye formas vegetativas bacterianas, pero no necesariamente las esporuladas. (Forsythe y Hayes, 2002). Bacteriostático Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero no necesariamente las destruye. (Forsythe y Hayes, 2002). Biocida Sustancia química que posee actividad desinfectante o antiséptica, destruye los microorganismos patógenos y no patógenos. (GTC 85, 2003). 14

15 Desinfección Tratamiento físico-químico o biológico aplicado a las superficies limpias, que tiene como propósito destruir las células vegetativas de los microorganismos que pueden ocasionar un riesgo de salud publica y reducir sustancialmente el número de otros microorganismos indeseables. (GTC 85, 2003). Desinfectante Definido originalmente en términos médicos, como toda sustancia química que destruye los microorganismos causantes de enfermedades, ahora se define como las sustancias que destruyen una gran variedad de microorganismos, pero no necesariamente las esporas bacterianas. (Forsythe y Hayes, 2002). Descontaminación Cualquier proceso utilizado para eliminar o matar microorganismos. También se utiliza para referirse a la eliminación o neutralización de sustancias químicas peligrosas y materiales radioactivos. (OMS, 2005). Detergentes Sustancias capaces de ayudar a la limpieza, cuando se agregan al agua. Incluyen jabones, agentes tensioacivos orgánicos. (GTC 85, 2003). Esporicida Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizadas para matar microorganismos y esporas. (OMS, 2005). Esterilización Proceso que mata o elimina todas las clases de microorganismos y esporas. (OMS, 2005). Fungicida Agente químico que, bajo condiciones definidas, destruye los mohos y sus esporas. (Forsythe y Hayes, 2002). Germicida Es un producto de acción letal sobre los microorganismos, especialmente los patógenos (gérmenes). (Res.GMC Nº26/96). 15

16 Inactivación Eliminación de la actividad biológica de los microorganismos por destrucción, inhibición de la reproducción o inhibición de la actividad enzimática. (GTC 85, 2003). Limpieza Cubre todos los procesos implicados en la eliminación de todo tipo de suciedad de las superficies, pero no los que corresponden a la esterilización. (Forsythe y Hayes, 2002). Sanitizacion Aplicación de cualquier método o sustancia química sobre una superficie limpia, para la destrucción de microorganismos patógenos u otros organismos. Tal tratamiento no afectara el equipo, ni el producto ni la salud de las personas. (GTC 85, 2003). Sustancia o principio activo Componente que, en la formulación, es responsable de por lo menos una determinada acción del producto. (Res.GMC Nº26/96). Virucida Sustancia química que destruye o inactiva partículas víricas. (GTC 85, 2003). 16

17 2.3. DESINFECTANTES Generalidades Los desinfectantes y antisépticos son sustancias químicas que matan o inhiben el crecimiento microbiano. Entre los desinfectantes esta el cloro, hipoclorito, clorámidas, fenol, agentes alquilantes, detergentes, etc. Se aplican sobre material inerte como pisos, mesas y equipos, mientras que los antisépticos como el alcohol yodado, methiolate se emplean sobre tejidos vivos. (Escobar, 2002). El objetivo de los agentes es disminuir el número de microorganismos, de forma que los que sobrevivan (algunas esporas y posiblemente unas pocas formas vegetativas muy resistentes) no influyan en la calidad microbiológica de las muestras y productos que contactan con las superficies desinfectantes (Arias, 2006). Pueden utilizarse como desinfectantes o antisépticos muchos tipos de sustancias químicas. Dado que el número y la variedad de productos comerciales es cada vez mayor, deben elegirse cuidadosamente las formulaciones que sean más indicadas para las necesidades concretas. La actividad germicida de muchas sustancias químicas es más rápida y eficaz a temperaturas más altas, pero las temperaturas elevadas también pueden acelerar su evaporación y degradarlas. Es preciso tener particular cuidado en el uso y el almacenamiento de esas sustancias en las regiones tropicales, donde su tiempo de conservación puede verse reducido a causa de las altas temperaturas del ambiente. Muchos germicidas pueden ser perjudiciales para el ser humano o el medio ambiente. Se deben seleccionar, almacenar, manipular, utilizar y eliminar con precaución, siguiendo las instrucciones del fabricante. En relación con la seguridad personal, se recomienda utilizar guantes, delantales y protección ocular cuando se preparen diluciones de germicidas químicos. (OMS, 2005). En la tabla N 2. Se observan la clasificación de lo diferentes agentes esterilizantes, según al grupo al que pertenecen, desinfectantes y antisépticos: Tabla N 2. Agentes químicos desinfectantes y Antisépticos Antisépticos Alcoholes Iodo Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros Colorantes Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehídos Compuestos Fenólicos Acidos y Alcalis Fuente: ( 17

