UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MAGISTER EN HORTICULTURA

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1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MAGISTER EN HORTICULTURA OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO TESIS DE GRADO MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE TALCA, CHILE 2012

2 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO POR MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE Presentada a la Universidad de Talca Como parte de los requisitos para optar Al grado académico de MAGISTER EN HORTICULTURA TALCA, CHILE 2012

3 COMISIÓN EVALUADORA Iván Palomo Gonzalez Tecnólogo Médico, Dr. Facultad de Ciencias de Salud Universidad de Chile Iván Razmilic Bonilla Químico, Dr. Instituto de Química de los Recursos Naturales Universidad de Talca PROFESOR TUTOR José Antonio Yuri Salomón Ingeniero Agrónomo, Dr. Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca

4 Agradecimientos La idea de ingresar al programa era aprender algo nuevo, en lo que estaba trabajando pero sin conocimientos en el como funcionaban los organismos vegetales. Creo que fue una experiencia enriquecedora que ayudo a aumentar mis conocimientos en temas en los que no era especialista, no fue para nada fácil, pero creo que con esto estoy terminando un largo viaje de aprendizaje. Es difícil comenzar a pensar y escribir las personas que de alguna u otra manera me ayudaron a terminar este largo proceso que comenzó hace aproximadamente 3 años. Y para no dejar a nadie fuera, creo que una manera bastante lógica es ordenarlo y dividirlos en dos grupos: Uno profesional/educacional y otro personal. Profesional: Al primero que debiera agradecer es al profesor José Antonio Yuri por abrirme las puertas de uno de los Centro Tecnológicos con más prestigio que cuenta la Universidad de Talca, el Centro de Pomáceas. Digo esto porque es un referente nacional en tema de fruticultura y que tuve la oportunidad de trabajar ahí. Al conocer la dinámica interna de este centro me llevo a conocer cómo se pueden realizar investigaciones y que tengan un impacto concreto en la industria. A la Sra. Amalia Neira, me gustaría agradecer su paciencia y ayuda, que durante las conversaciones que tuvimos, me sirvió en todas las dificultades metodológicas que nos fue presentando mientras avanzábamos en el desarrollo de la tesis. Y por intermedio de ella a Ivette Peña que me fue una tremenda ayuda en las mediciones de fenoles y capacidad antioxidante, y por intermedio de ella al Centro de Pomaceas que me ayudaron de alguna u otra manera. A los profesores guías, Dr. Iván Palomo y Dr. Iván Razmilic, por auxiliarme en ámbitos del conocimiento que yo no manejaba. Al Sr. Reyes que me ayudo en toda la parte de HPLC y química próximal. A Lisbet, que en el último tiempo me tubo una paciencia extraordinaria. Al Programa de Capital Humano Avanzado de CONICYT y el Gobierno Regional del Maule, que me apoyaron en los dos primeros años y que sin su ayuda no hubiera podido entrar al Programa de Magíster en Horticultura. Personal: Una de las personas que más me ayudo fue Luis, gracias por facilitarme todas las instalaciones e insumos que podía, no tan solo con la tesis. Y por la amistad en los años en que estuve en la Universidad. Que no fueron pocos.

5 A Rodrigo por compartir su conocimiento en cómo trabajar con ratones en cautiverio, terminar y procesar los datos obtenidos Además que fuiste un gran apoyo cuando la paciencia se agotaba. A mis padres, que me forjaron como persona y en gran parte a ellos estoy ahora aca terminando mi segundo programa de Magíster. Según creo, a la persona que más debiera agradecer es a mi Natalia, que durante estos tres años la tuve que dejar de lado para dedicarme a estudiar, siendo una gran apoyo en aquellos momentos en los que las fuerzas me abandonaban. Además, de acompañarme a revisar el ensayo con los animales o cuando me explicaba las formulas inentendibles de cierto ramo. Gracias por la paciencia..

6 A mi gran compañera Natalia que sin su ayuda y apoyo no hubiera sido capaz de terminar

7 I. RESUMEN Chile, desde finales de 1980, está pasando por un extraordinario momento económico que lo ha llevado a situarse como líder en Latinoamérica según una gran cantidad de indicadores (Desarrollo Humano, nivel de pobreza, Producto Interno Bruto, etc.). Es así que nuestro país fue invitado a formar parte de la Organization Economic Cooperation Development (OECD), grupo de países con un fuerte desarrollo socio-económico, como Estados Unidos, Japón, Noruega, Alemania, Corea del Sur entre otros. En temas de fruticultura, el nivel de liderazgo que ha alcanzado está industria en nuestro país lo sitúa en un nivel de categoría mundial, logrando ser lideres exportadores del hemisferio sur de fruta fresca en diversas especies como manzana, uva de mesa, kiwi, cerezas por citar algunos. Y actualmente también tiene una posición de líder de exportación en fruta procesada con frambuesas y arándanos. Aprovechando las fortalezas de ser un proveedor confiable de alimentos, entre otras cualidades de nuestro país. Este periodo de gran brillantez trae consigo nuevos desafíos, los cuales se debe hacer cargo la sociedad en su conjunto y no tan solo el Estado. Debido a que la globalización y la rapidez de las investigaciones han transformado al mundo en el que Chile se encuentra inserto y que en la muchas ocasiones debe competir con países con mayores recursos. Una de las alternativas, que se han barajado para hacer frente a este nuevo escenario es la utilización de las ventajas competitivas que presenta nuestro país para el desarrollo de la fruticultura, como es el clima y la disposición de agua (aunque cada vez sea más escaso este vital elemento). Por otra parte, es necesario aumentar la competitividad de la industria fruticultura en general, para evitar la entrada de nuevos competidores que pueden dejar a nuestro país fuera del mercado de exportación de fruta. Esto se deberá conjugar con las exigencias de los mercados, que cada vez están poniendo mayores exigencias, pero que puede ser una gran oportunidad de negocios para los productores nacionales. Una de las demandas crecientes son los alimentos con propiedades biológicas para evitar enfermedades o suplementos alimenticios de origen natural que signifiquen beneficios para la salud de las personas, especialmente en la última etapa de la vida. 1

