Curso: Animal de experimentación como reactivo biológico en investigación, diagnóstico y control de fármacos

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1 Curso: Animal de experimentación como reactivo biológico en investigación, diagnóstico y control de fármacos Aspectos Generales de roedor de laboratorio (especies, cepas, líneas). Sistemas de producción para mantenimiento de condición genética. Lic. Mariela Santos Unidad de Reactivos y Biomodelos de Experimentación Facultad de Medicina

2 Es la rama de la ciencia que se ocupa de la clasificación de los seres vivos y establece las bases y principios que la regulan. Categorías taxonómicas: son los distintos niveles de jerarquías en un sistema de clasificación. ESPECIE: es la unidad básica de la clasificación biológica. No hay un concepto de especie de aceptación universal Concepto biológico de especie, formulado por Ernst Mayr (1942): Las especies son grupos de poblaciones naturales que son real o potencialmente capaces de entrecruzarse y que están aislados reproductivamente de otros grupos afines. Es el concepto más aceptado entre zoólogos. Este concepto puede ser aplicado a organismos de reproducción sexuada. El cruzamiento entre especies es impedido por mecanismos de aislamiento reproductivo.

3 A) Pre copulatorios (impiden unión de gametos) 1. Aislamiento de hábitat 2. Aislamiento etológico 3. Aislamiento mecánico B) Pos copulatorios 1. Incompatibilidad gamética 2. Inviabilidad del híbrido 3. Esterilidad del híbrido

4 Nomenclatura binomial Ideada por Linneo en el siglo XVIII. Los nombres científicos de las especies se escriben en latín y se designan con dos palabras: nombre genérico y específico. El género es el primer componente del nombre científico de una especie, comienza con Mayúscula y es seguido por el nombre específico, que siempre se escribe con minúscula. Ambos deben escribirse en cursiva.

5 REINO: Animal PHYLUM: Chordata SUBPHYLUM: Vertebrata CLASE: Mammalia ORDEN: Rodentia FAMILIA: Muridae GENERO: Mus Rattus ESPECIE: Mus musculus (Linneo, 1758) Rattus norvegicus (Berkenhout, 1769)

6 Más del 90% de los mamíferos utilizados en investigación científica pertenecen al orden Rodentia Es el orden más abundante de los mamíferos vivientes, representado por más de 2000 especies (40% de los mamíferos), agrupadas en 30 familias. Principal característica del orden es su dentición Especializados en la función de roer Incisivos de crecimiento continuo, sin raíz, con esmalte anterior No presentan caninos, generando un espacio sin dientes, denominado diastema, entre incisivos y molares. Incisivos normales

7 Especie: Mus musculus Características generales Origen del género: Asia, al norte de la India, dónde se encontraron registros fósiles de 7 millones de años Actualmente tiene distribución mundial Tamaño pequeño (peso adulto gr.) Hábitos nocturnos Visión pobre, olfato muy desarrollado, agudo sentido de la audición y el tacto Sin reflejo de vómito Cola con función de termorregulación y equilibrio Glándula Harderiana en la órbita de los ojos, en forma de herradura, secreta porfirina como respuesta al estrés

8 Diferenciación entre sexos: distancia ano-genital, mayor en machos Hembra Macho poliéstrica contínua Ciclo estral: 4 a 5 días Duración del celo: 8-12 horas Útero bicorne 5 pares de mamas celo posparto (dentro de las siguientes 24 horas) Canal inguinal abierto aún en adulto testículos abdominales o escrotales Pubertad: 5 semanas Gestación: días Promedio de camada: 4-8 crías Lactancia: 21 días

9 Tapón vaginal posparto Puede permanecer más de 12 horas Efecto Bruce: Cuando una hembra fecundada entra en contacto con otro macho durante los primeros días de gestación, se produce una reabsorción embrionaria. Efecto Whitten: Hembras mantenidas en grupos homosexuales entran en un anestro continuo que se interrumpe en presencia de un macho (o su olor) luego de 72 horas. Este efecto produce una sincronización del celo.