18 Características o Propiedades de un buen desinfectante Los desinfectantes que se deben utilizar en las superficies, deben cumplir, en condiciones ideales lo siguiente: Su eficacia: destruir rápidamente los microorganismos, siendo igual de eficaces con las bacterias Gram positivas que con las Gram negativas; deben destruir la mayoría de las esporas fúngicas, siendo también conveniente la destrucción de las esporas bacterianas. Se suficientemente estable a los factores ambientales (materia orgánica, jabones y detergentes, ph, temperatura, aguas duras y humedad relativa). Tiempo de contacto. Todos los desinfectantes requieren un tiempo mínimo de contacto para mostrar su eficacia. Ninguno actúa inmediatamente. Propiedades no toxicas y no irritantes. No debe ser corrosivo. Tener capacidad de penetración. Tener acción detergente además de desinfectar. Debe ser soluble en agua y no afectarle la dureza del agua. Debe ser incoloro o no teñido. Debe ser inodoro o no desprender olores desagradables. Debe ser fácilmente disponible, económico y fácil de usar. Estables durante mucho tiempo en forma concentrada y durante u tiempo mas breve en forma diluida. (Quiles y Hevia, 2007); (Marriot, 2003) Factores que influye la eficacia de los agentes químicos desinfectantes. La eficacia de todos los agentes de desinfección está influenciada por la concentración, el tiempo de contacto, la temperatura, la materia orgánica, ph, la dureza del agua, combinación con detergentes y tipos de microorganismos (GTC 58, 2003). Concentración: La concentración para obtener un determinado efecto, si como el rango de concentraciones en que se puede obtener un resultado esperado, depende de la naturaleza química del desinfectante, de los tipos de microorganismos que se van a eliminar y de las condiciones de aplicación. ph: Todos los desinfectantes se ven afectados por el ph de las soluciones de uso. (GTC 85, 2003). El ph afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. El aumento de ph por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentración del agente sobre la célula. El ph determina el grado de disociación y la efectividad del agente químico, pues a menor 18

19 disociación mayor permeabilidad y mayor efectividad. ( Temperatura: Por lo general las temperaturas mas elevadas mejoran el poder desinfectante, por ejemplo del oxido de etileno. (Jiménez, 2000). Algunos desinfectantes son afectados a bajas temperaturas. El cloro y los desinfectantes a base de ácido peracético o peróxido de hidrogeno, mantiene eficacia en temperaturas muy bajas. Las temperaturas demasiado altas debe ser evitadas, debido a las características corrosivas ya la pérdida posible de actividad de algunos desinfectantes. (GTC 85, 2003) Tiempo de contacto: El efecto de los agentes químicos no es inmediato, los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. (Jimenez, 2000). El tiempo de contacto esta directamente relacionado con la concentración para obtener un efecto microbiano dado. Existe un tiempo de contacto mínimo para cada desinfectante y para cada concentración. Tiempos prolongados de contacto tiene efectos adversos en los equipos de proceso. (GTC 85, 2003). Dureza del Agua: La mayoría de los desinfectantes son eficaces en una amplia gama de la dureza del agua. (GTC 85, 2003). Las aguas duras (Calcio y magnesio), afectan negativamente al desinfectante. (Arias, 2006). Condiciones de Crecimiento y Tipo de Microorganismos: los desinfectantes deben tener el más amplio espectro de actividad en contra de los virus, bacterias, hongos y esporas. Y deberán tener acción biócida en contra de los microorganismos en una variedad de condiciones y estadios de crecimientos. La cantidad de microorganismos, influye en la acción del desinfectante, por lo que es importante recudir esta carga con el lavado y con el uso de detergentes, antes de la desinfección. (Galán, 2003). Sustancias interferentes: la eficacia de los desinfectantes se reduce con la presencia de sustancias interferentes, especialmente materia orgánica, por dos principales causas: a. La presencia de materia orgánica reduce y en algunos casos inactiva la acción de ciertos agentes desinfectantes. Los más afectados son los clorados y los yodóforos. b. Algunos desinfectantes pueden ser también afectados por las materias orgánicas, como sales presentes en agua dura. 19

