11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 31/ Inventor/es: Kennedy, Thomas, J. 74 Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 31/498 A61P 33/00 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Composiciones de pracicuantel para el tratamiento de enfermedades producidas por un coccidio. Prioridad: US Titular/es: BAYER CORPORATION 0 Bayer Road Pittsburgh, Pennsylvania , US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Kennedy, Thomas, J. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCIÓN Composiciones de pracicuantel para el tratamiento de enfermedades producidas por un coccidio Campo de la invención Campo de la invención: La presente invención se refiere a una composición de pracicuantel para el tratamiento de animales infectados por parásitos que provocan enfermedades abortivas o neurológicas. De forma más específica, la presente invención se refiere a una composición de pracicuantel que es útil para el tratamiento de protozoos parásitos, como los coccidios, que provocan enfermedades abortivas o neurológicas en los mamíferos. Descripción breve de la técnica anterior: Para la protección y tratamiento de enfermedades causadas por protozoos, que se sospecha que pueden provocar enfermedades neurológicas y/o abortivas en diversos mamíferos, insectos y peces, la técnica ha utilizado una serie de compuestos, entre los que recientemente se han incluido los compuestos de triacineona. Generalmente, entre los protozoos sensibles a estos compuestos se incluyen los parásitos que infectan el intestino de aves, mamíferos e insectos, que provocan diarrea, enfermedad consuntiva, náuseas y vómitos. Recientemente se ha descubierto que algunos parásitos que ahora se sabe que cruzan la barrera hematoencefálica, al igual que los parásitos que atraviesan la barrera placentaria, se pueden tratar con triacineonas. Entre los parásitos que cruzan la barrera hematoencefálica o la barrera placentaria se encuentran, por ejemplo, aquellos que provocan enfermedades coccidiales como Toxoplasma gondii, Sarcocystis neurona, Neospora caninum, Neospora hugesii e Isospora suis. Ejemplos de los compuestos de triacineona son las triacinedionas, como los compuestos de diclazuril, y las triacinetrionas, como los compuestos de toltrazuril. Véanse las patentes estadounidenses ; ; ; ; ; ; y Aunque para el uso en el tratamiento de parásitos se han descrito otros compuestos relacionados con la técnica, entre los cuales están los derivados del pracicuantel (2-acil-4-oxo-hexahidro-4H-piracino[2,1-a]isoquinolina), esta descripción carece de cualquier recomendación o sugerencia sobre la utilidad de estos compuestos para el tratamiento de los parásitos que cruzan las barreras capilar o placentaria. Generalmente se ha utilizado el pracicuantel de forma aislada o en combinación con otros compuestos para la formulación de composiciones antihelmínticas para el tratamiento de la infestación por céstodos, nemátodos y similares. Véanse las patentes estadounidenses , y La patente estadounidense nº describe el pracicuantel para su uso en la prevención y tratamiento de parasitosis que provocan enfermedades como la malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, esquistosomiasis y elefantiasis. La patente también sugiere que el pracicuantel se podría utilizar para el tratamiento de parasitosis limitadas a la sangre, linfa y tejidos. Toxoplasma y Sarcocystis se mencionan de forma específica en el contexto de su infección del tejido muscular o del intestino. No se hace mención al tratamiento o prevención de las enfermedades en las que Toxoplasma, Sarcocystis, Neospora o Isospora se infiltran en el cerebro de los mamíferos adultos o atraviesan la barrera placentaria para infectar el tejido nervioso central del feto, produciendo abortos o recién nacidos débiles. Generalmente, el modo de actuación de las triacineonas es atacar los estadios intermedios de los parásitos que se encuentran en las células parietales del intestino, provocando inflamación del retículo endoplásmico, del espacio perinuclear y de las mitocondrias del parásito. Esto supuestamente altera la capacidad de división nuclear, provocando que los esquizontes y los microgamontes mantengan un tamaño pequeño y sólo formen unos pocos merozoitos y