10 Al nacer Peso: 1-2 gr. Ojos cerrados, sin pelo No regulan temperatura corporal 6 días: comienza a crecer el pelo días: abren los ojos días: consumen alimentos sólidos, salen del nido 21 días: destete

11 Especie: Rattus norvegicus Características generales Origen: Zonas más frías de Asia Central Actualmente distribución mundial Peso de adulto gr. Hábitos nocturnos Visión pobre, olfato muy desarrollado, agudo sentido de la audición y tacto Sin reflejo de vómito Sin vesícula biliar Glándula Harderiana en la órbita de los ojos que secreta porfirina como respuesta al estrés Cola con función de termorregulación y equilibrio

12 Diferencia entre sexos: distancia ano-genital, mayor en machos Hembra: Macho poliéstrica contínua Ciclo estral: 4 a 5 días Útero bicorne 6 pares de mamas Duración del celo: 12 horas Celo posparto (dentro de las 24 horas) Canal inguinal abierto aún en adulto testículos abdominales o escrotales Pubertad: 6 semanas Gestación: días Promedio de camada: 6-12 crías Lactancia: 21 días Presencia de tapón vaginal posparto Sin efecto Bruce, leve efecto Whitten

13 Monogámicos: Parejas que pueden permanecer siempre juntas. Ventajas: Se aprovecha el celo posparto, mayor rendimiento reproductivo de la hembra (mayor número de camadas). Desventajas: Desgaste temprano de las hembras, se utiliza un mayor número de machos reproductores. Poligámicos: Formados por dos o tres hembras y un macho. Generalmente se separan las hembras antes del parto. Ventajas: Menor desgaste de la hembra, mayor viabilidad y tamaño de las crías destetadas, menor número de machos reproductores Desventajas: No se aprovecha el celo posparto, se obtiene un menor número de camadas por hembra. Regla general en ratones: No colocar más de un macho en una misma jaula con fines reproductivos, ni juntarlos luego que estuvieron en contacto con hembras, ya que generalmente pelean, por ser territoriales.

14 Determinados experimentos requieren una población uniforme de animales, que no presenten diferencias genéticas entre ellos. En roedores la consanguinidad es frecuente en la naturaleza, lo que permitió crear líneas de animales de laboratorio consanguíneas. Las líneas consanguíneas (endocriadas o endogámicas) son el prototipo de línea genéticamente estandarizadas. Fueron iniciadas con la cepa DBA de ratón, en Resultan del acoplamiento ininterrumpido de hermanos por hermanas por más de 20 generaciones, partiendo de una única pareja de progenitores. Depresión endogámica Fenómeno que puede aparecer durante el establecimiento de una línea consanguínea, se observa baja fertilidad y menor adaptación al medio, que puede llevar a la pérdida de la línea.

15 Isogenicidad: Todos los individuos son genéticamente iguales. Alto porcentaje de homocigosis: Se estima que a partir de la generación número 20, sólo un 1,3% se encuentra en estado heterocigota, lo que se conoce como hetericigosis residual. Individualidad con respecto a sus cualidades: Esto es muy importante a tener en cuenta al elegir una línea para una investigación determinada. Uniformidad fenotípica: Debido a que son animales genéticamente idénticos. Estabilidad genética a lo largo del tiempo. Permite la comparación de resultados entre diferentes laboratorios y a lo largo del tiempo.

16 Se generan debido a la heterocigosis residual y a la aparición de mutaciones espontáneas en los siguientes casos: Cuando una línea se separa en diferentes ramas antes de la generación número 40. Cuando una rama se ha mantenido separada de otras por más de 100 generaciones. Cuando se descubren diferencias genéticas en dos ramas diferentes, ya sea por mutaciones o por contaminación genética.

17 Líneas: Se designan con letras mayúsculas o combinaciones de letras mayúsculas y números (comenzando con letras). Ej. DBA, C57BL Sublíneas: Se utiliza el nombre de la línea, seguido de una barra y el signo de la sublínea, que puede ser un número o el código del laboratorio. Ej. DBA/1 y DBA/2; C57BL/6 y C57BL/10 Algunas excepciones: BALB/cJ, dónde c indica albinismo y J es el código del Laboratorio Jackson Abreviaturas: DBA/1 D1; DBA/2 D2; C57BL/6 B6; BALB/c - C