20 Además, de una forma no reactiva, la metería orgánica e inorgánica forma una barrera protectora, de tal manera, que los microorganismos son protegidos de sus efectos. (Galán, 2003) Mecanismos de acción de los desinfectantes sobre los microorganismos. La acción de los desinfectantes se caracteriza por su intensidad y ausencia de especificidad. En su actuación se distinguen varias etapas: a) Fijación: Ocurre en la pared bacteriana y varía en función de la concentración y movimiento. Es un fenómeno de naturaleza química eléctrica. b) Penetración: Los desinfectantes atraviesan la pared bacteriana y la membrana celular. c) Acción: se realiza a dos niveles: uno sobre la membrana citoplasmática, cuya alteración provoca una desorganización del metabolismo, la fuga de sustancias, la degradación celular y, finalmente, la muerte celular. A otro nivel oxidan sustancias y desnaturalización los proteínas con daño en el metabolismo celular (GTC 58, 2003). La acción que ejercen los agentes desinfectantes para destruir los microorganismos, tales como la oxidación, la coagulación de proteínas y el rompimiento de la pared y membrana celular, permiten que se lleven a cabo los mecanismos por los cuales se logra eliminar las bacterias. Estos mecanismos son: Desintegración de organización de la célula. Interferencia con la energía (núcleo). Síntesis de proteínas (interferencia con el crecimiento). La acción oxidante del cloro al combinarse con el agua, se lleva a cabo directamente sobre el protoplasma de la bacteria, causando desintegración de su estructura. Así mismo, se conoce que la mayoría de desinfectantes químicos coagulan las proteínas, como otro mecanismo de acción en la destrucción de las bacterias. El rompimiento de la pared celular se explica por el descenso de la tensión superficial causando en algunos casos que la bacteria se disuelva. (Soto, 1995). En la Tabla N 3, se resumen los mecanismos de acción y los blancos de los principales agentes químicos utilizados en desinfección. 20

21 Tabla N 3 Mecanismos de Acción Antibacteriana de Antisépticos y Desinfectantes mas Comunes. Sitio Blanco Antiséptico o Desinfectante Mecanismo de Acción Envoltura (pared celular, externa) celular membrana Glutaraldehído EDTA, otros permeabilizantes Unión cruzada proteínas Bacterias Gram negativas: remoción de Mg ++, liberación de algunos lipopolisacaridos CAC (compuestos de amonio cuaternario) Daño generalizado de la membrana que comprometen fosfolípidos de las dos membranas. Clorhexidina Las bajas concentraciones afectan la integridad de la membrana, las altas concentraciones causan coagulación del citoplasma. Membrana interna citoplasmática Diaminas Inducción a la pérdida de aminoácidos. PHMB (mezcla heterodispersa de bioguanidas de polihexametileno), alexidina. Fase de separación y formación de dominios de lípidos de membrana. Unión cruzada a macromoléculas Fenoles Formaldehído Glutaraldehído Pérdida, desacople. Desnaturalización de proteínas por coagulación Unión cruzada de proteínas, ARN y ADN. Unión cruzada de proteínas de la envoltura celular y en otros sitios celulares. Acridinas Intercalación de una molécula de 21

