Introducción. Beatriz Alvarez Laboratorio de Enzimología

Transcripción

1 Introducción Beatriz Alvarez Laboratorio de Enzimología

2 Curso de Enzimología 2010 Coordinación: Beatriz Alvarez, Fecha: Segundo semestre, del 7 de setiembre al 11 de noviembre. Teóricos: 2 teóricos semanales de 2 horas cada uno, los días martes y jueves de 10 a 12 horas, salón 107. Total de horas de teórico: 40 horas. Prácticos: 1 práctico por semana de 4 horas, los días martes o los días jueves, de 13 a 17 horas, en el salón 304 o en los Laboratorios de Enzimología y Fisicoquímica Biológica. Total de horas de práctico: 40 horas. Créditos: (40*2 + 40*1.5)/15 = 9.3 Ganancia del curso: El curso se ganará por asistencia a los prácticos y aprobación de los correspondientes informes. Evaluación: Examen. Cupo: 40 estudiantes. Apoya PEDECIBA Biología. Auspicia PEDECIBA Química.

3 Material para el curso, protocolos de práctico, repartidos de ejercicios: Subespacio

4 Temas Introducción. Cinética enzimática. Efectos del ph. Efectos de la temperatura. Inhibición. Reacciones de dos sustratos. Cinética preestacionaria. Mecanismos. Regulación y cooperatividad. Sistemas multienzimáticos.

5 Objetivos Estudio sistemático de diferentes temas de enzimología que permitan una aproximación a la pregunta: cómo funcionan las enzimas? Curso dirigido a estudiantes avanzados y de posgrado que provee de conceptos de cinética enzimática y mecanismos, así como de herramientas prácticas para el trabajo con enzimas.

6 Textos de Bioquímica Bibliografía Lehninger, Stryer, Voet (Bioquímica), Mathews, Devlin, Zubay Segel, Biochemical calculations, John Wiley (1976) Textos de Enzimología Dixon and Webb, Enzymes, Longman (1979) SUBESPACIO Fersht, Structure and mechanism in protein science, Freeman (1999) Cornish-Bowden, Fundamentals of enzyme kinetics, Portland (1995) Segel, Enzyme kinetics, Wiley (1993) Methods in Enzymology, volúmenes 63, 64, 87, 249, Academic Press. Price and Stevens, Fundamentals of enzymology, Oxford (1989) Frey and Hegeman, Enzymatic reaction mechanisms, Oxford (2007) Eisenthal and Danson, Enzyme Assays, A Practical Approach, Oxford (2002) Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, Dover (1987). Incluye el capítulo de 1975 The Circe Effect.

7 RECURSOS DE RED Brenda Manual Worthington ExPASy Proteomics Server (DE TODO!) ExPASy Enzyme Nomenclature Database ExPASy Metabolic Pathways Enzyme Structures Database Enzyme Nomenclature PubMed Protein Data Bank

8 Las enzimas son catalizadores biológicos. Un catalizador es una sustancia que acelera la velocidad de una reacción y se recupera incambiado. La catálisis biológica tiene gran importancia: El azúcar puede guardarse por años. Sin embargo, nos sirve como fuente de energía en segundos, gracias a la catálisis.

9 Reseña histórica La especie humana no demoró mucho en aprender a aprovechar el poder catalítico de las enzimas, por ejemplo, para procesar alimentos (queso, pan, cerveza, vino). La referencia más antigua acerca de la utilización de enzimas es la elaboración de vino en el Código de Hammurabi (2100 AC, Babilonia). I enzymes

10 La comprensión de los mecanismos como actúan las enzimas evolucionó de estudios acerca de la fermentación alcohólica realizados en el siglo XIX. La historia de la enzimología es la historia de la bioquímica.

11 Jöns Jakon Berzelius 1837, Suecia El concepto de catálisis "Tenemos una nueva fuerza que pertenece a la Naturaleza orgánica e inorgánica, que provoca reactividad química... reordenando los componentes de una sustancia hacia otras relaciones sin necesariamente cambiar sus propios componentes..."

12 Pasteur y Liebig Están vivas las enzimas?

13 Justus von Liebig famoso por inventar los laboratorios para estudiantes Alemania, 1839 Teoría química de la fermentación "Los átomos de un cuerpo en putrefacción, el fermento, están en continuo movimiento; cambian sus posiciones y forman nuevas combinaciones. Estos átomos móviles están en contacto con los átomos del azúcar, que está unida solo por fuerzas débiles. El movimiento de los átomos del fermento no puede pasar sin efecto sobre los átomos del azúcar. O se anula el movimiento o el azúcar se moverá también. Así el azúcar sufre un desplazamiento de sus átomos que se rearreglan para formar alcohol y dióxido de carbono." Liebig creía que la fermentación era causada por la trasmisión de vibración de los fermentos al material a fermentar.