microgametos, respectivamente. El resultado final parece ser la pérdida de la capacidad de estos últimos estadios de los parásitos para penetrar nuevas células mamíferas, deteniendo eficazmente la replicación del parásito en el huésped. El modo de actuación del pracicuantel, según se describe en la patente estadounidense (ibid), está relacionado con la interrupción de los procesos enzimáticos del parásito relacionados con el metabolismo de los derivados de las purinas y de estructuras químicas similares a las purinas. Los parásitos son extremadamente sensibles a la interferencia de estos procesos, por lo que las composiciones que atacan de forma específica estos procesos se pueden utilizar para eliminar de forma selectiva una parasitosis. El pracicuantel se administra para atacar parásitos relacionados con una infección del tejido muscular, del intestino o de la sangre. No existen menciones al tratamiento de parásitos del sistema nervioso central (encéfalo y médula espinal) o de parásitos que pueden atravesar la barrera placentaria. Aunque la técnica se ha preocupado por los protozoos que desde los años 70 se sospechaba que provocaban enfermedades neurológicas y/o abortivas en los mamíferos, se ha comprobado la dificultad para el aislamiento y cultivo in vitro con éxito de algunos de estos protozoos. Por ejemplo, hasta finales de los ochenta no se consiguió el aislamiento de los parásitos del cerebro o del líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, una vez que se determinó que las infecciones del encéfalo por protozoos podían producir enfermedades neurológicas y que las enfermedades abortivas podían ser producidas por infecciones del feto por protozoos, se puso de manifiesto la necesidad de fármacos eficaces frente a los protozoos que pudieran atravesar la barrera hematoencefálica y la barrera placentaria sin producir efectos secundarios nocivos. En los mamíferos, muy pocas drogas pueden atravesar la barrera hematoencefálica o la barrera placentaria. Desafortunadamente, muchos de los fármacos conocidos por la técnica que sí cruzan la barrera hematoencefálica y/o la barrera placentaria útiles para el tratamiento de parasitosis del encéfalo presentan efectos secundarios nocivos, de forma que no se pueden utilizar sin correr un gran riesgo. Así pues, hasta el momento no se han aprobado fármacos eficaces que proporcionen un tratamiento eficaz para dichas enfermedades neurológicas o abortivas. 2

3 ES T Es destacable que, basándose en el modo de actuación del pracicuantel descrito en la patente estadounidense.663.1, relativo a su amplio ataque sobre las enzimas que afectan al metabolismo de las purinas, sería esperable que este compuesto también produjese graves efectos si se utilizase para el tratamiento de mamíferos con infecciones parasitarias del encéfalo. A continuación se realiza una breve descripción de las enfermedades parasitarias de la invención inmediata, que son tratables con pracicuantel. La Mieloencefalitis Protozoaria Equina (EPM en inglés) es una enfermedad neurológica de los caballos, con predilección por los caballos jóvenes bajo estrés (por ejemplo, caballos pura sangre de carreras y caballos de raza de alto rendimiento), por lo que es una enfermedad con un impacto económico significativo para la industria caballar. El EPM, reconocido por primera vez como enfermedad en los años setenta, no fue cultivado hasta 1991 a partir de un caballo con EPM, denominándose el parásito Sarcocystis neurona. En 1997, fue aislado un género de Neospora, actualmente denominado Neospora hugesi, a partir del encéfalo de un caballo con EPM. Por tanto, en la actualidad se acepta que el EPM puede estar producido únicamente por este organismo recientemente reconocido, únicamente por Sarcocystis neurona, o por una combinación de los dos. Otro parásito coccidio,toxoplasma gondii, es conocido desde hace tiempo y fue aislado por primera vez a partir del intestino y del tejido muscular de gatos. El huésped definitivo para este parásito es el gato, que puede portar el organismo durante largos periodos de tiempo, transmitiendo los ooquistes a otros animales, incluyendo bovinos, ovinos, porcinos y humanos. La infección del ganado ovino y vacuno y de los humanos se ha asociado con abortos y trastornos congénitos, que