18 Son la primera generación obtenida del cruzamiento de dos líneas consanguíneas. Son isogénicos, pero heterocigotas para todos los loci en que difieren las líneas parentales. Característica de los híbridos: mejor adaptación al medio Nomenclatura: Se designan anotando primero el progenitor hembra, una X y en segundo lugar el progenitor macho. Ejemplo: (C57BL/6 x DBA/2)F1. Abreviatura: B6D2F1

19 Se establece un núcleo reproductor y expansión. una o más colonias de El núcleo reproductor, es lo más importante de la colonia ya que es la fuente de animales puros, genéticamente controlados. Los animales seleccionados como reproductores para siguientes generaciones, deben provenir de un número limitado de cajas y descender de una única pareja ancestral, no más de 5 generaciones atrás. Medidas para prevenir la contaminación genética: Separación física de colonias reproductoras de diferentes líneas. Seleccionar sistema de cría que minimice el movimiento entre cajas, la mejor opción son las parejas monogámicas o los harenes permanentes.

20 Grupos de roedores de laboratorio que mejor representan la variabilidad genética de una población típica. Se utilizan en estudios toxicológicos y farmacológicos. Los grupos no consanguíneos (exocriados o exogámicos) son grupos de animales no definidos genéticamente. Sistemas de cría tendientes a impedir que se realicen cruzamientos entre individuos emparentados. Esto es dificultoso en una colonia cerrada, por lo cual se debe partir de un gran número de parejas reproductoras.

21 No existe una nomenclatura universalmente aceptada. Dos tendencias: Nombre de 2 a 6 letras mayúsculas, aclarando en el texto que se trata de animales exocriados. Ej. WISTAR, exocriada. Nombre compuesto por el código del laboratorio criador y luego de dos puntos el nombre de la colonia. Ej. Crl:WI

22 Dependen del tamaño de la colonia N de unidades reproductoras Sistema de apareamiento 10 a 25 consanguinidad mínima 26 a 100 Rotacional Más de 100 Al azar

23 La base del sistema es que cada macho reproductor contribuye con un macho y cada hembra reproductora contribuye con una hembra para la próxima generación. Los nuevos reproductores deben ser seleccionados de manera de evitar el cruzamiento entre individuos emparentados. HEMBRA ORIGINARIA DE CAJA MACHO ORIGINARIO DE CAJA Numeración de nueva generación

24 Ideado por Poiley (1970) La colonia se subdivide en grupos de reproductores y los cruzamientos se establecen, sistemáticamente, entre grupos. Cuanto menor es la colonia, mayor número de grupos debemos formar. Ejemplo de colonias con 4 grupos MACHO DE GRUPO HEMBRA DE GRUPO GRUPO A FORMAR

25 Cualquiera sea el sistema de reproducción adoptado, se requiere la individualización de todos los animales, así como cada grupo reproductor (parejas o harenes). Identificación de los grupos reproductores Libro de registros Tarjetas de identificación de las cajas de alojamiento. Los datos registrados deben permitir conocer la genealogía de cada individuo para seleccionar correctamente los reproductores para las próximas generaciones. Las tarjetas de las cajas de reproducción deben contener los siguientes datos: identificación de cada individuo, fecha de nacimiento, a que generación corresponden, identificación de los progenitores, fecha de cruzamiento, fecha de parto, número de crías nacidas, fecha de destete, número de animales destetados de cada sexo. Los datos de las tarjetas deben ser pasados al libro de registros.

26 Métodos temporales Tinciones de pelaje con colorantes no tóxicos, recomendables para experimentos de corta duración. El más frecuente es el ácido pícrico (amarillo) Métodos permanentes de marcaje Caravanas numeradas (no recomendable, suelen perderse) Perforaciones en las orejas Tatuajes Microchip

27 Perforaciones en las orejas Es el método más extendido de marcaje en ratones y ratas de laboratorio No requiere anestesia No se necesita equipamiento sofisticado

28 Tatuajes Puede requerir anestesia Los animales se identifican mediante códigos o números tatuados en la cola Este equipo no requiere administración de anestesia

29 Microchip Implante subcutáneo de un microchip en la región interescapular Se requiere equipo especial para el implante y la lectura Requiere anestesia, el animal debe ser afeitado y desinfectado previo al implante

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