14 Louis Pasteur Francia, 1858 Teoría de la "fuerza vital" "Veo en el hecho de la fermentación un fenómeno relativo a la vida -un hecho fisiológico- que origina múltiples productos, todos los cuales son necesarios para la célula. Creo que no existe fermentación sin que haya, simultáneamente, la organización, el desarrollo y la multiplicación (es decir el crecimiento) de la levadura u otros glóbulos, o al menos la continuación de la vida de los glóbulos que ya estaban presentes. La totalidad de los resultados me parece en oposición a las opiniones de M. Liebig." Pasteur creía que la fermentación era inseparable de las células vivas.

15 De dónde sale el nombre ENZIMA? El nombre "enzima" fue acuñado en 1878 por Fredrich Wilhelm Kühne. Proviene del griego: en (dentro de) + zima (levadura). Enfatiza que hay algo en la levadura, por oposición a la levadura misma, que cataliza los procesos, y distingue las enzimas de los organismos que las producen.

16 Hans y Eduard Büchner Alemania, 1897 Las enzimas son moléculas (Nobel 1907) "Respecto a la teoría de la fermentación ahora podemos hacer la siguiente afirmación: NO es necesario tener un aparato tan complicado como la célula viviente de una levadura para que se lleve a cabo la fermentación. Más bien un fermento soluble, o enzima, se considera el portador de la actividad fermentativa del jugo de la prensa. Llamaremos a este agente subcelular de la fermentación zimasa." Los hermanos Buchner observaron que extractos libres de células son capaces de realizar la fermentación del azúcar a etanol y dióxido de carbono.

17 (Nobel 1902) Emil Fischer Alemania, 1894 Las enzimas son selectivas Hipótesis llave-cerradura El efecto específico en los glucósidos puede ser explicado asumiendo que el contacto íntimo entre las moléculas, necesario para la liberación de la reacción química, es posible solo con configuraciones geométricas similares. Para ilustrarlo diré que la enzima y el glucósido encajan uno en el otro como una llave y una cerradura... Las enzimas puedenas distinguir entre diferentes estereoisómeros de azúcar. Las enzimas consisten en "moléculas construidas asimétricamente". Así, "la enzima y el sustrato encajan uno en el otro como una llave en una cerradura".

18 Las enzimas son proteínas James Sumner (Estados Unidos) Cristaliza la ureasa y obtiene sólo aminoácidos cuando la hidroliza (Nobel 1946). John Northrop (Nobel 1946) y Moses Kunitz Northrop cristaliza la pepsina. Cristalizan enzimas digestivas y comprueban que la actividad biológica no se puede separar de la proteína.

19 COENZIMAS Y COFACTORES Las enzimas son proteínas. La actividad catalítica depende de la integridad de la estructura y de que la proteína no esté desnaturalizada. Los grupos funcionales de los aminoácidos participan en la catálisis. Muchas enzimas no requieren nada más, pero algunas enzimas requieren un cofactor. Los cofactores pueden ser iones metálicos o coenzimas orgánicas. Si el cofactor está unido muy fuertemente o covalentemente se denomina grupo prostético. apoenzima + cofactor = holoenzima

20 NOMENCLATURA En general, las enzimas se nombran agregando el sufijo asa. Ej: ureasa, lactato deshidrogenasa. Este sufijo proviene del nombre del extracto de malta que hidrolizaba almidón en el siglo XIX, diastasa. La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular propone clasificar y nombrar las enzimas de acuerdo a las reacciones químicas que catalizan.

21 Clasificación Tipo de reacción catalizada 1. Oxidorreductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Liasas 5. Isomerasas 6. Ligasas Reacciones redox Transferencia de grupos funcionales Reacciones de hidrólisis Eliminación de grupos para formar dobles enlaces Isomerización Formación de enlaces acoplada a la hidrólisis de ATP

22 Cada enzima pasa a tener: Un nombre recomendado, generalmente el nombre trivial histórico. Un nombre sistemático: nombre del sustrato seguido por el tipo de reacción. Un número formado a su vez por 4 números: EC _._._._ carboxipeptidasa A peptidil-l-aminoácido hidrolasa EC EC indica Enzyme Commission El primer número indica la clase: hidrolasa El segundo indica subclase: actúa en enlaces peptídicos El tercero, la subsubclase: metalocarboxipeptidasa (Zn 2+ ) El cuarto es un número arbitrario en la subsubclase alcohol deshidrogenasa alcohol:nad + oxidorreductasa EC

23 A diferencia de otros catalizadores químicos, las enzimas se caracterizan por: 1. Altísimo poder catalítico. 2. Condiciones de reacción suaves. 3. Alta especificidad por el sustrato (reactivo) y por los productos de la reacción. 4. Su actividad puede ser regulada. 5. Pueden acoplar transformaciones de energía.