8 La producción de manzana fresca es uno de los puntales en la fruticultura nacional, siendo solamente superada en cantidad de producción por la uva de mesa. Para la Región del Maule es la segunda fuente de ingresos económicos, según la Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule (Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Con el fin de aumentar la competitividad de este sector es que el trabajo realizado toma una gran importancia, porque se está buscando utilizar diversos componentes que no están siendo comercializables en la producción de manzana, ni tampoco se les ha asignado valor. Lo que traería consigo aumentar la competitividad de un sector económico que ha sido fuertemente golpeado por la valorización del peso en desmedro del dólar. Se desea desarrollar un nuevo producto en base de los desechos y/o subproductos de la industria de la manzana, por lo que se orientaron los esfuerzos en dos puntos claves: Agregación de valor en el fruto pequeño (raleo), el cual es descartado en alrededor de un 70%, con el fin de alcanzar mayores calibres y por consiguiente mayores precios de venta en la fruta fresca. Por otra parte, utilizar los desechos industriales (piel) que son eliminados en el proceso de producción industrial de chip de manzana. Se tomaron en consideración para la extracción de antioxidantes desde estos residuos diferentes factores que facilitaran el escalamiento desde el laboratorio hacia la industria. El primero fue descartar distintas metodologías que no son utilizadas por la agroindustria en sus procesos. El segundo paso fue estudiar si existían diferencias entre los cultivos orgánicos y tradicionales, especialmente en la extracción desde el fruto pequeño para estudiar la existencia de agroquímicos utilizados en sus procesos y que podrían estar presentes debido a que no han cumplido el tiempo de carencia, ya que su presencia sería perjudicial para la salud. Y por último, utilizar los extractos en un modelo animal para confirmar los posibles efectos benéficos que podrían resultar en su administración en organismos complejos y descartar efectos nocivos agudos para la salud. Los resultados del laboratorio demostraron que en el grupo control con dieta grasa se logro inducir el aumento considerable de peso y valores elevados en los indicadores relacionados al metabolismo lipídico, debido a la dieta alta en grasa o hipercalórica a la que fueron sometidos. En cambio en los grupos en estudio que fueron sometidos a los tratamientos con los extractos 2

9 altos en antioxidantes, proveniente desde el desecho agroindustrial, disminuyeron los valores hasta niveles del control normal. Concluyendo que el extracto alto en antioxidantes provenientes de la manzana se encuentra relacionado con la disminución de colesterol total y colesterol LDL y a su vez un aumento de colesterol HDL. 3

10 II. CONTENIDO I. RESUMEN...1 II. CONTENIDO...4 III. INDICE DE FIGURAS...5 IV. INDICE DE TABLAS...9 V. INTRODUCCIÓN...11 VI. HIPOTESIS Objetivo General Objetivo Específico...12 VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...13 VIII. METODOLOGÍA Recolección Y Extracción Preparación De Los Extractos Caracterización Química Análisis Estadístico Preparación De Las Dietas Ensayos Biológicos Análisis Bioquímicos Análisis De La Dieta...28 IX. RESULTADOS Búsqueda De La Metodología Óptima De Extracción De Compuestos Fenólicos Y Actividad Antioxidante

11 9.1.1 Evaluación De Concentración De La Mezcla Etanol/H 2 O Cuantificación De Los Extractos Composición De Las Dietas Y Los Extractos Ensayos Biológicos Ensayo De 10 Ml De Extracto / 250 Ml De Volumen Final Ensayo Concentración Constante De 400 Mg / Kg Peso De Raton...50 X. CONCLUSIONES...57 XI. BIBLIOGRAFÍA...59 III. INDICE DE FIGURAS FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA. OBTENIDO DESDE MANACH, ET AL FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON SEPARADAS A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE 0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M NA 2 HPO 4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 20, LDL EN FRACCIÓN Y HDL EN FRACCIÓN (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL NORMAL DE LA PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57B L/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1 ELUYE EN LA FRACCIÓN (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR -/- Y RATAS APOE /-. (D) PERFIL DE LIPO PROTEÍNA DE OBESAS LDLR -/- Y RATAS APOE /-. (KENNEDY ET AL., 2010) 20 FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50 C Y 80 C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 34 5

12 FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50 C Y 80 C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 35 FIGURA 5. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50 C Y 80 C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 35 FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50 C Y 80 C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 36 FIGURA 7. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80% ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37 FIGURA 8. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40% ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37 FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), F UJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (G SP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 42 FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), F UJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (G ST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 43 FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (G SP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 44 FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL 45 FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS EN ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TR ADICIONAL (FT), GRAN NY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP). 45 6

13 FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E, F, G VALOR P<0, FIGURA 15. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TR ADICIONAL (FT), GRAN NY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (G SP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05 48 FIGURA 16. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLES TEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO). PARA ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO EN 250 ML DE SOLUCIÓN FINAL 49 FIGURA 17. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN POR GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG / KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMIT H ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) 50 FIGURA 18. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR CADA GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 400 MG / KG PESO DE RATON 51 FIGURA 19. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO 400 MG/KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRAD ICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (CG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05 52 FIGURA 20. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO DE 400 MG/ KG DE PESO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMI TH ORGÁNICO (GSO), G RANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL ( GSP) Y FUJI PIEL (FP ), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).A VALOR P<0, FIGURA 21. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN ENSAYO DE 400 MG/KG DE PESOEN COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), F UJI 7