22 Intercalación con el ADN acridina entre dos capas de pares de bases en el ADN. Interacción con Compuestos con plata Enzimas que se unen a membrana grupos tiol interacción con grupos tiol. Halógenos Inhibición de la síntesis del ADN Efectos en el ADN Peróxido de hidrógeno, iones de plata Ruptura de la hebra de ADN Halógenos Oxidación de los grupos tioles a disulfitos, sulfóxidos o disulfóxidos. Agentes oxidantes Peroxígenos Peróxido de hidrógeno: Actividad debida a la formación de radicales libres OH-, que oxida a los grupos tioles en enzimas y proteínas; ácido paracético: Inhibición de los grupos tioles en proteínas y enzimas. Membrana citoplasmática Fefectos en las proteinas y acidos nucleicos Alcoholes Desagregación de la membrana citoplasmática. Desnaturalización de enzimas intracelulares por coagulación. Cloro y derivados Inhibe las reacciones enzimáticas, desnaturaliza proteínas e inactiva ácidos nucléicos. Fuente: (Cabrera et al, 2002). (Laveau y Buix, 2002). 22

23 RESISTENCIA DE LOS MICROORGANISMOS A LOS DESINFECTANTES. La resistencia que ejercen las bacterias a los antibióticos, antisépticos y desinfectantes es un problema de salud pública, que se creía superado. La resistencia bacteriana a los biocídas fue descrita en las décadas de 1950 y 1960 y ha ido en aumento. Ciertos biocída como alcoholes, formaldehídos, biguanidas, yodoforos, aldehídos y agentes catiónicos como los compuestos de amonio cuaternario (CUAs), la clorhexidina y el triclosán se han comprometido como posibles causantes de la selección y persistencia de cepas bacterianas con bajo nivel de resistencia a los antibióticos (Cabrera et,al, 2007). Mecanismos de resistencia a los antisépticos y desinfectantes En la actualidad se ha obtenido un avance considerable en la comprensión de la respuesta de las bacterias a los bactericidas. La resistencia puede ser una propiedad natural de un organismo (intrínseca) o conseguida por mutación o adquisición de plásmidos (autorreplicación, ADN extracromosómico) o transposones (cromosomal o integrado en plásmidos, cassettes de ADN transmisibles). Los genes de resistencia naturales en plásmidos, se originan como mutaciones puntuales en los genes blanco (sitios de inserción de los genes de resistencia) de bacterias susceptibles y también de genes que les proveen protección contra otras bacterias. La resistencia intrínseca se ha demostrado para bacterias Gram negativas, esporas bacterianas, micobacterias y bajo ciertas condiciones en especies del género Staphylococcus. (Cabrera et,al, 2007; Cash, 2002). Resistencia intrínseca de las bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram negativas por lo general son más resistentes a los antisépticos y desinfectantes que las Gram positivas. La membrana externa de las bacterias Gram negativas actúa como una barrera que limita la entrada de varios tipos de agentes antibacterianos sin relación química. Las moléculas hidrofílicas de bajo peso molecular pasan fácilmente a través de las porinas, en cambio las moléculas hidrofóbicas se difunden a través de la bicapa de la membrana. Además de las vías antes descritas se ha propuesto una tercera vía para agentes catiónicos como los Compuestos de amonio cuaternario, biguanidas y diamidinas, los cuales dañan la membrana y facilitan su autocaptación. Un ejemplo claro de resistencia mediada por la membrana externa es el de P. aeruginosa que presenta diferencias en la composición del lipopolisacárido (LPS) y el contenido de cationes como el magnesio, que produce enlaces estables entre moléculas de LPS y como complemento a este mecanismo, esta bacteria presenta porinas pequeñas que impiden el paso por difusión de ciertas sustancias. Algunas cepas que son muy resistentes a clorhexidina, CAC, EDTA y diamidinas se han aislado de 23