afectan fundamentalmente al sistema nervioso central. Recientemente también se ha asociado a abortos y malformaciones en gatitos nacidos de gatas infectadas que antes de infectarse, durante el embarazo, habían sido seronegativas. Los huéspedes no felinos, como los bovinos, ovinos, porcinos y humanos, no producen ooquistes, pero desarrollan y pueden sufrir la invasión del tejido muscular y encefálico por taquizoitos y bradizoitos que producen los signos clínicos de la enfermedad: síntomas neurológicos y abortos con defectos fetales. Se ha comunicado que el % de los gatos son serológicamente positivos frente a T. gondii. De nuevo, no existe ningún fármaco aprobado para el tratamiento o la profilaxis de la toxoplasmosis. Otro parásito coccidio, Neospora caninum, que fue aislado por primera vez a partir de perros en 1988, produce una enfermedad a la vez neurológica y abortiva en animales. Previamente se la había confundido con Toxoplasma gondii. La enfermedad provocada por este parásito es más grave en cachorros infectados por vía transplacentaria, y se caracteriza en los cachorros por parálisis ascendente progresiva, particularmente en los cuartos traseros; también puede existir polimiositis y hepatitis. Esta enfermedad ha sido reconocida de forma más reciente como una importante causa de abortos y defectos en extremidades asociadas neurológicamente en terneros recién nacidos. En el encéfalo, médula espinal y corazón de los fetos abortados se pueden observar lesiones microscópicas de encefalitis no supurativa y miocarditis. Recientemente se ha identificado el perro como huésped definitivo de Neospora caninum. En este momento no existe ningún fármaco aprobado para el tratamiento o profilaxis tanto de Neospora caninum del perro, o del ganado vacuno, como de Neospora hugesi del caballo. Como se desprende de lo anteriormente citado, la técnica anterior, incluyendo la bibliografía citada, no sugiere ni recomienda el uso de pracicuantel en el tratamiento de animales infectados por una Coccidia o, más específicamente, de la familia Sarcocystidae que causa enfermedades abortivas o neurológicas, sin producir efectos secundarios intolerables. La presente invención proporciona un tratamiento mejorado y seguro para los animales que padecen enfermedades parasitarias que se manifiestan como enfermedades neurológicas o abortivas. Resumen de la invención De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención describe el uso de pracicuantel para la preparación de una composición para el tratamiento de un mamífero enfermo que padezca una enfermedad parasitaria neurológica o abortiva provocada por coccidios. El procedimiento consiste en la administración al animal de una cantidad farmacéuticamente eficaz de pracicuantel. El término cantidad farmacéuticamente eficaz significa, en este documento, que la cantidad administrada de pracicuantel o de un derivado del mismo es suficiente para inhibir el crecimiento in vivo o in vitro del protozoo parásito, sin provocar reacciones adversas en el mamífero tratado. Típicamente, los protozoos parásitos son coccidios que producen enfermedad neurológica y/o abortos. La cantidad farmacéuticamente eficaz controla los parásitos en los tejidos infectados; por tanto, mejora la salud del animal. Además, la cantidad farmacéuticamente eficaz es eficaz neurológicamente o placentariamente, lo que significa que la cantidad de pracicuantel o su derivado se encuentra en una cantidad capaz de atravesar la barrera hematoencefálica para tratar los parásitos que infectan el sistema nervioso central, o la barrera placentaria, sin producir reacciones adversas en el mamífero tratado. Además, la presente invención describe un procedimiento para tratar metafilácticamente a un animal infectado por un parásito que puede provocar una enfermedad neurológica o abortiva que es susceptible de ser tratada con pracicuantel. El tratamiento metafiláctico comprende la administración del pracicuantel al animal utilizando un régimen metafilácticamente eficaz. El término régimen metafilácticamente eficaz significa administrar dosis programadas de forma intermitente de un compuesto de pracicuantel o de un derivado del mismo durante un período prolongado, hasta que el animal sea capaz de vencer a los parásitos invasores mediante, por ejemplo, el desarrollo de una respuesta inmunitaria protectora o la eliminación del parásito por otro procedimiento. Por regla general, el régimen es el adecuado para controlar de forma eficaz a los parásitos y prevenir los signos clínicos de la enfermedad. La dosis metafiláctica- 3