24 Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Aceleran las reacciones por factores de 10 5 a Consideremos 10 9 como promedio. Cuánto es 10 9? Por ejemplo, un estudiante tiene 21 años. 21 x 10 9 = 21 mil millones de años = 21,000,000,000 años.

25 Enzyme Nonenzymatic half-life Uncatalyzed rate (k un, s -1 ) Catalyzed rate (k cat, s -1 ) Rate enhancement (k cat /k un ) OMP decarboxylase Staphylococcal nuclease 78,000,000 years 130,000 years AMP nucleosidase Carboxypeptidase A Ketosteroid isomerase 69,000 years years weeks , TPI isomerase 1.9 days , Chorismate mutase Carbonic anhydrase 7.4 hours seconds

26 Especificidad de la glucosa oxidasa por el sustrato glucosa + O 2 ácido glucónico + H 2 O 2 Azúcar β-d-glucosa 2-desoxi-D-glucosa 6-desoxi-6-fluoro-D-glucosa 6-metil-D-glucosa D-manosa α-d-glucosa D-fructosa sacarosa glucosa-6-fosfato Velocidad relativa

27 Sitio activo Los sustratos se unen a una región específica de la enzima denominada sitio activo para formar el complejo enzima-sustrato. La idea de complejo enzima-sustrato surge de experimentos con invertasa a fines del siglo XIX. O Sullivan y Thompson, en 1890, ven que la resistencia térmica de la invertasa aumenta cuando hay sacarosa. Brown, en 1892, relaciona la cinética de saturación con la formación de un complejo enzima-sustrato, deduce que cuando se alcanza la velocidad máxima, toda la enzima está como ES. Chance, en 1943, ve por primera vez un complejo enzimasustrato. En este trabajo utiliza por primera vez espectrofotometría de flujo detenido y simulaciones numéricas.

28 Qué características tienen los sitios activos? 1. El sitio activo ocupa una porción pequeña de la proteína. Unión de la quimotripsina a su sustrato

29 2. El sitio activo es una entidad tridimensional formada por grupos funcionales que provienen de diferentes partes de la secuencia proteica. Lisozima y diferentes residuos de su sitio activo

30 3. Los sustratos se unen a las enzimas por múltiples uniones débiles. - Interacciones de van der Waals. - Interacciones electrostáticas - Puentes de hidrógeno - Interacciones hidrofóbicas Las constantes de equilibrio de los complejos ES van de 10-2 a 10-8 M, lo cual corresponde a energías libres entre -3 y -12 kcal/mol, considerando que ΔGº' = -RT ln K' eq.

31 Interacciones entre la quimotripsina y el sustrato

32 3. Los sitios activos son ranuras o hendiduras. En general, tienen carácter no polar, excluyen el agua, y tienen ciertos residuos polares, de tal forma que constituyen un microambiente.

33 5. La unión del sustrato depende de una disposición definida de átomos en el sitio activo. El sitio de unión al sustrato puede existir en ausencia de sustrato (hipótesis de llavecerradura de Emil Fischer). O puede formarse el sitio de unión al unirse el sustrato (hipótesis de encaje inducido de Daniel Koshland).

34 Encaje inducido Estructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP

35 Cómo lo hacen? La cuestión fundamental de la enzimología es comprender cómo hacen las enzimas para ser catalizadores tan potentes y específicos

36 Las enzimas son catalizadores, aceleran la velocidad de la reacción pero no alteran la posición del equilibrio. ΔGº' = -RT ln K' eq

37 Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935) La teoría del estado de transición relaciona la velocidad de una reacción a la diferencia en energía libre entre el estado basal y el estado de transición. La transformación de S en P ocurre a través de la formación de un estado de transición S*. K* k S S* P La energía de activación de Gibbs ΔG* es la diferencia de energía entre el estado de transición y el sustrato. La velocidad k es proporcional a [S*], la cual a su vez depende de K*. [S*] = [S] e -ΔG*/RT (pues ΔGº' = -RT ln K' eq ) k = k B T/h e -ΔG*/RT donde k B es la constante de Boltzmann y h es la constante de Planck.

38 Teoría del estado de transición (Henry Eyring, 1935) k = (k B T/h) e -ΔG*/RT La velocidad de una reacción aumenta cuando la energía de activación, ΔG*, disminuye. A su vez, ΔG* tiene un componente de entropía y un componente de entalpía: ΔG* = ΔH* -TΔS* k = (k B T/h) e -ΔS*/R e -ΔH*/RT La energía de activación puede ser grande y la reacción lenta cuando el estado de transición es demasiado energético u ordenado. ΔH* es siempre positivo porque se requiere energía para reorganizar los enlaces. ΔS* puede ser negativo o positivo dependiendo si el estado de transición tiene más o menos grados de libertad.