24 muestras clínicas. La presencia de un LPS menos ácido en la membrana externa puede ser un factor que contribuye a la resistencia intrínseca. (Cabrera et,al, 2007). La presencia de lípidos en la membrana externa de los bacilos Gram negativos se relaciona con el hecho de que estas bacterias son mucho más resistentes que los Gram positivos a los agentes antibacterianos, incluyendo los desinfectantes. En los estafilococos, por ejemplo, los lípidos están presentes en pequeñas cantidades; si se incrementa (por ejemplo haciéndoles crecer en presencia de glicerol), los microorganismos se vuelven más resistentes a ciertos fenoles y penicilinas. En las micobacterias, el contenido en lípidos se asocia con su gran resistencia a los desinfectantes. Se han llevado a cabo estudios con mutantes rugosos, defectivos en la región interna del núcleo, que resulta sensibles a una amplia variedad de desinfectantes y detergentes, relacionándose lo uno con lo otro. Se ha visto también, que la reorganización de los fosfolípidos de la membrana externa puede permitir la penetración de moléculas hidrofóbicas por disolución y difusión en los lípidos. (Camargo, Torres, 2003). La superficie de los Gram negativos lisos es hidrofìlica; en el caso de los mutantes rugosos, sin embargo, tienden a ser mucho más hidrofòbica En las cepas salvajes, las moléculas del LPS intactos se oponen al acceso rápido de los biocidas hidrofòbicos o de los antibióticos, al interior de la célula probablemente mediante un sistema de blindaje protector conferido por los fosfolípidos, mucho de los cuales no están presentes en la estructura de la membrana clásica. En el caso de los bactericidas cationicos, como es el caso de las biguanidas y los derivados de amonio cuaternario, ambos interactúan con fosfolípidos y LPS, produciendo daño en la membrana celular. (Camargo, Torres, 2003). Mecanismos de Resistencia Bacteriana Adquirida Como se ha visto en los antibióticos y en los agentes quimioterapéuticos, la resistencia adquirida a los antisépticos y desinfectantes surge por mutación o por la adquisición de material genético en forma de plásmidos o transposones; estas configuraciones permiten grandes arreglos de genes de resistencia para la mayoría de los antibióticos y desinfectantes al ser transferidos juntos en un solo evento de conjugación (Cash, 2002); (Cabrera et,al, 2007). 24

25 CLASIFICACION DE LOS DESINFECTANTES SEGÚN SU MECANISMO DE ACCION Agentes que dañan la membrana celular Los solventes orgánicos (fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos (detergentes) dañan la integridad estructural de la membrana, es decir desorganizan la disposición ordenada de lípidos y proteínas, de modo que interfieren con su función, ejerciendo un efecto neto de: Interferencia con la función normal de permeabilidad selectiva. Interferencia con procesos de transporte y metabolismo energético. Salida de pequeñas moléculas de la célula. (Jiménez, 2000) Agentes que Desnaturalizan proteínas Las proteínas en su estado natural poseen una forma característica de la que dependen su función. Los agentes ácidos o bases cambian el ph del medio, modificando las cargas de los grupos R (Restos de los aminoácidos) de las proteínas y las interacciones intramoleculares; desnaturalizándolas y perdiendo su funcionalidad. (Jiménez, 2000) Agentes que modifican los grupos funcionales Ácidos Nucleicos y Proteínas Se caracterizan por los siguientes efectos: Alteran grupos funcionales que forman parte de los centros activos de enzimas y otras proteínas. Alteran grupos funcionales de ácidos nucleicos, componentes de la pared y de la membrana. Al modificarse los grupos funcionales, ya sea por cambio en estado de oxidación (agentes oxidantes), por bloqueo (metales pesados) o por incorporación de pequeños restos carbonados (agentes alquilantes) se afecta: La interacción intramolecular de las proteínas alterando su forma. La interacción intermolecular, por ejemplo de las enzimas y proteinas con el sustrato, o de los ácidos nucleicos durante su lectura ya sea en la duplicación, trascripción o traducción. (Jiménez, 2000). 25