4 ES T3 mente eficaz puede también administrarse durante un período prolongado, de hasta cinco años, o durante toda la vida del animal, especialmente en casos en los que el parásito es difícil de controlar Además, la presente invención describe el tratamiento de los animales mediante una dosis única elevada. Éste procedimiento comprende la administración a los animales una dosis única elevada de una cantidad farmacéuticamente eficaz de pracicuantel a un animal enfermo que padece una enfermedad parasitaria neurológica o abortiva que es susceptible de ser tratada con un compuesto de pracicuantel o un derivado del mismo. El término dosis única elevada significa una cantidad que se administra una sola vez para controlar a los parásitos causantes de la enfermedad. Esta cantidad es significativamente mayor que la cantidad de dosis utilizada en el tratamiento terapéutico o metafiláctico y es eficaz para controlar los parásitos causantes de la enfermedad, y, por sí misma, no daría lugar a efectos adversos como toxicidad. La dosis única elevada de pracicuantel es, por tanto, superior a mg/kg. Éste y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación. Descripción detallada de la invención Como se ha comentado previamente, la presente invención describe una composición para, o un procedimiento de tratamiento de mamíferos infectados o enfermos que padecen una enfermedad parasitaria que se manifiesta como una enfermedad neurológica o abortiva, que es susceptible de tratamiento con un compuesto de pracicuantel o un derivado del mismo. El procedimiento descrito comprende la administración al mamífero de una composición que contiene una cantidad farmacéuticamente efectiva de pracicuantel. Como ejemplo ilustrativo, aunque no limitante, los animales pueden ser equinos, bovinos, felinos, caninos, porcinos, ovinos, aves, insectos y humanos. Los parásitos que infectan o causan la enfermedad son coccidios de la Familia Sarcocystidae que pueden manifestarse como enfermedades neurológicas o abortivas. Ejemplos ilustrativos, aunque no limitantes, se puede seleccionar del grupo consistente en los géneros Sarcocystis, Neospora y Toxoplasma. Los Sarcocystidae generalmente se seleccionan del grupo consistente en S. neurona, N. hugesi, N. caninum y T. gondii. Las infecciones o las enfermedades por protozoos incluyen, aunque no están limitadas a EPM, Neosporosis y Toxoplasmosis. En la práctica de la invención, el tratamiento de las parasitosis o enfermedades parasitarias causadas por los protozoos descritos en este documento da lugar al alivio de la sintomatología de las enfermedades neurológicas y abortivas. Generalmente, los síntomas incluyen cojera, ataxia, parálisis, abortos, recién nacidos débiles y otros trastornos relacionados. Para el tratamiento terapéutico, aquellos animales que ya presentan los signos de la enfermedad descritos son tratados con el compuesto de pracicuantel. En general, la duración del tratamiento es de 28 días a 90 días, y preferentemente de 28 a días. Se sobreentiende que para el tratamiento terapéutico, el régimen de tratamiento se puede administrar una vez al día, dos o más veces al día, una vez cada dos días o incluso una vez a la semana, dependiendo de factores como la gravedad de la enfermedad y el tipo de parásito productor de la enfermedad. En algunos casos, sin embargo, el régimen terapéutico puede durar indefinidamente, a veces durante el resto de la vida del animal. Éste último régimen terapéutico sería necesario en el caso de que el animal esté infectado por una cepa del parásito más resistente. Sin embargo, en caso necesario, el tratamiento se puede prolongar durante períodos de tiempo más largos, hasta que los signos de la enfermedad se hayan eliminado. El tratamiento preferido es una vez al día durante aproximadamente 28 días. La dosis preferida para el tratamiento oscila entre 1 mg/kg y 0 mg/kg, preferentemente de 2, mg/kg a 2 mg/kg. Para el tratamiento metafiláctico, los animales infectados