39 Las enzimas aceleran las reacciones porque estabilizan el estado de transición y bajan la barrera de activación. La unión de la enzima al sustrato genera una nueva vía de reacción en la que la energía del estado de transición es menor que en ausencia de enzima

40 El poder de las enzimas deriva de la energía de unión entre la enzima y el sustrato. Esta energía surge de las múltiples interacciones débiles entre la enzima y el sustrato, y contribuye a la catálisis y a la especificidad. Las interacciones débiles entre la enzima y el sustrato se optimizan en el estado de transición. Los sitios activos de las enzimas no son complementarios a los sustratos sino que son complementarios a los estados de transición. Se establecen interacciones débiles entre la enzima y el sustrato, pero éstas son optimizadas en el estado de transición. La energía liberada en el establecimiento de estas interacciones débiles hace disminuir la barrera de activación.

41 sin enzima con enzima complementaria al sustrato con enzima complementaria al estado de transición

42 Los análogos del estado de transición son inhibidores competitivos de alta afinidad. Ejemplo: prolina racemasa bacteriana El estado de transición es planar. Por lo tanto, análogos planos de la prolina actúan como inhibidores competitivos muy potentes.

43 Análogos de estado de transición

44 Proteasas de serina Se unen preferentemente al intermediario tetraédrico.

45 Si una enzima acelera la velocidad de una reacción por un factor de 10 9, cuánto debe bajar la barrera de activación? Haciendo cuentas con la ecuación k = (k B T/h) e -ΔG*/RT podemos concluir que para acelerar la reacción por un factor de 10 9, la barrera de activación debe disminuir 12 kcal/mol.

46 Cuánta energía se libera con una estas uniones? - Interacciones de van der Waals. - Interacciones electrostáticas - Puentes de hidrógeno - Interacciones hidrofóbicas La energía que se libera al establecerse una de estas uniones débiles es de 1-7 kcal/mol. Por lo tanto, la formación de múltiples uniones débiles a nivel del estado de transición puede dar cuenta de las aceleraciones observadas.

47 La energía de unión entre la enzima y el sustrato puede utilizarse para bajar el componente entrópico de la barrera de activación (ΔG* = ΔH* -TΔS*) Uno de los aspectos más importantes de la catálisis enzimática es la entropía. Las reacciones en solución son lentas porque la aproximación de los reactivos implica una pérdida importante de entropía. Las reacciones enzimáticas están confinadas al sitio activo. Los grupos que reaccionan forman parte de la misma "molécula", el sitio activo, por lo cual no hay pérdidas de entropía traslacional o rotacional al formarse el estado de transición. La enzima, al unirse al sustrato, logra que los reactivos estén próximos, inmovilizados y alineados óptimamente para reaccionar. Esta ventaja entrópica "se paga" con la energía de unión entre la enzima y el sustrato.

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49 Además de los ya mencionados: 1. catálisis por efecto de proximidad y orientación 2. catálisis por unión preferencial de estado de transición Determinados grupos funcionales alineados apropiadamente en el sitio activo contribuyen a la catálisis mediante los siguientes mecanismos: 3. catálisis general ácido-base 4. catálisis covalente 5. catálisis por iones metálicos 6. catálisis electrostática

50 Catálisis general ácido base Un grupo de la enzima participa como aceptor o dador de protón, estabilizando intermediarios cargados inestables. a) no catalizada b) Catálisis general ácida b) Catálisis general básica

51 Catálisis covalente Un grupo del sitio activo de la enzima, generalmente un buen nucleófilo, reacciona covalentemente con el sustrato modificándose transitoriamente.

52 Catálisis por iones metálicos 70 % de las enzimas necesitan metales! Algunas formas por las cuales los metales participan en la catálisis: 1. Uniéndose a los sustratos para orientarlos correctamente. 2. Mediando reacciones redox a través de cambios en el estado de oxidación del metal. 3. Estabilizando cargas negativas.

53 Catálisis electrostática En el sitio activo de las enzimas, las interacciones electrostáticas son muy fuertes porque el agua está excluida y las constantes dieléctricas son bajas. La distribución de cargas en el sitio activo es tal que estabiliza los estados de transición.

54 Qué se preguntan hoy en día los enzimólogos? La revolución de la ingeniería genética y los datos de estructura cristalográfica han vuelto disponibles muchísimos datos. Se ha avanzado mucho en la elucidación de mecanismos enzimáticos y en la base estructural de la catálisis. Los ejemplos más estudiados ponen de manifiesto que es necesaria información estructural, cinética y mecanística para comprender un determinado sistema enzimático. Pero, qué queda por responder? Aún no se cuenta con explicaciones cuantitativas para los altos niveles de catálisis. Los efectos de estabilización del estado de transición, efectos de proximidad, catálisis ácidobase, etc., quedan cortos.

55 Repaso de cinética

56 REPASO DE CINÉTICA QUÍMICA Una reacción ocurre en una serie de pasos individuales. Cada uno de estos pasos se denomina reacción elemental. Una reacción de estequiometría A P puede ocurrir a través de una secuencia de reacciones elementales A Ia Ib P que describen el mecanismo. En una reacción elemental, el número de especies que se combinan para formar el estado de transición se denomina molecularidad. En general las reacciones son unimoleculares o bimoleculares. Excepcionalmente, termoleculares.