26 CALSIFICACION DE LOS DESINFECTANTES DEACUERDO A SU ACTIVIDAD Los desinfectantes químicos, de acuerdo a su actividad, se dividen en cuatro niveles: Desinfectantes de Nivel más Alto (IV): Proceso mediante el cual se destruyen o eliminan todos los microorganismos, con excepción de alto número de esporas bacterianas (NTC 4850,2000). En condiciones estrictamente controladas, este procedimiento eliminas virus, hongos, formas vegetativas bacteriánas, incluídas micobacterias, y solo admiten la presencia de algunas esporas bacterias convencionalmente consideradas no patógenas. (Navarrete, 1998). En este grupo se puede incluir el oxido de etileno y el glutaraldehido, (Galan, 2003). Desinfectante de Nivel Alto (III): con un amplio espectro incluso con cierta actividad esporicida. En este grupo se podrían incluir los siguientes productos: Glutaraldehido: agente de actividad alta en contra de bacterias, hongos, virus y esporas. Pudiendo ser fungicida tras una aplicación de minutos al 40%. Hipoclorito sódico. Peróxido de Hidrogeno, es mas efectivo como esporicida que como bactericida. (Galan, 2003). Desinfectante de nivel intermedio (II): Proceso mediante el cual se inactivan microorganismos como Mycobacterium tuberculosis, las bacterias vegetativas, la mayoría de los virus y hongos, pero no destruyen las esporas bacterianas. (NTC 4850, 2000). Exige además del nivel I, la eliminación de las micobacterias, pero no asegura la destrucción de las esporas bacterianas. (Mignard, 2006). En este grupo habría que incluir el etanol y el isopropanol. (Galán, 2003). Desinfectante de nivel bajo (l): Este procedimiento puede inhibir o destruir a la mayor parte de las bacterias en estado vegetativo, algunos hongos y virus; pero no puede dependerse de ella para eliminar microorganismos resistentes, tales como los bacilos de la tuberculosis o las esporas bacterianas. (NTC 4850, 2000). Este procedimiento es poco confiable si se desconoce la biocarga o el riesgo es de consideración. (Navarrete, 1998). Los agentes químicos como los compuestos de amonio cuaternario (cloruro de benzalconio) son considerados como desinfectantes de baja actividad. (Galán, 2003). 26

27 CLASIFICACIÓN DE LOS DESINFECTANTES SEGÚN EL METODO DE DESINFECCION AGENTES FISICOS DESINFECTANTES Los microorganismos tienen una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. Las temperaturas por debajo de la mínima usualmente tiene una acción de stasis o sea detienen el crecimiento microbiano, pero no provocan la muerte celular. Las temperaturas por encima de la máxima usualmente tienen una acción cida o sea provocan la muerte de los microorganismos por desnaturalización de enzimas y otras proteínas. El uso de altas y bajas temperaturas esta muy difundida y resulta muy efectivo para controlar el crecimiento microbiano. La sensibilidad de los microorganismos a las temperaturas varia con las especie y con el estado en que se encuentren. Las esporas bacterianas son estructuras vivas mas termorresistentes. Resisten tratamientos térmicos más drásticos que las formas vegetativas. Por ejemplo esporas de microorganismos mesófilos en suspensión son capaces de resistir 30 minutos a 80ºC, lo cual es letal para las formas vegetativas. Existen también ascosporas de hongos filamentosos que son mas termorresistentes que la correspondientes forma micelial. (Jiménez, 2000). El Calor La eficacia de los procesos de desinfección por calor depende de la temperatura alcanzada, del tiempo y de la humedad. El grado de destrucción microbiana requerido se alcanza siempre y cuando el método de aplicación y el diseño del equipo permitan la penetración adecuada de calor en todas partes del equipo. (GTC 85, 2003). Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidativas irreversibles en los microorganismos. La efectividad del calor como método de esterilización depende de: Temperatura y Tiempo de exposición. ( El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan 27

28 mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación. (GTC 85, 2003). El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 C. Una temperatura de 121 C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas. ( Calor seco El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper por el calor seco. ( Tratamiento con aire caliente Para este tipo de tratamientos se emplean hornos que alcancen temperaturas mayores de 150ºC. Estos tratamientos pueden ser esterilizantes. Las condiciones de esterilización de material con baja carga puede ser: a) 180ºC una hora b) 160ºc durante dos horas. Si se empleara calor seco al 121ºC se debería realizar un tratamiento de 16 horas. (Jiménez, 2000). Este tipo de tratamientos se usa para esterilizar material de vidrio, instrumentos de metal o aceites y polvos que soporten esas altas temperaturas Otros Agentes Físicos desinfectantes Desinfección mediante radiación Su acción depende de: Tipo de radiación, tiempo de exposición y la dosis. Ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleícos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. 28