14 TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (G SP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A VALOR P < 0,001 Y B VALOR P< 0,05 55 FIGURA 22. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLES TEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO) E HIGADO (HIGADO) EN ENSAYO DE 400 MG / KG PESO DE RATON 56 8

15 IV. INDICE DE TABLAS TABLA 1. ANALISIS ANOVA DE LA CANTIDAD DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS TABLA 2. RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS TABLA 3. ANALISIS ANOVA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS TABLA 4. RESULTADOS CON LAS SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS TABLA 5. RESULTADOS PRIMERA ETAPA DE EXTRACCIÓN. *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO -1 MATERIAL VEGETAL TABLA 6. RESULTADOS SEGUNDA ETAPA DE EXTRACCIÓN *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO -1 DE MATERIAL VEGETAL TABLA 7. RESULTADOS DE LOS EXTRACTOS DEFINITIVOS. (*) LA CAP ACIDAD ANTIOXIDANTE ES EL MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO -1 DE MATERIAL VEGETAL 40 TABLA 8. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS, DE ACUERDO A LA QUÍMICA PROXIMAL. (*) ELN ELEMENTO LIBRE DE CARBONO TABLA 9. RESULTADOS DE QUÍMICA PROXIMAL Y CONTENIDO DE FENOLES PARA LOS DIFERENTES EXTRACTOS TABLA 10. INGESTAL TOTAL POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DE ALIMENTACIÓN DURANTE EL ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL TABLA 11. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT ), COLESTEROL HDL (COL HDL), GLICEMIA (GLI). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (F P), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LO S RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M)

16 TABLA 12. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ORGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRAD ICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) TABLA 13. INGESTAL TOTAL DE ALIMENTACIÓN POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG / KG PESO DE RATON FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) TABLA 14. RESUMEN DE LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLI CEMIA (GLI) Y COLEST ERORL LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), G RANNY SMITH PIEL (GS P) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS RESU LTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M) TABLA 15. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ÓRGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (C OL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO ( FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONT ROL DIETA NORMAL (DN ) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). CON EL RESPECTIVO ERROR DE LA MEDIA (E.M)

17 V. INTRODUCCIÓN La pérdida de competitividad del sector frutícola nacional le ha llevado a disminuir los márgenes de ganancia que tuvieron en el pasado reciente. Una de las razones, es la falta de inversión en la búsqueda de nuevas formas de agregar valor a los productos y solamente han aprovechado las ventajas competitivas que presenta nuestro país, como son las condiciones edafoclimáticas idóneas para la producción frutícola, acceso relativamente a fácil a agua para riego, baja presencia de plagas y enfermedades, entre otros factores. Por otra parte, la adopción de tecnologías traídas desde el extranjero ha sido un factor común en la agricultura nacional, lo que crea una alta dependencia a otros países que muchas veces son competidores. Esto ha motivado al Centro de Pomáceas (CP) a realizar investigaciones que puedan revertir esta situación, buscando nuevas fuentes de valor en productos no utilizados por la industria frutícola nacional, como son la fruta de raleo y los desechos de los procesos industriales en los que la materia prima es la manzana. Una de las características que presenta este fruto es la alta cantidad de antioxidantes de tipo fenoles presentes en la piel, lo que lo hace atractivo para realizar I + D en la obtención de un nuevo producto. Además, por investigaciones llevadas a cabo por el CP se conoce que los niveles de fenoles encontrados entre los 35 y 45 días después de plena flor son altos en comparación con otros estadios de desarrollo del fruto de la manzana. Lo que sumado, a que es la fecha en la que se realiza el proceso de raleo, ofrece una gran cantidad de material vegetal disponible y no aprovechado que puede ser de gran valor para combatir enfermedades crónicas como el cáncer, la diabetes y problemas cardiovasculares, que han aumentado su prevalencia, principalmente por el empeoramiento de los estilos de vida de las personas, en países como Chile. El objetivo de la tesis fue encontrar una metodología de extracción eficiente e inocua de antioxidantes, para el desarrollo de un extracto que pudiera ser administrado en el modelo animal de síndrome metabólico like. Con el fin de estudiar su comportamiento y con especial énfasis en los posibles resultados que se pudieran obtener beneficiosos que se pudieran extrapolar a personas, como por ejemplo revertir las diferentes manifestaciones de este síndrome, como son hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, diabetes, obesidad e hipertensión. 11

18 VI. HIPOTESIS La cantidad de fenoles y actividad de los antioxidantes proveniente de la piel de manzana y frutos pequeños de raleo es capaz de producir mejoras en la condición patológica que presenta un Modelo Murino de Síndrome Metabólico like. 6.1 OBJETIVO GENERAL Estudiar diversas variables agronómicas en fruto pequeño y subproductos de manzana que intervienen en la concentración de antioxidantes y su efecto en un Modelo Murino de Síndrome Metabólico-like. 6.2 OBJETIVO ESPECÍFICO Determinar un protocolo eficiente y saludable de extracción de antioxidantes fenólico con énfasis en quercetinas, sin la utilización de nitrógeno líquido y ultrasonido. Caracterizar los extractos mediante su capacidad antioxidantes y contenido de fenoles. Determinar si existe acción benéfica del extracto sobre el modelo animal y si esta es dependiente de la concentración de los antioxidantes. 12