57 A una temperatura determinada, la velocidad de una reacción elemental es proporcional a la concentración de especies que participan, pues depende de la frecuencia con que se encuentran las moléculas. Convención de la IUPAC: aa + bb +... pp + qq d[a] 1 d[b] 1 d[p] 1 d[q] v = - = - = = = k a dt b dt p dt q dt a b [A] [B] El orden de una reacción es la suma de los exponentes de los factores de concentración en la ley de velocidad. Debe ser determinado experimentalmente. Para una reacción elemental, el orden es igual a la molecularidad.

58 REACCIONES DE ORDEN UNO A P d[a] d[p] v = - = = k dt dt [A] Integrando entre t = 0 y t: [A] = [A] o exp (- kt ) ln [A] = ln [A] o - kt [P] = [A] o [1 - exp (- kt )] [Producto] Tiempo En una reacción de orden uno, la vida media es constante e independiente de la concentración inicial, t 1/2 = ln2/k

59 REACCIONES DE ORDEN DOS, v = k [A] 2 2 A P 1 d[a] v = - = k 2 dt [A] 2 [A] = 1 + [A] [A]0 1 1 = + 2 [A] [A] kt kt

60 REACCIONES DE ORDEN DOS A + B P d[a] v = - = k [A][B] dt [B] [B] 0 ln = ln + k([b] 0-[A] 0) t [A] [A] 0 Ahora, si [B] 0 >> [A] 0 la reacción es de pseudo primer orden y la constante de velocidad aparente es k = k[b] 0. [Producto] [P] = [A] o [1 - exp (- kobst)] k = k[b] obs 0 k obs Tiempo [B] 0

61 REACCIONES DE ORDEN CERO d[a] v = - = k dt [A] = [A] 0 - kt

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63 Cómo puede determinarse el orden de reacción? Método integral: Se observa cómo varía la concentración de producto (o reactivo) a lo largo del tiempo, hasta completitud. Se ve cómo ajusta a la ecuación de velocidad integrada, por ejemplo, a una función exponencial. Método de las velocidades iniciales: Se observa la formación de concentraciones muy pequeñas de producto, durante un período en el cual las concentraciones de reactivos se mantienen constantes.

64 DIMENSIONES Concentraciones en M Velocidades en M s -1 Constantes de velocidad de primer orden en s -1 Constantes de velocidad de orden dos en M -1 s -1 PASO DETERMINANTE DE LA VELOCIDAD En una reacción compleja, si un paso es mucho más lento que los otros, la velocidad del proceso será la del paso lento.

65 REACCIONES CATALIZADAS ENZIMÁTICAMENTE Las reacciones catalizadas enzimáticamente no tienen un orden de reacción simple. Sin embargo, los pasos individuales sí tienen órdenes simples. Unión de enzima a sustrato E + S ES proceso bimolecular de orden dos Transformación del complejo ES en producto ES E + P proceso unimolecular de orden uno

66 Cinética enzimática

67 Historia Las velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamente fueron estudiadas por primera vez a fines del Siglo XIX. Estudios con invertasa: sacarosa + H2O glucosa + fructosa O Sullivan y Thompson (1890) ven que la velocidad depende de la acidez y que es proporcional a la cantidad de enzima. La resistencia térmica aumenta en presencia del sustrato sacarosa. Brown (1892) ve que la velocidad primero aumenta con la concentración de sacarosa y luego se vuelve independiente. Pone el concepto de complejo ES en términos cinéticos. Problemas experimentales: control de ph y mutarrotación de la glucosa. No se pudo progresar hasta que se controló el ph. Concepto de amortiguadores y escala de ph: Sorensen, 1909.

68 Michaelis y Menten deciden hacer experimentos más prolijos 1. Fijan el ph con amortiguador acético. 2. Consideran la mutarrotación de la glucosa. 3. Miden velocidades iniciales

69 Hoy en dìa, cómo se determina la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente? ph y temperatura constantes, amortiguador se adiciona sustrato y enzima a una solución amortiguadora y se mide la desaparición de sustrato o la aparición de producto se puede seguir una propiedad física que varíe en forma proporcional a la concentración métodos continuos o discontinuos (de muestreo) se determina la velocidad inicial, v 0 v 0 = d[p]/dt = -d[s]/dt a tiempo cero

70 Cuando se está en velocidad inicial, las gráficas de concentración de producto en función del tiempo son lineales. VELOCIDAD INICIAL Los enzimólogos casi siempre determinan velocidad inicial, v0. Esto es muy importante, pues se evita que la enzima se inactive, que se consuma sustrato, que cambie el grado de saturación de la enzima, que ocurra la reacción reversa, que haya inhibición por producto. En general, cuando se está en velocidad inicial, reaccionó menos de 10% del sustrato.