29 Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes. a) Ultravioletas: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies. ( Filtración Los filtros retienen los microorganismos impidiendo el pasaje a través de los mismos. Los filtros de membrana retiene a los microorganismos en la superficie por poseer poros de tamaño pequeño (0.2 micras) a través de los cuales los microorganismos no pueden pasar. Los filtros de profundidad retienen a los microorganismos atrapándolos en su matriz. Un ejemplo de filtración de profundidad es el tapón de algodón que se utiliza para tapar los tubos de medio de cultivo. (Jiménez, 2000) AGENTES QUIMICOS DESINFECTANTES Los agentes químicos (AQ) son compuestos que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos. Incluyen sustancias usadas como conservadores y antisépticos así como drogas usadas para el tratamiento de enfermedades infecciosas de plantas y animales. (Jiménez, 2000). La eficacia de los desinfectantes químicos se debilita por la presencia de suciedad y cuanto mas limpia esta la superficie a desinfectar más eficaz resultara el desinfectante utilizado. (Forsythe y Hayes, 2002). Tipos de Agentes Químicos Desinfectantes Productos reductores. Aldehídos Formaldehído Conocidos comúnmente como formol, formalina y aldehído fórmico. El formaldehido es un gas incoloro, de olor irritante y lacrimógeno, soluble en agua y tiene un ph débilmente ácido. Además es un agente corrosivo y potencialmente carcinógeno. (Leveau y Bouix, 2002). Se utiliza como desinfectante de alto nivel en estado líquido y gaseoso. Principalmente se utiliza en solución acuosa (formaldehído al 37%); en estas condiciones posee actividad bactericida, fungicida, virucida, tuberculicida y esporicída. (Leveau y Bouix, 2002). 29

30 El formaldehído reacciona con las proteínas y los ácidos nucleicos dando lugar a una desnaturalización irreversible debido a la formación de puentes intra e intermoleculares. El formaldehído es muy utilizado para la desinfección de superficies, de equipos y de los circuitos de tuberías, en asociación con otros aldehídos amonios cuaternarios. El uso principal es la desinfección por vía aérea. (Leveau y Bouix, 2002) Ventajas Bactericida-fungicida No corrosivo Buena enjuagabilidad Bajo costo. Activo en presencia de materia orgánica Desventajas: Olor desagradable lacrimógeno Posibles riesgos toxicos por inhalación. Irritante y cancerígeno en forma de gas (Leveau y Bouix, 2002) Glutaraldehido Conocido comúnmente como aldehído glutárico. La estabilidad del glutaraldehido depende del ph y la temperatura. La pérdida de actividad se acelera a partir de ph 8,8 y una temperatura superior a 50 C. La zona de ph compatible con una estabilidad satisfactoria va de ph 3,5 a 6,5. El gluataraldehido no es un agente químico agresivo frente a los materiales utilizados (acero inoxidable, aluminio, materias plásticas, caucho). (Leveau y Bouix, 2002) El glutaraldehido es el agente antimicrobiáno mas utilizado en el sector hospitalario para la desinfección del materila de endoscopia. (Leveau y Bouix, 2002) Su actividad biocida se debe a la desnaturalización de las proteínas y aniquilación de los ácidos nucleicos (RNA y DNA). El glutaraldehido posee un espectro muy amplio que abarca las bacterias, levaduras, mohos, y formas esporuladas. Se distingue sobre todo por su actividad virucída frente a los virus encapsulados y virus desnudos. Esta propiedad es aprovechada en el sector hospitalario (activiadad anti-hepatitis B) o agroalimentario (actividad antifungico). (Leveau y Bouix, 2002) Ventajas 30

