DEFENSAS ANTIMICROBIANAS DE PLANTAS SUPERIORES: Un caso de aplicación GIFUJ

Transcripción

1 DEFENSAS ANTIMICROBIANAS DE PLANTAS SUPERIORES: Un caso de aplicación GIFUJ Julio Armando Pedrozo Pérez Profesor Asociado Departamento de Química Pontificia Universidad Javeriana Bogotá Colombia 2003

2 CULTIVO DE PAPA (Guasca Cundi.)

3 FLORICULTURA El cultivo de plantas ornamentales se ha convertido en Colombia, en una de las industrias de mayor crecimiento, debido a la gran demanda internacional de flores de excelente calidad y sanidad. Constituye uno de los rubros de mayor importancia de la economía nacional, generando divisas comparables a las producidas en años precedentes por el petróleo o el café.

4 FLORICULTURA EN COLOMBIA Colombia posee una combinación única de condiciones topográficas y de temperatura, que permiten la producción intensiva de más de 30 tipos de flores cultivadas en invernadero, desde rosas, pompones, crisantemos, astromelias, girasoles y claveles, hasta las más exóticas, como heliconias y el ave del paraíso.

5 FITOPATÓGENOS ongos Fitopatógenos Alternaria Aspergillus Rhizoctonia Colletotrichum Sphaerotheca Fusarium Botrytis Bacterias Fitopatógenas Pseudomonas

6 CONTROL QUÍMICO

7 AGRICULTURA ORGÁNICA

8 SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS 1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS INIBIDORES POSINIBIDORES 2. FITOALEXINAS

9 ECOSISTEMA PARÁMO Páramo de Guasca (Guasca Cundi.)

10 VEGETACIÓN N DEL SUBPÁRAMO

11 PROYECTO ESTUDIO QUÍMICO Y EVALUACIÓN N DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA NGICA Y ANTIBACTERIANA DE PLANTAS AUTÓCTONAS DE PÁRAMOSP COLOMBIANOS Investigadores: Rubén Darío Torrenegra Guerrero Julio Armando Pedrozo Pérez COLCIENCIAS/U. JAVERIANA, código , CT

12 TEST BIOAUTOGRÁFICO Cromatogramas Medio de cultivo + Microorganismo Medio de cultico + Cromatograma invertido Refrigeración / 18 horas Incubación Retirar CCD Zonas de inhibición Comparación de resultados con duplicado de CCD Medición de Rf y zonas de inhibición

13 Especies vegetales A.AB A.AF Dipolostephium phylicoides - - Diplostephyum revolutum - - Senecio formosus b,c b,c Senecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,c Pentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,c Bejaria aestuans - - Gaultheria anastomosans b - Pernettya prostrata - - Vaccinium floribundum - - Cavendishia cordifolia - - Lupinus paniculatus - - Calamagrostis effusa - - Baccharis tricuneata - - Espeletia grandiflora a,b - Espeletia argentea a,b - Espeletiopsis corymbosa a,b - Ageratina vacciniaefolia a,b b Ageratina fastigiata a,b b Ageratina tinifolia a,b b

14 Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr. (Guasgüí üín- uasgüí üín)

15 Pentacalia ledifolia (.B.K)Cuatr. (Guasgüí üín- uasgüí üín)

16 EXTRACCIÓN N DEL VEGETAL Extracto: Sustancias de la superficie foliar 200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CCl 3 (5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató con Me 2 CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue removido por filtración y, el filtrado resultante, fue concentrado y secado al ambiente. El extracto se guardó en nevera a 4ºC para evaluarle luego su acción antifúngica

17 EXTRACCIÓN N CON PETRÓLEO El material vegetal, previamente lavado con CCl 3, fue secado al ambiente y luego pulverizado. A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante 72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío. El extracto se trató con Me 2 CO y, después de 12 h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secó al ambiente. El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluar luego su acción antifúngica.

18 EXTRACCIÓN N CON ETANOL El material desengrasado se extrajo por percolación en frío con EtO 96% v-v. El extracto resultante se trató con agua, se filtró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/L con CCl 3 y luego con AcOEt. Las fracciones se concentraron, se secaron al ambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles, posteriormente, su acción antifúngica.

19 MÉTODO DE CRECIMIENTO RADIAL EN PDA Extracto vegetal Medio de cultivo Inóculo Incubación / 6 días Medición de los diámetros de las colonias

20 CIM EN mg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES DE PENTACALIA, ANTE ONGOS FILAMENTOSOS Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride 1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4 2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6 2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5 3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5 3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5 1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3 2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6 2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5 3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5 3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5

21 EXTRACTO DE MAYOR ACCION ANTIFÚNGICA NGICA Procedimiento: Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío con CCl 3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vez durante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentraron y se trataron con Me 2 CO. Los filtrados se concentraron, se redisolvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CCl 3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera a 4 ºC.