71 Experimentalmente, los primeros enzimólogos encuentran que: V 0 V 0 [enzima] [sustrato] - la velocidad inicial varía en forma lineal con la concentración de enzima - la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la concentración de sustrato

72 Para empezar a derivar la ecuación de Michaelis y Menten k 1 k2 E + S ES E + P k-1 d[s] d[p] v = - = = dt dt k [ES] 2 Asumimos: velocidades iniciales [S] T = [S] + [ES] como [S] T >> [E] T entonces [S] T = [S] [E] T = [E] + [ES]

73 Hipótesis de equilibrio (Michaelis y Menten, 1913) ES está equilibrio con E y con S Equilibrio de disociación: ES E + S k1[e][s] = k-1[es] [E][S] [ES] k -1 = = k1 como [E] = [E]T [ES] K S [E][S] = K S= [ES] ([E] T - [ES]) [S] [ES] despejando [ES] [E] [S] T [ES] = K S + [S] entonces [E] [S] T v = k 2 [ES] = k 2 = K S + [S] V max [S] K + [S] S donde Vmax = k2 [E]T y K = s k k -1 1

74 Hipótesis de estado estacionario (Briggs y Haldane, 1925) ES está en estado estacionario d[es] = 0 = k 1 [E][S] - k -1 [ES] - k 2 [ES] dt k [E][S] = (k + k ) [ES] [E][S] [ES] k + k -1 2 = = KM k1 [E][S] = K M= [ES] ([E] T - [ES]) [S] [ES] despejando [ES]: [E] [S] T [ES] = K M + [S] entonces [E] [S] T v = k 2 [ES] = k 2 = K M + [S] V max [S] K + [S] M donde Vmax = k2 [E]T y K = M k + k k

75 En suma: k E + S 1 ES k2 E + P k -1 V [S] v = max K + [S] M V = k [ E] max 2 T K = M k + k -1 2 k 1

76 Del repartido de ejercicios 12. Para una enzima michaeliana, cuánto debe aumentar la concentración de sustrato para que la velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? Y si la enzima presenta cooperatividad positiva?

77 13. La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa con un K M de 0.13 mm. glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP. a. Qué fracción de V max se observaría cuando la concentración de glucosa corresponde al valor fisiológico de 5 mm? b. Cuando la glucosa se une a la enzima, ésta sufre un cambio conformacional. Recién entonces puede unirse el ATP a la enzima. Qué sentido tiene este fenómeno?

78 Cómo se determinan los parámetros cinéticos (K M, V max y V max /K M ) de una reacción catalizada enzimáticamente? Midiendo la velocidad inicial para concentraciones crecientes de sustrato.

79 Cómo determinamos K M, V MAX y V MAX /K M? V MAX error bars 5% V MAX 1/v 0 v 0 Tratemos de no usar la linealización del doble recíproco de Lineweaver-Burk! K M Slope = V MAX /K M [Substrate] X Slope = K M /V MAX [Substrate]/v 0 Slope = 1/V MAX 1/V MAX 1/[Substrate] Lineweaver-Burk plot K M /V MAX [Substrate] Hanes or Woolf plot From Cornish-Bowden, 1995, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press.

80 Qué significan K M, V max, k cat y k cat /K M?

81 K M K M = [S] cuando v = ½ V max tiene unidades de concentración (M) k -1 + k2 K M = k Si k 2 << k -1, K M = K S 1 Ks representa la afinidad entre la enzima y el sustrato, pues es la constante de equilibrio de disociación K M representa una constante aparente de disociación, [E][S] pues K M= Σ [ES] cuanto más pequeño sea K M, hay menos enzima libre y más complejo enzima-sustrato

82 En suma: K M es una constante aparente de disociación que puede ser considerada como la constante de disociación global de todas las especies enzima-sustrato.

83 k cat V max = k cat [E] T entonces k cat = V max / [E] T en un mecanismo simple, k cat = k 2 y representa el proceso de primer orden de transformación de ES en P en un mecanismo complejo, representa el límite inferior de las constantes de velocidad de la transformación de ES en P unidades de tiempo -1 (s -1 ) es el número de recambio (turnover number), máximo número de moléculas de S que se transforman en P por unidad de tiempo y por sitio activo.

84 En suma: k cat es una constante de primer orden que se relaciona con las propiedades del complejos enzimasustrato (incluyendo enzima-intermediario y enzimaproducto).