19 VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Chile ha privilegiado la exportación de recursos naturales como la minería (principalmente cobre), salmón, productos forestales y la agricultura. A principios de los años noventa este fue una inyección importante a la economía nacional alcanzando registros de crecimiento nunca antes visto en la historia nacional, lo que fue ayudado de gran manera por el esfuerzo de los productores nacionales, el alto valor del dólar y la apertura de Chile hacia el mundo (Globalización). En los últimos años las diversas circunstancias financieras y económicas del mundo han incidido en la apreciación del peso local y la disminución del precio del dólar, lo que se ha traducido en una pérdida en la competitividad de los productos horto frutícolas nacionales. Uno de los factores que explican la disminución en la curva de crecimiento del país es que se está alcanzando el límite de los Factores Productivos, lo que se ha visto reflejado en el estancamiento en el crecimiento nacional, por lo que es necesario comenzar a buscar nuevas fuentes de creación de valor aprovechando las bases productivas ya instaladas, es por esto que si se desea seguir creciendo y mantener el nivel de liderazgo a nivel internacional que se ha alcanzado hasta el momento, es importante innovar para proporcionar valor agregado a sus productos. En el contexto de aumentar la cartera de los productos ofrecidos por Chile en el mercado mundial es necesario innovar para incrementar los retornos de los fruticultores en general, la comunidad científica nacional ha comenzado a estudiar los atributos que pueden tener diversos alimentos, por el envejecimiento de la población y los problemas que esto puede causar, principalmente por el aumento de enfermedades crónicas no transmisibles que esto acarrea y su correspondiente aumento en los costos de salud que se han experimentado en los últimos años, lo que se ha traducido en un cambio de enfoque de los consumidores de frutas y hortalizas en países desarrollados (principales mercado de destino de estos productos) y en nuestro país. Desde el punto de vista nacional, es prioritario realizar estudios que comprueben características que demandan los exigentes mercados internacionales en donde se exportan nuestros productos, por lo que se podrían obtener mejores precios de venta, y por otra parte se pueden identificar y aislar estos componente a partir de material de desecho (fruta de raleo, fruta con daño o 13

20 subproductos) para ser comercializado en forma independiente como un nuevo producto. Es por esto que la tendencia mundial se ha centrado en identificar los componentes biológicamente activos de los alimentos que puedan disminuir el riesgo de enfermedades (Diplock et al., 2007). Debido a lo anterior es que el interés de los productores nacionales se conjuga (aumento de ganancias) con las demandas de los mercados (mejorar calidad de vida en la vejez). Lo anterior, ha llevado al mercado de preocuparse de ciertas propiedades de los alimentos, es por esto que la manzana adquiere un importante rol, debido a que es uno de las principales frutos consumidos a nivel mundial y uno de los más importante frutales cultivados en el país, el cual representa una significativa fuente laboral y de ingresos, en especial en la región del Maule llegando a un 5% del PIB Regional, superado exclusivamente por la producción de celulosa (Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Por otra parte, la confirmación por medio de diferentes reportes encontrados en la literatura demuestran que la manzana posee una gran cantidad de antioxidantes, en especial fenoles (Huber & Rupasinghe, 2009; Lee, 2003; J. A. Yuri, et al. 2009). Lo anterior, se suma a que es una de las frutas que aporta una cantidad importante de antioxidantes fenólicos consumidos en la dieta de las personas, según estudios previos representa el 22% de los fenoles consumidos (Vinson, et al. 2001). Los compuestos fenólicos no son exclusivos de las manzanas, también existen en una gran cantidad de frutas y hortalizas (manzanas, arándanos, frutillas, frambuesas, cebollas, ajos, etc.). Con la finalidad de entender de mejor manera su formación en los organismos vegetales, se puede realizar una separación de acuerdo a sus características químicas, por lo que se pueden encontrar tanto como compuestos simples o complejos. Por lo que en organismos vegetales se pueden encontrar compuestos simples y complejos, como ejemplo de los compuestos simples se encuentran el ácido cafeico y el ácido clorogénico (Awad & de Jager, 2002). Ver FIGURA 1. FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA. OBTENIDO DESDE MANACH, ET AL

21 El principal fenol complejo que se pueden hallar son los flavonoides, que presentan como característica común 15 moléculas de carbono en su estructura (Ver FIGURA 1). A partir de los flavonoides se pueden obtener diversas moléculas derivadas como flavononas, flavonones, leucoantocianidinas, flavones y antocianidinas. Otras moléculas complejas son los biflavonilos que tienen un esqueleto de C 30, Benzofenonas, betacianinas y los taninos (Vermerris & Nicholson, 2007). Los principales compuestos fenólicos que se encuentran en las manzanas son Acido clorogénico, quercitina glucósido, quercetina xilosa, floricidina, procianidina B2, entre otras (Holderbaum, et al. 2010; Huber & Rupasinghe, 2009). La forma en que los organismos vegetales, incluidos las manzanas, sintetizan estos compuestos es mediante la conversión de fenilalanina, el cual es convertido a ácido shikimico por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL), que produce la deaminación de la fenilalanina resultando en ácido cinámico y posteriormente a ácido p- cumarico, el que sirve como precursor de las vías metabólicas relacionadas a la formación de los principales compuestos fenólicos en las manzanas. La composición fenólica se encuentra determinada por diversos factores, tanto dependiente de la planta como externos a ella. Dentro de los factores propios la ontogenia de la fruta uno de los indicadores más importantes que se ha podido corroborar son los niveles de ciertos compuestos fenólicos, como el ácido clorogénico, que aumentan en etapas tempranas. Algunos factores fisiológicos involucrados en estos procesos, que podrían explicar este comportamiento y que además se encuentran relacionados con el proceso de desarrollo de color, queda demostrada en el experimento desarrollado por Ju en En donde frutos pequeños al interior de bolsas con restricción de luz hasta cosecha, resultó en la inhibición de la síntesis de diversos compuestos de tipo flavonoides. Posteriormente, unas semanas antes de cosecha, se retiró la restricción de luz a los frutos, consiguiendo aumentar la concentración de la enzima chalcon sintasa (cataliza la reacción desde ácido cumárico y malonyl-coa a narigenin chalcona) lo que se tradujo en un aumento en la síntesis de flavonoides, llegando a niveles normales previo a la restricción de luz de los frutos. Otro dato importante es que 40 días después de plena flor se encuentran niveles elevados de compuestos fenólicos. Esta alza disminuye hasta encontrar los niveles más bajos 120 días 15