31 Bactericida-fungicida-virucida-esporicída Acción rápida No corrosivo Costo moderado Efectivo en presencia de materia orgánica Efectivo en presencia de materia orgánica Desventaja: Olor característico Sensible a las variaciones de ph. (Leveau y Bouix, 2002) Agentes Oxidantes Ácido peracético (ácido peroxiacético). Este ácido fuertemente oxidante es activo en forma de ácido peroxiacético. Las soluciones de este ácido constituyen sistemas bactericidas, fungicidas, virucicas y esporicidas eficaces. (GTC 85, 2003). Las soluciones de ácido peracético son incoloras, de olor picante y lacrimógeno; es un oxidante potente, muy reactivo y causa quemaduras. El ph del ácido peracético es generalmente cercano a 1, por lo tanto es muy ácido; la estabilidad se mantiene respetando las reglas estrictas (temperatura de almacenamiento baja y ausencia de metales pesados en los compuestos base durante la fabricación). (Leveau y Bouix, 2002) Su acción biócida se debe a la desnaturalización de proteínas, rompe los enlaces intramoleculares de los enzimas y compuestos de la membrana por ruptura oxidativa y provoca cambios de permeabilidad de la pared celular. (Leveau y Bouix, 2002). Ventajas Bactericida-fungicida-virucida-esporicida Activo a bajas temperaturas Acción rápida Buena enjuagabilidad Poco costoso. Desventajas Riesgos de corrosión Inestabilidad debido a la temperatura Vapores irritantes. 31

32 Ozono El ozono es una molécula compuesta por tres átomos de oxigeno que se presenta naturalmente en la parte superior de la atmosfera que envuelve la tierra. Actúa como oxidante y desinfectante y puede utilizarse como medio de control de amenazas químicas y microbianas. El ozono esta siendo considerado como sustituto del cloro. Como el dióxido de cloro, el ozono es inestable, debiendo generase a medida que se va consumiendo en el punto de aplicación. Como oxida rápidamente, ejerce menos impacto ambiental. (Marriot, 2003) Peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno pertenece al grupo de los desinfectantes oxidantes, conocido comúnmente como agua oxigenada, dióxido de hidrógeno o hidroperóxido, su fórmula química es (H2O2). Este producto se puede considerar como el desinfectante más natural. Se le encuentra espontáneamente en productos como la leche y la miel e igualmente en los tejidos vivos donde es el resultado del metabolismo celular. (Leveau y Bouix, 2002). El peróxido de hidrogeno es un biocida ampliamente empleado para de desinfección, esterilización y antisepsia. Comercialmente se encuentra en concentraciones comprendidas entre el 3% y 90%. Considerado biodegradable, ya que se degrada rápidamente en dos productos inocuos agua y oxigeno. Posee un amplio rango de actividad y eficacia. (Galán, 2003). Esta eficacia disminuye cuando lo que se necesita es una eliminación de esporas. En estos casos, la actividad esporicida se verifica cuando la concentración mínima de uso se encuentra comprendida entre el 10% y 30%, siendo generalmente necesario un incremento en el tiempo de contacto, superior siempre a 5 minutos. (Galán, 2003). En cuanto a la toxicidad del oxigeno para los microorganismos, es sabido que durante la respiración se forman cantidades pequeñas de radicales libres superóxido (O2). Estos radicales libres son tóxicos para los componentes celulares, de tal suerte que los microorganismos que crecen en presencia de oxigeno, como aceptor final de electrones, deben sintetizar un enzima la superóxido dimutasa, para neutralizarlos. Gracias a esta enzima, los radicales superóxido se transforman en oxigeno molecular (O -2 ) y peróxido de hidrogeno (H2O2). (Cuesta y Castillo, 2004). El peróxido de hidrogeno es también toxico, pero se convierte inmediatamente en oxigeno molecular y aguas mediante la enzimas catalasa. También la peroxidasa destruye el peroxido de hidrogeno. El ión peróxido (O -2 ) es otra forma tóxica del oxigeno, que se genera en pequeñas cantidades en la respiración normal. El ultimo producto de la respiración normal es 32