85 k cat /K M como [E][S] K =, la ecuación de Michaelis y Menten [ES] M puede escribirse cat v = k cat [ES] = [E][S] KM k cat /K M representa la constante aparente de orden dos para la reacción de la enzima y el sustrato tiene unidades de M -1 s -1 debe ser menor o igual que las constantes de orden dos en el mecanismo da idea de la eficiencia catalítica, puede llegar a ser igual a k 1 y estar limitada por difusión kcat k2 k 1 k2 = = K k M -1+k2 k -1+k2 k 1 da idea de la especificidad de la enzima por el sustrato E A P v = k [EA] = (k /K ) [E] [A] A A cat cat M A E B P B v B = k cat [EB] = (k cat/k M) B [E] [B] v A (k cat/k M) A [A] = v (k /K ) [B] B cat M B k

86 En suma: k cat /K M es una constante aparente de orden dos que se relaciona con las propiedades de la enzima libre y el sustrato libre.

87 Algunos valores Enzima Sustrato K M (M) k cat (s -1 ) k cat /K M (M -1 s -1 ) Acetilcolinesterasa Anhidrasa carbónica Acetilcolina 9.5 x x x10 6 CO x x10 7 Catalasa H 2 O x x 10 8 Fumarasa Fumarato 5.0 x x 10 8 Ureasa Urea x x 10 5

88 Enzimas glicolíticas Enzima Sustrato Glucosa 6-P isomerasa G6P Aldolasa FBP Triosafosfato isomerasa G3P Gliceraldehído 3P deshidrogenasa G3P Fosfoglicerato quinasa 3PG Fosfoglicerato mutasa 3PG Enolasa 2PG Piruvato quinasa PEP Glicerol fosfato deshidrogenasa GP Lactato deshidrogenasa Pyr [S] (µm) K M (µm) Las enzimas que quieren maximizar la velocidad evolucionan de tal forma de maximizar k cat /K M y de que K M sea mayor que [S], la concentración fisiológica de sustrato, pues v = k cat /K M [E] [S]. (Ideas desarrolladas por Alan Fersht)

89 Del repartido de ejercicios: 14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. a) Una enzima participa en la reacción alterando la constante de equilibrio de la reacción, sin alterar la barrera de activación (Ea). b) El sustrato con menor valor de K M tiene la mayor afinidad aparente por la enzima. c) Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas. d) El número de recambio (k cat ) es el número de moles de sustrato transformado por minuto por mol de centro activo. e) La catálisis puede ser explicada por una unión tipo llave y cerradura entre el sustrato y la enzima. f) La velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente es independiente de la concentración de sustrato. g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentración de enzima. h) El K M equivale a la concentración de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la máxima. i) El K M varía con la concentración de enzima.

90 Experimentalmente, se encuentra que: V 0 V 0 [enzima] [sustrato] - la velocidad inicial varía en forma lineal con la concentración de enzima - la velocidad inicial depende hiperbólicamente de la concentración de sustrato

91 k E + S 1 ES k2 E + P k -1 V [S] v = max K + [S] M V = k [ E] max 2 T K = M k + k -1 2 k 1

92 k E + S 1 ES k2 E + P k -1 [Producto] Velocidad inicial o de estado estacionario Tiempo (s) [Producto] [Producto] Tiempo (s) Preestacionario Tiempo (s) Curso total de reacción

93 Ecuación de Michaelis-Menten integrada [Producto] Velocidad inicial Tiempo Cuando el enlentecimiento en la formación de producto se debe solo a la depleción de sustrato, se puede encontrar K M y V MAX con un solo tubo de ensayo : - Determinando v para diferentes [S] con las tangentes. - Integrando la ecuación de Michaelis-Menten.

94 Integrando la ecuación de Michaelis- Menten d[p] d[s] V MAX [S] v = = - = dt dt K M + [S] Balance de masa [S] 0 = [S] + [P] d[p] V MAX ([S] 0 - [P]) = dt K + [S] - [P] M 0 d[p] (K M + [S] 0 - [P]) = V MAX dt [S] 0 - [P] Condicion de frontera [P] = 0 a t = 0 (K + [S] ) d[p] [P] d[p] - = V dt M 0 [S] 0 - [P] [S] 0 - [P] 0 V MAX t = [P] + K M ln [S] 0 - [P] Analogamente: MAX 0 M [S] V t = [S] - [S] + K ln [S] 0 [S] MAX

95 [S] 0 V MAX t = [S] 0 - [S] + K M ln [S] Rearreglando: [S] - [S] 0 t V MAX K M V MAX /K M 1 ln t [S] [S] 0

96 d[p] d[s] V [S] v = = - = MAX dt dt K + [S] caso limite: K << [S] M 0 M d[p] = V dt MAX [P] = V t MAX

97 d[p] d[s] V MAX [S] v = = - = dt dt K + [S] Caso limite: K >> [S] V M 0 d[s] = MAX [S] dt K M V MAX [S] = [S] 0 exp t KM V MAX ln [S] = ln [S] 0 t KM M Ln [S] V MAX K M t