22 después de plena flor, lo que es explicado por un aumento de la actividades biosintética durante la fase de división celular y una alta actividad enzimática (Treutter, 2001; Mayr, et al. 1995). Otros factores que han sido estudiados y que determinan las cantidades de compuesto fenólicos en las manzanas, además del cultivar, son una serie de condiciones ambientales, nutricionales, etc. En condiciones naturales existe mayor presencia de antioxidantes fenólicos en la piel del fruto en comparación con otros tejidos (Drogoudi 2008). En relación a los cultivares, se ha determinado que entre ellas muestran distintas cantidades de estos compuestos, como fue demostrado por J. A. Yuri et al., (2009). Este trabajo muestra que existen diferencias considerables entre cultivares y regiones agroclimáticas, encontrando mayor diferencia en el cultivar Baeburn y mayor cantidad de antioxidantes en las regiones más frías. Otro factor que ha sido estudiado son las condiciones de almacenamiento, Napolitano demostró que existe un marcado aumento de antioxidantes principalmente catequinas y floricidina, cuando manzanas sanas son almacenadas en condiciones de frío, los cuales son atribuidos principalmente al aumento en la actividad de enzima fenilalanina amonio liasa, que es activada en condiciones de almacenamiento por la hormona etileno, con lo que se acumulan compuestos fenólicos principalmente en la piel. (Napolitano et al., 2004). Aunque estudios realizado por el Centro de Pomáceas indica que la ganancia de antioxidantes es solo marginal (Resultados no publicados), descartando la posibilidad de aumentar de manera controlada la cantidad de antioxidantes presentes en las manzanas posterior a largos periodos de almacenamiento. Por otra parte, en forma teórica se ha propuesto que el manejo agronómico también determina diferencias en la presencia y cantidad de antioxidantes fenólicos, como es el cultivo orgánico y tradicional (Brandt & Mølgaard, 2001). Esto debido a que los huertos orgánicos se encuentran expuesto a enfermedades, resultando en que los cultivos deben desarrollar sistemas de defensa y por consiguiente un aumento en los niveles de compuestos fenólicos. La bibliografía demuestra que no existen diferencias entre el manejo orgánico y tradicional de diversos huertos con la concentración de antioxidantes fenólicos en diversos cultivares (Red Delicious-Starking, Golden Delicious, Granny Smith, Jona Gold and Royal Gala) (Valavanidis, et al, 2009; J. Yuri et al., 2012). Otros manejos agronómicos que han sido estudiados y relacionados con la concentración de compuestos fenólicos, han determinado que consta una relación entre los niveles de fertilizantes utilizados y los niveles de antioxidantes, en donde se encuentra una mayor 16

23 concentración de nitrógeno en los frutos (producto de una alta cantidad de fertilización de nitrógeno) y una disminución de los compuestos fenólicos en los frutos.(awad et al, 2002; Wang & Lin, 2003). Esto no ocurre en todas las especies, el efecto negativo de la alta fertilización con nitrógeno en manzano, por ejemplo en frambuesa se ha demostrado que al aumentar la fertilización aumentan los niveles de acido elágico, kaempferol glicosidos, cianidina glicosido (Wang & Lin, 2003). Otro factor que altera la producción de compuestos fenólicos es el riego, se han visto diversas variaciones relacionadas en las concentraciones de antioxidantes presentes en los frutos (Cohen et al. 1994). La importancia de los antioxidantes y los compuestos fenólicos que se generan en la manzana, es su efecto en prevenir enfermedades crónicas que afectan a los seres humanos (Palomo et al. 2010). El número de publicaciones relacionada a estas investigación se ha incrementado en forma exponencial en la última década. Las razones son diversas pero se encuentran enfocadas a afrontar de mejor manera la última etapa de vida, en donde enfermedades crónicas como la diabetes miellitus, cáncer, patologías coronarias y cerebrovasculares, por citar algunas, están altamente relacionadas con el estrés oxidativo a los que se encuentran expuestos estos tejidos (Diplock et al., 2007). La literatura muestra que la alimentación y en especial algunos componentes de las frutas y v nberduras son capaces de disminuir la incidencia de enfermedades cardiovasculares. (Palomo G et al., 2011) Otra corriente de investigación es el efecto de los polifenoles en enfermedades cardiovasculares. Este tipo de patologías es una de las principales causas de muerte en las sociedades desarrolladas y en Chile, son causadas por aumento del consumo de dieta altas en colesterol, vida sedentaria, y por otro lado una disminución en el consumo de fruta y verduras. El consumo de polifenoles naturales proveniente de frutas y verduras ha demostrado tener un efecto benéfico en el sistema cardiovascular, principalmente en diversos tejidos o células como es el endotelio, el musculo liso vascular y las plaquetas (Perez-Vizcaino & Duarte, 2010). Lo que se traduce en una disminución de enfermedades relacionadas como son la hipertensión, ateroesclerosis, isquemia del miocardio y accidentes cerebrovasculares. Las acciones concretas son (Perez-Vizcaino et al 2006): 17