deben ser tratados para protegerlos frente a la manifestación clínica de enfermedades. Este tratamiento da lugar, en último término, a la adquisición por parte del animal de la capacidad para controlar el parásito, por ejemplo, mediante el establecimiento de una respuesta inmunitaria eficaz para proporcionar protección frente a futuras infecciones, sin necesidad de una nueva administración de pracicuantel. La actividad metafiláctica, de acuerdo con la invención, se refiere al uso de compuestos de pracicuantel para la fabricación de un medicamento que se va a utilizar en un régimen de tratamiento programado intermitente (régimen metafilácticamente eficaz) para controlar los protozoos, que puedan haber infectado al animal desde el tratamiento previo. Así pues, se administrará el régimen metafilácticamente eficaz para reducir la capacidad del parásito de provocar enfermedad mediante, por ejemplo, su destrucción o la disminución de su número. En esencia, el régimen metafilácticamente eficaz se puede administrar aproximadamente una vez al mes, a lo largo de toda la vida del animal, o hasta que el animal desarrolle un mecanismo de eliminación inherente, por ejemplo una respuesta inmune eficaz, que se desarrolla en el animal para protegerlo de futuras infecciones. Esto último puede producirse en el plazo de cinco años o menos. Como se puede observar, el tratamiento metafiláctico se basa en el reconocimiento de que, cuando los animales están infectados por los protozoos descritos en este documento, no presentan signos clínicos tales como signos neurológicos o abortos hasta que ha transcurrido un tiempo significativo (por ejemplo, 2 a 6 meses tras la infección). Por el contrario, las infecciones entéricas por protozoos se manifiestan poco después de la infección. De acuerdo con esta invención, el tratamiento metafiláctico previene que el parásito se establezca y provoque una enfermedad clínica. El régimen de tratamiento se debe establecer siguiendo una pauta periódica intermitente aproximadamente una vez al mes, una vez cada dos meses o una vez cada dos semanas, con una dosis equivalente de aproximadamente entre 1,0 y 0 mg/kg, preferentemente aproximadamente de 1,0 a 2 mg/kg, y más preferentemente aproximadamente de 2, a mg/kg. El periodo elevado sería necesario en casos particularmente resistentes (por ejemplo, cuando un animal está infectado por una cepa resistente). La dosis necesaria y la duración del tratamiento pueden ser determinadas por alguien con experiencia habitual en la materia. El régimen de tratamiento preferido para caballos con EPM o bovinos y perros con Neosporosis es aproximadamente de 1,0 a 2 mg/kg, y, preferentemente, con un intervalo aproximadamente de 2, a mg/kg de pracicuantel o un derivado del mismo cada 28 días. 4

5 ES T Para el tratamiento mediante dosis única elevada se debe administrar el pracicuantel en cantidades farmacéuticamente eficaces que sean superiores a mg/kg, y hasta 0 mg/kg. Una característica distintiva de la invención es que los compuestos de esta invención pueden no ser tóxicos, por lo que se pueden administrar a niveles de dosis elevados. La ventaja de la administración de dosis elevada reside en el hecho de que no son necesarias dosis de repetición. Sin estar asociado a ninguna teoría particular de la invención, se cree que el éxito inesperado de los tratamientos descritos en este documento se debe a la capacidad del pracicuantel para cruzar la barrera hematoencefálica o la barrera placentaria. Se cree que los compuestos de esta invención atraviesan fácilmente la barrera hematoencefálica y también son capaces de penetrar en la placenta y destruir los protozoos in situ, en el encéfalo y en el líquido cefalorraquídeo/médula espinal. Además, se ha observado que los compuestos de esta clase no son tóxicos ni mutagénicos, incluso a las elevadas dosis necesarias para el régimen de tratamiento con dosis única elevada descrito en este documento. Hasta el momento, no se disponía de fármacos rentables, de fácil administración, para el tratamiento y protección eficaces frente a estas enfermedades, que no produjesen efectos secundarios inaceptables en mamíferos, como toxicidad o mutagénesis. En la práctica de la invención, el pracicuantel puede ser formulado de cualquier forma