98 Sustratos con alta afinidad Cuando [E] 0 ~ [S] 0, ya no se puede asumir que [E] 0 << [S] 0 Ya no se cumple: V [S] max v = K M + [S] No va a haber un buen ajuste a una hipérbola y las linealizaciones van a presentar desviaciones. En cambio se puede demostrar: V { } 2 T T S T T S T T max v = ([E] + [S] + K ) ([E] + [S] + K ) 4 [E] [S] 2 [E] T

99 Sustratos con alta afinidad

100 v = f max S KM Reacciones reversibles E + S k1 k2 ES E + P V [S] V [P] - S M r max P KM [S] [P] K K P M k k -1-2 f donde V max = k 2[E] T K = k + k S -1 2 M k1 r V max = k -1[E] T K = k + k P -1 2 M k-2 En el equilibrio v = 0 ( kcat KM ) ( ) [P] V K Keq = = = [S] V K k K f P max M S r S max M CAT M P Relación de Haldane Los parámetros cinéticos de una reacción reversible están relacionados por la constante de equilibrio

101 Del repartido de ejercicios 18. La enzima fumarasa cataliza la hidratación del fumarato para dar malato. Esta reacción tiene un ΔGº de 3.8 kj/mol. Para la enzima de corazón de chancho, se han reportado valores, para la reacción directa, de K M = 1.7 mm y V MAX = 0.25 mm -1 s -1 ; y, para la reacción reversa, de K M = 3.8 mm y V MAX = 0.11 mm -1 s -1. En cambio, para la enzima de una bacteria, se han reportado valores de K M = 1.6 mm y V MAX = mm -1 s -1 para la reacción directa, y K M = 1.2 mm y V MAX = mm -1 s -1 para la reacción reversa. Comente en la plausibilidad de estos reportes.

102 (PARÉNTESIS) UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Una unidad es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato en producto en 1 min bajo condiciones definidas. (Comisión de Enzimas, Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, 1961) U ml -1 : concentración U mg -1 : actividad específica Otra unidad es el katal. Un katal corresponde a la conversión de 1 mol de substrate por segundo.

103 En la mayoría de los casos, las unidades se refieren a concentraciones altas de sustrato (>K M ), por lo que las unidades no dependen de la concentración de sustrato v 0 (µm min -1 ) v 0 (um min -1 ) mu ml [Xanthine] (um) Entonces, para formar más producto, o descomponer más sustrato, o en un período más corto de tiempo, simplemente hay que añadir proporcionalmente más enzima.

104 Del repartido de ejercicios: 1. Se quiere medir la actividad de la enzima malato deshidrogenasa en un extracto bacteriano. oxalacetato + NADH L-malato + NAD+ Para ello, se coloca amortiguador fosfato ph 7.6, oxalacetato 0.6 mm y NADH 0.1 mm en un volumen total de 3 ml. Se dispara la reacción agregando 0.01 ml de extracto bacteriano. Este extracto contiene 32 mg de proteína/ml. Se observa la disminución de absorbancia a 340 nm debido a la desaparición de NADH (ε = 6.22 mm -1 cm -1 ). a- Cuál es la velocidad de reacción? b- Calcule la actividad de la enzima por ml de extracto. c- Calcule la actividad específica de la enzima. tiempo (s) absorbancia

105 Del repartido de ejercicios: 2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a la sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad siguiendo la desaparición de NADH acoplándola a la malato dehidrogenasa: aspartato + α-cetoglutarato TGO glutamato + oxalaceto oxalaceto + NADH malato + NAD En una mexcla de reacción se coloca un exceso de aspartato (100 veces el Km), 0.1 ml de suero de un paciente, 0.3 µmoles de NADH y exceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 ml. La reacción se inicia agregando un exceso de α cetoglutarato contenido en 0.1 ml. Luego de un período de latencia, se observa un decrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de absorbancia por minuto siendo la cubeta de reacción de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por ml de suero de paciente. MDH +

106 Del repartido de ejercicios: 3. Se quiere medir actividad β-galactosidasa en un extracto bacteriano que contiene 5 mg de proteína por ml de extracto. Para ello, se incuban 0.25 ml de extracto en amortiguador con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil β-galactósido en un volumen total de 1 ml. Cada 90 segundos, se toman alícuotas de 0.1 ml y se agregan a 2.9 ml de NaOH 0.1 M. Se mide la formación de p-nitrofenol a 400 nm, siendo ε = M-1 cm-1 en NaOH 0.1 M. a- Cuál es la actividad de la enzima por ml de extracto? b- Cuál es la actividad específica del extracto? c- Qué controles deben realizarse? tiempo 90 s 180 s 270 s 360 s A

107 Del repartido de ejercicios: 8. Un gramo de músculo fresco contiene 40 unidades de una enzima. Estime la concentración intracelular de la enzima asumiendo que un gramo de músculo fresco contiene 0.8 ml de agua intracelular: a) Sabiendo que el número de recambio de la enzima es de 6 x 10 4 min -1. b) Sabiendo que la actividad específica de la enzima pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es