24 1) efectos vasodilatadores independientes de endotelio; 2) efecto de protección sobre el NO (oxido nítrico) y de la función endotelial bajo condiciones de estrés oxidativo; 3) efecto de antiagregante plaquetario;4) inhibición de la oxidación de LDL; 5) reducción de las moléculas de adhesión y otros marcadores inflamatorios; 6) prevención de oxidación neuronal y daño inflamatorio en el sistema nervioso central Un efecto que no ha sido estudiado en profundidad es la acción de los antioxidantes fenólicos provenientes de la manzana para contrarrestar el síndrome metabólico, y que ha sido asociado a un aumento en el riesgo cardiovascular (Eckel et al. 2005). Pero existe evidencia científica suficiente y en aumento, ha sugerido que los polifenoles provenientes de diversos organismos vegetales llevan a disminuir los riesgos de desarrollar el Síndrome Metabólico (Cherniack, 2011; Xia & Weng, 2010). Se denomina Síndrome Metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas constituidas por: obesidad central, disminución de la concentración de lipoproteína HDL, elevación de las concentraciones de triglicéridos, aumento de la presión arterial e hiperglicemia (Eckel et al., 2005). La importancia de este síndrome es debido a que es la antesala a diversas patologías más complejas como son diabetes, accidentes cerebrovasculares e infartos agudos al miocardio, siendo una de las principales causas de muerte a nivel nacional y mundial. El exceso de ingesta de energía es en gran parte responsable por este síndrome, llevando a un inadecuado procesamiento de dos componentes claves en el metabolismo energético del hombre, como son los lípidos y la glucosa. Esta sobreabundancia de energía se almacena en los adipocitos, los que en aumentar en número comienzan con la liberación de adipoquinas y citoquinas que afectan al sistema vascular (Galic, et al. 2010; Kershaw & Flier, 2004). La gran mayoría de estas moléculas liberan compuestos pro-inflamatorios como son factor de necrosis tumoral α (TNF α), interleuquina (IL) 6, 12, prote ína C reactiva, proteína quimioatractante de macrófago 1, los que se traducen en un aumento del stress oxidativo en los tejidos y células relacionados al sistema vascular, esto sumado al exceso de lípidos que se encuentran en circulación aumentan los factores para la generación de placas ateroescleróticas. Con todo lo anterior se logra un desbalance 18

25 energético e inflamatorio que enfermedades cerebrovasculares (Grundy, 2012). termina en diversas enfermedades crónicas como diabetes y La prevalencia de este síndrome varía, pero según la literatura se encuentra entre 15% y un 40%. Según la Fundación Internacional de Diabetes cerca de un cuarto de la población de países desarrollados presenta este síndrome (Cherniack, 2011). En Chile, la Encuesta Nacional de Salud realizada durante año 2003 por el Ministerio de Salud, en una población de individuos mayores de 17 años mostró que la prevalencia de SM fue de 22,6%, para hombres 22,6% y mujeres (23%,), pero siendo dependiente de la edad: años (17,9%), años (36,5%) y sobre 65 años (48%) (Ministerio de Salud, 2003). Los modelos experimentales en animales han sido ampliamente validados en la comunidad científica por entregar resultados en organismo complejos que pueden ser asimilables a la realidad que ocurre en humanos. En relación al Síndrome Metabólico, la especie animal más utilizado son los roedores. Éstos permiten un estudio fácil independiente del tiempo de duración y de los aspectos a investigar. Lo que sí, aunque permite realizar estudios en cortos periodos de tiempo y en ambientes controlados, existen diferencias entre el Síndrome Metabólico en ratones que en humanos, como por ejemplo los perfiles de HDL y LDL siendo diferente en ambos organismos (Kennedy, et al. 2010). En general, obesidad e insulina - resistencia coincide en los modelos en ratas. Un estudio realizado por Moore, se llevó a cabo para probar el efecto de una dieta alta en grasas y una dieta normal (25% y 4,4% de grasa, respectivamente), durante un período de 40 días, en ratones CF-1, en dos experimentos separados, para inducir la manifestación del SM, lo cual corresponde al denominado modelo murino de SM-like. Los parámetros medidos para estos efectos fueron el peso de los alimentos y agua ingeridos, el peso de los ratones y de sus órganos seleccionados (tejido adiposo, gastrocnemio, hígado y corazón), a su perfil bioquímico (glicemia, ácido úrico, nitrógeno ureico, triglicéridos, colesterol, proteínas y albúmina) y el porcentaje de grasa en el hígado (Moore-Carrasco et al., 2008). En los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en grasas, pero equilibrado en proteínas (16,9%), se evidenció niveles altos, estadísticamente significativos, de glicemia, colesterol, triglicéridos y en el peso del tejido adiposo. Estos 19

26 resultados llevan a la conclusión de que los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en grasas desarrollan alteraciones metabólicas que corresponden equivalentemente al SM. FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON SEPARADAS A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE 0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M NA 2HPO 4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 20, LDL EN FRACCIÓN Y HDL EN FRACCIÓN (A) PERFIL DE LI POPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL NORMAL DE LA PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1 ELUYE EN LA FRACCIÓN (C) PERFIL DE LI POPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR -/- Y RATAS APOE /-. (D) PERFIL DE LIPOPR OTEÍNA DE OBESAS LDLR -/- Y RATAS APOE /-. (KENNEDY ET AL., 2010) 20