conveniente para su administración a los animales. Las formulaciones adecuadas para la administración oral, que es la preferida en este documento, pueden ser suspensiones, comprimidos, cápsulas, geles, pastas, bolos o preparaciones en forma de polvos, gránulos o pastillas. La formulación de administración oral preferida es en forma de una pasta o un aditivo alimentario. Otras formas de administración que se pueden emplear incluyen la vía parenteral, tópica, intramuscular e intramucosa, o mediante otras rutas conocidas por los expertos en la materia. También se prefiere la administración tópica sobre el lomo del animal. En general, en las formulaciones se utilizan vehículos y auxiliares farmacéuticamente aceptables. Se pueden incluir, como ejemplo, agentes espesantes seleccionados del grupo del Carbopol; espesantes inorgánicos como los silicatos, bentonitos o el sílice coloidal; espesantes orgánicos como alcoholes grasos o ésteres de ácidos grasos y agentes humidificantes seleccionados del grupo del polietilenglicol o el laurilosulfato de sodio con Carbopoles. Los agentes espesantes preferidos en este documento para las formulaciones en pasta son Carbopol 974P y Carbopol 934P. En este documento también se pueden emplear conservantes seleccionados del grupo consistente en parabenes, alcoholes y aldehídos. Éstos pueden ser materiales líquidos, sólidos o gaseosos, que, por otra parte, son inertes o médicamente aceptables y que son compatibles con los ingredientes activos. De forma sorprendente, las pastas, según la invención, son eficaces cuando se usan para el tratamiento de los parásitos. De forma más específica, es sorprendente que las pastas de la presente invención se puedan administrar en una dosis eficaz neurológicamente. Son eficaces para administrar el pracicuantel de forma que atraviese la barrera hematoencefálica o placentaria y ataque a los parásitos que ya hayan invadido el encéfalo o infectado el feto de un animal preñado. Por comodidad, en este documento se proporciona una descripción de una forma de realización específica una de las pastas preferidas en este documento y cómo se preparan. Una pasta preferida, según la presente invención, contiene una suspensión micronizada de pracicuantel, propilenglicol, un agente espesante como Carbopol, conservantes como Metilparaben y Propilparaben y agua. La pasta se puede elaborar combinando agua, generalmente agua depurada, y Propilenglicol, calentando la combinación hasta aproximadamente 70 C y añadiendo, a esta temperatura, los conservantes. La mezcla resultante se enfría hasta temperatura ambiente y, a continuación, se añade el Carbopol, preferentemente en forma de Carbopol 974P o 934P. Finalmente se añade el pracicuantel. Una vez completada la mezcla, se ajusta el ph con hidróxido de sodio hasta aproximadamente 6,0. La pasta más preferible incluye un 1% de Pracicuantel P/P, % de Propilenoglicol P/P, 0,% de Carbopol 974P P/P, 0,14% de Metilparaben P/P, 0,02% de Propilparaben P/P, 0,1% de hidróxido de sodio P/P, siendo el resto agua depurada. Entre los edulcorantes se incluye dextrosa, sucrosa, lactosa, fructosa, sorbitol, xilitol, edulcorantes artificiales y melaza, que se pueden añadir para mejorar la palatabilidad. De forma adicional, para el mismo propósito se puede añadir levadura o extracto de hígado. La invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos ilustrativos pero no limitantes. Ejemplo 1 Para determinar el alcance de la protección proporcionada por el pracicuantel, se realizaron estudios in vitro. Se evaluó la sensibilidad de Sarcocystis neurona a este compuesto. Se utilizó la cepa SN3 de Sarcocystis neurona. Se evaluaron dos concentraciones de Pracicuantel, de µg/ml y de µg/ml. Se utilizaron células de cornete nasal bovino (CNB) para todos los estudios in vitro. Las células se cultivaron hasta su confluencia en recipientes de 2 cm 2 en medio RMPI 16 suplementado con un % v/v de suero bovino fetal (SBF), 0 unidades de penicilina (g/ml), 0 mg de estreptomicina/ml y x 2 mm de 2-mercaptoetanol. Tras obtener la confluencia celular, las células se mantuvieron en el mismo medio con SBF reducido (2% v/v). Los cultivos celulares se incubaron a 37 C en una atmósfera humidificada que contenían un % de dióxido de carbono y un 9% de aire.