27 VIII. METODOLOGÍA 8.1 RECOLECCIÓN Y EXTRACCIÓN La recolección del material vegetal se realizó en dos huertos ubicados en la comuna de Chimbarongo, Provincia de Colchagua, Región de O Higgins el 11 de noviembre de Para la obtención de la fruta con manejo tradicional se realizó en el Huerto propiedad de Orlando Barra en la localidad de Tingüirica (34º 44 L.S., 70º 57 L.O) y para el caso de manejo orgánico el huerto de propiedad de la empresa Viconto ubicado en la localidad de Codegua (34º 40 L.S., 70º 55 L.O.). En ambos huertos se recolectaron frutos de los cultivares Fuji y Granny Smith con una madurez de 40 días después de plena flor. Para el caso del huerto orgánico las características de plantación son un cuartel de de 7 hectáreas: 50% cv Fuji y 50% cv Granny Smith, con hileras orientadas en sentido oriente poniente, con un marco de plantación de 4,5 x 2,75 mts (808 plantas/ hectáreas). Para el caso del huerto tradicional, las condiciones de plantación son similares para la plantación orgánica. Para ambos huertos el sistema de recolección fue el mismo, de cada árbol se seleccionaron dos frutos, del cuadrante suroeste, se recolectaron un total de 2 Kg de material vegetal de cada cultivar/manejo. La piel de manzana fue obtenida a partir de los desechos obtenidos de la empresa SURFRUT, para los cultivares Granny Smith y Fuji. Las muestras fueron puestas en cámaras de frío a 1 C hasta el proceso de extracción de los antioxidantes. El protocolo de extracción fue definido, de acuerdo a los objetivos propuestos. Para este fin, se buscaran las diferentes condiciones para extraer la mayor cantidad de compuestos fenólicos a partir del material vegetal, en especial con un alto contenido de quercetinas. Las condiciones a modificar son: concentración de etanol, temperatura y tiempo de extracción. El protocolo inicial para la extracción fue el siguiente: a) Lavar las manzanas con agua destilada. b) Se pesarán alrededor de 10 gr de fruta completa (pulpa y piel). c) Posteriormente se les realizará un corte transversal por el centro de la fruta. 21

28 d) El material vegetal se colocarán en vaso precipitado a baja temperatura, para ser molida con máquina trituradora. Luego se determinará la mezcla etanol/agua que permita una mejor extracción de los compuestos fenólicos desde 0% etanol (100% agua) hasta 80% etanol (20% agua) e) Se seleccionará la temperatura óptima de extracción.. desde 0 C hasta 80 C, por un tiempo que se desea analizar desde las 2 horas, hasta las 24 horas, en agitación constante. f) Posteriormente, se separará la fase líquida mediante filtración al vacío, para cuantificar en ella la actividad antioxidante, contenido fenólico total y fenoles específicos por HPLC Se tomarán dos alícuotas de 2 ml para ser analizadas posteriormente por HPLC y cuantificar la cantidad de fenoles y actividad antioxidante (DPPDH). g) A continuación la fase líquida será concentrada mediante evaporador rotario a 55 C y 150 rpm. El concentrado obtenido será cuantificado, de la forma antes mencionada, y almacenado a -20 C. h) Por último, los extractos obtenidos del evaporador rotatorio serán liofizados, para posteriormente ser cuantificado, al igual que los productos de las etapas anteriores. i) Para el caso de la piel obtenida de SURFRUT, se aplicara la metodología establecida utilizando también 50 gramos. El protocolo descrito anteriormente es la base para la extracción, para determinar el protocolo definitivo se realizaron modificaciones de acuerdo a la concentración de extracción de etanol/agua, temperatura y tiempo de extracción. El protocolo definitivo será expuesto en el capítulo de Resultados. 8.2 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS Se prepararon 6 extractos: Orgánico Fuji (FO), Orgánico Granny Smith (GSO), Tradicional Fuji (FT), Tradicional Granny Smith(GST), Piel Granny Smtih (GSP) y Piel Fuji (FP) (ver capítulo metodología). En los primeros grupos se realizó el proceso de extracción en el mes de enero del En los otros dos, el proceso se realizó en el mes de junio. Ambos extractos fueron almacenados a -80 C, hasta realizar en ensayo en el modelo de Síndrome Metabólico like. 22

29 El proceso de extracción fue realizado de acuerdo a las condiciones preliminares establecidas. Se dividió en 3 etapas: extracción, concentración en evaporador rotatorio y liofilización. La primera, a partir de la fruta se realizó en 3 rondas de aproximadamente 400 gr de material vegetal, a excepción de la piel de manzana que se realizo en dos etapas Los volúmenes obtenidos en el proceso de extracción y posterior filtración al vacío fueron llevados a evaporador rotatorio, con dos objetivos: a) Recuperación del etanol ocupado en el proceso de extracción b) Disminuir el volumen de la muestra antes de pasar al proceso de liofilización. Las condiciones en el evaporador rotatorio fueron las siguientes: 150 rpm. a 50 C, el tiempo fue variable para cada extracto, se definió el punto de termino cuando el matraz dedicado a la acumulación de etanol se mantuvo constante debido a que en el extracto no existen residuos extraíbles por esta técnica. A continuación se prosiguió con el proceso de liofilización, siendo ostensiblemente más largo: Se tuvieron las muestras en ciclos de 10 horas diarias, en promedio 3 semanas. Los extractos preparados al ser liofilizados disminuyeron su volumen. Teniendo en cuenta que la administración de los antioxidantes a los animales de experimentación fue por el agua del bebedero, se decidió disolver las muestras liofilizadas en agua (la disolución en diferentes soluciones de etanol no fueron un éxito), en un proceso que se detalla a continuación: a) Los frascos en donde se liofilizaron las muestras fueron pesados previos a realizar el proceso de liofilización. b) Cuando las muestras finalizaron el proceso de liofilización, se procedió nuevamente que ser pesadas y se conoció la cantidad de extracto presente en cada una de las muestras por diferencia de peso. c) Posteriormente se agregaron 20 ml de agua en cada una de las muestras para poder disolver el liofilizado, esta solución fue puesta en agitación constante en agitador orbital por 3 horas a una velocidad de 50 rpm. 23

30 d) Por último, fue cuantificado el volumen de cada muestra resuspendida y se obtuvo una alícuota para la medición de fenoles y capacidad antioxidante para ser finalmente almacenada a -80 C. 8.3 CARACTERIZACIÓN QUÍMICA Para determinar el protocolo definitivo de extracción, se apoyara en técnicas colorimétricas de determinación de antioxidantes y HPLC. Se buscó tener un extracto con alto contenido de quercetinas glicosiladas o libres: a) Caracterización y cuantificación de los diferentes extractos mediante el ensayo de Folin Ciocalteu. Y por último, capacidad antioxidante mediante técnica basada en la estabilidad del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) b) Caracterización y cuantificación de los extractos para observar los diferentes metabólitos que se persigue obtener mediante HPCL con detector arreglo de diodo. Los protocolos son los siguientes: Fenoles: Mediante la técnica de Folin Ciocalteau, según lo descrito por Coseteng y Lee en (Coseteng & Lee, 1987). Se midió absorbancia a 640 nm, el resultado de compuestos coloreados obtenidos a partir de la reacción entre el reactivo Folin Ciocalteau en presencia de Na 2 CO 3, la cual es directamente proporcional a la cantidad de fenoles presente en el medio de reacción. El protocolo es el siguiente: 100 µl de muestra del extracto, se agrego 2,5 ml de agua destilada y 0,5 ml de reactivo Folin Ciocalteau, se agita en vortex y se deja incubar por 5 minutos. Por último, se agrego 0,5 ml de Na 2 CO 3, nuevamente se repitió la agitación y se incubo por 15 minutos. Finalmente se leyó absorbancia de las muestras a 640 nm. Las muestras se analizaron por duplicado. Se desarrollo una curva estándar de calibración en base a ácido clorogénico con concentraciones conocidas entre 0 y 0,125 mg, por lo que se obtendrá una ecuación de la recta de donde se interpolara las concentraciones de las muestras analizadas. Determinación de Actividad Antioxidante: La actividad antioxidante será determinada por el método del DPPH (radical 1,1 -difenil-2-picril-hidraxilo), según lo descrito por Von Gadow, 24

31 Joubert y Hansmann, (von Gadow, et al. 1997). Para todas las muestras se fijara en 8 min el tiempo de reacción. Se colocaran en el medio de reacción 10 µl de extracto con 2 ml de DPPH 8 x Se utilizaron diferentes concentraciones de ácido clorogénico como estándar para la curva de calibración (entre 2 y 25 µg/ tubo) y la captura del radical libre DPPH fue expresado de acuerdo a los mg de ácido clorogénico equivalentes a peso fresco -1 (PF) de manzana (fruto de raleo o piel). Etanol fue utilizado como blanco y todas las muestras se trabajaron en tubos con duplicado. Perfil HPLC de las muestras: Se inyectarán 20 µl de cada una de las muestras en instrumento Merck Hitachi, compuesto por una bomba LaCrhom -7100, un detector de arreglo de diodos modelo L 7455 LaCrhom, y una columna Kromasil 100 5C18 de 250 x 4,9 mm con precolumna de iguales características, termotizadas a 20 C. Para la identificación de los compuestos se usaron estándares de distintos antioxidantes (fenoles, quercetinas, etc.) y los espectros UV Vis de la biblioteca del equipo. El cromatograma será monitoreado a 4 diferente longitudes de onda (. Los solvente de la fase móvil serán: a) ácido fòrmico al 1% en agua calidad HPLC; b) acetonitrilo/h 2 O (40%) y c) acetonitrilo. La elución se efectúo mediante el siguiente programa: tiempo 0 10 minutos: a (70), b (30), c (0) flujo de 1 ml minuto -1 ; tiempo 45 minutos: a (25), b (75), c (0) flujo 0,5 ml minuto -1 ; tiempo 52 minutos: a (0), b (0) y c (100) flujo de 1 ml minuto ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para la determinación de la metodología de extracción, se utilizó ANOVA con un post test de Tukey en el programa SPSS versión 15. Para el análisis de los resultados obtenido en el modelo animal se utilizó el programa GraphPad 5.0, con un test estadístico de ANOVA y un post-test de Newman-Keuls y Bonferroni. P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Además se utilizará un análisis multivariable (Colesterol Total, Colesterol LDL, Colesterol HDL, Trigliceridos, evolución del peso para tejido adiposo blanco), con esto podremos agrupar y realizar conclusiones para definir si los extractos son capaces de influir en el metabolismo lipídico de los animales disminuyendo o no los valores de colesterol (total, LDLy HDL), este fue realizado por el programa estadístico Statgraphics Centurion XV. 25