6 ES T3 1 2 Para el crecimiento del parásito, las monocapas de células CNB fueron infectadas con parásitos y examinadas al microscopio inverso en busca del desarrollo de lesiones (efecto citopático, ECP ) o la presencia de muchos merozoitos extracelulares. Una vez se observaron lesiones o la presencia de muchos parásitos extracelulares, la monocapa fue raspada con la punta de una pipeta de ml y se transfirieron de 1 a 3 gotas del líquido que contenía merozoitos a dos recipientes de células CNB frescas. Cada a días se trasfirieron de esta forma merozoitos de S. neurona. El análisis utilizado para determinar la eficacia del pracicuantel fue el Ensayo de Disrupción Monocapa Microvalorado. Este análisis fue utilizado para determinar si los parásitos o el compuesto eran tóxicos para las células CNB. Se inocularon placas de 96 pocillos de fondo plano con células CNB y las monocapas resultantes se utilizaron para determinar el efecto de pracicuantel sobre la producción de merozoitos, lo que se midió mediante ECP (efecto citopático-formación de placas). Las monocapas fueron inoculadas con parásitos (S. neurona, en cantidad de 0.000/pocillo). Todos los pocillos fueron inoculados con la concentración correcta de pracicuantel dos horas después de la infección de las monocapas. Se utilizaron pocillos monocapas no tratados y no infectados como controles de los parásitos y se utilizaron células CNB no infectadas, pero tratadas, como controles de toxicidad. Cada tratamiento fue examinado por duplicado en 6 ocasiones. Cada pocillo fue vigilado visualmente todos los días y el análisis se detuvo cuando entre el 90 y el 0% de las células infectadas por merozoitos no tratadas habían sufrido lisis (90-0% ECP). Todos los pocillos de las placas se aclararon con solución salina tamponada con fosfato y fijados en metanol al 0% durante cinco minutos, después de lo cual fueron teñidas con una solución violeta de cristal. Las áreas de destrucción inducida por los merozoitos o de muerte de las células CNB debida a toxicidad no captan la tinción con cristal violeta. Se utilizó un lector de placas ELISA para cuantificar la incorporación de violeta de cristal y estos datos se utilizaron para determinar la concentración de pracicuantel que inhibe el 0% de destrucción (Concentración Inhibitoria 0 o CI 0 ). Los datos que demuestran la inhibición se presentan en la Tabla 1. Se observa que una cantidad tan pequeña como µg/ml de pracicuantel proporcionó el 1% de inhibición de la destrucción celular. Pracicuantel a una concentración de µg/ml produjo una inhibición del 69% de la destrucción celular. Esto indica que pracicuantel sería efectivo para el tratamiento de las enfermedades provocadas por coccidios que se sabe que están asociados a síndromes patológicos neurológicos y abortivos, incluyendo enfermedades provocadas por S. neurona, N. caninum, N. hugesi, T. gondii e I. Suis. Además, pracicuantel no fue tóxico para las células CNB. TABLA 1 Datos in vitro del efecto de pracicuantel sobre Sarcocystis neurona 3 Organismo Porcentaje de Inhibición de Destrucción Celular 0 µg/ml µg/ml µg/ml Sarcocystis neurona 0% 1% 69% Estos datos indican que una dosis de 2, a mg/kg sería neurológicamente eficaz para el tratamiento de un mamífero que sufre la enfermedad provocada por Sarcocystis neurona

7 ES T3 REIVINDICACIONES Uso de pracicuantel para la preparación de una composición para el tratamiento de un mamífero enfermo que padece una enfermedad parasitaria neurológica o abortiva provocada por coccidios. 2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el coccidio es un miembro del grupo constituido por Sarcocystis spp, Neospora spp, Toxoplasma spp e Isospora spp. 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el Sarcocystis spp es Sarcocystis neurona, Neospora spp es Neospora caninum o Neospora hugesi, Toxoplasma spp es Toxoplasma gondii e Isospora spp es Isospora suis. 4. Uso según la reivindicación 3 en el que el Sarcocystis neurona es el agente causante de la Mieloencefalitis Protozoaria Equina.. Uso según la reivindicación 3 en el que el Neospora caninum es el agente causante de la Neosporosis bovina o canina. 6. Uso según la reivindicación 3 en el que el Neospora hugesii es el agente causante de la Mieloencefalitis Protozoaria Equina. 7. Uso según la reivindicación 3 en el que el Toxoplasma gondii es el agente causante del aborto asociado a Toxoplasma en mamíferos