22 CIM EN mg/ml DE LA FCA DE ESPECIES DE PENTACALIA, ANTE ONGOS FITOPATOGENOS Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2 FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3

23 RECONOCIMIENTO DE PROBLEMAS FITOPATÓGENOS

24 Sphaerotheca pannosa var. rosae (Ascomicetes) Parásito obligado Causante del mildeo polvoso en el fruto del durasno, fresa y mora; es la enfermedad de mayor severidad y diseminación en cultivos de rosa en invernadero y en campo abierto. La forma más corriente es la asexual, designada como Oidium leucoconium. La forma sexual presenta cleiostecios globosos con unos pequeños apéndices miceloides de color café; contienen 8 ascosporas. Las esporas asexuales (conidias) son producidas en gran número y son prácticamente responsables de la propagación y diseminación de la especie.

25 Mildeo polvoso del rosal Los síntomas tempranos son un leve levantamiento, como una ampolla, a menudo, en áreas rojas en la superficie de la hoja. El micelio (con conidióforos) aparece como manchas discretas en la superficie de las hojas jóvenes, las cuales se vuelven curvadas, deformes y, comúnmente, se recubren de un polvo blanco llamado. Ataca las espinas en su base; a los tallos en las partes más tiernas; a las hojas jóvenes en toda su superficie; a las flores en los pedúnculos, en sépalos y receptáculos, especialmente cuando la flor aún no está abierta. El daño reduce el crecimiento de la hoja, el valor estético de la planta, la eficiencia en la fotosíntesis y, por consiguiente, el desarrollo.

26 BIENSAYO in vivo PARA ONGOS PARÁSITOS OBLIGADOS Invernadero: dividido en naves de aproximadamente m 2 y, conformada cada una por 15 a 20 camas. Sólo se utilizaron 6 de estas camas, cada una conteniendo 280 plantas en periodo de floración. Éstas camas fueron distribuidas según un diseño de bloques al azar con aleatorización restringida Evaluación: la evaluación del daño del hongo sobre las plantas se realizó de acuerdo a una escala de calificación, correspondiente a porcentajes de ataque entre 0 y 50%. Aspersión: se utilizó una bomba de presión constante, previamente desinfectada y calibrada. Se utilizó el método de aplicación en escuadra. Muestras experimentales: se utilizaron soluciones acuosas de extractos de especies de Pentacalia, adicionando un adherente especial (Pegal 0,5%). Análisis: se realizó la prueba de t y el análisis de varianza (ANOVA) que permite comparar más de dos medias poblacionales.

27 APLICACIÓN N DE LA FRACCIÓN N ACTIVA

28 MÉTODOS DE SEPARACIÓN N E IDENTIFICACIÓN MÉTODOS DE SEPARACIÓN Cromatografía en capa delgada preparativa Fraccionamiento sobre lecho de sílica Cromatografía en columna flash Cromatografía en columna de sílica Cromatografía en columna de sephadex MÉTODOS DE IDENTIFICACI TODOS DE IDENTIFICACIÓN Espectrofotometría ultravioleta Espectrometría de masas Resonancia Magnética Nuclear

29 CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

30 FITOPATÓGENOS ongos Fitopatógenos Alternaria Aspergillus Rhizoctonia Colletotrichum Sphaerotheca Fusarium Botrytis Bacterias Fitopatógenas Pseudomonas

31 SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS 1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS INIBIDORES POSINIBIDORES 2. FITOALEXINAS

32 ECOSISTEMA PARÁMO Páramo de Guasca (Guasca Cundi.)

33 VEGETACIÓN N DEL SUBPÁRAMO

34 Especies vegetales A.AB A.AF Dipolostephium phylicoides - - Diplostephyum revolutum - - Senecio formosus b,c b,c Senecio pampae b.c b,c Pentacalia corymbosa - b,c Pentacalia ledifolia - b,c Pentacalia pulchella - b,c Bejaria aestuans - - Gaultheria anastomosans b - Pernettya prostrata - - Vaccinium floribundum - - Cavendishia cordifolia - - Lupinus paniculatus - - Calamagrostis effusa - - Baccharis tricuneata - - Espeletia grandiflora a,b - Espeletia argentea a,b - Espeletiopsis corymbosa a,b - Ageratina vacciniaefolia a,b b Ageratina fastigiata a,b b Ageratina tinifolia a,b b

35 Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr. (Guasgüí üín- uasgüí üín)

36 EXTRACCIÓN N DEL VEGETAL Extracto: Sustancias de la superficie foliar 200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CCl 3 (5 ml/g); el solvente fue removido por filtración y concentrado al vacío; el residuo obtenido se trató con Me 2 CO y enfrió a 4 ºC durante 12 h. El flóculo fue removido por filtración y, el filtrado resultante, fue concentrado y secado al ambiente. El extracto se guardó en nevera a 4ºC para evaluarle luego su acción antifúngica

37 EXTRACCIÓN N CON PETRÓLEO El material vegetal, previamente lavado con CCl 3, fue secado al ambiente y luego pulverizado. A 600 g, se le extrajo con éter de petróleo durante 72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y concentrado al vacío. El extracto se trató con Me 2 CO y, después de 12 h de reposo se filtró a mínimo volumen y se secó al ambiente. El extracto se guardó en nevera a 4 ºC, para evaluar luego su acción antifúngica.

38 EXTRACCIÓN N CON ETANOL El material desengrasado se extrajo por percolación en frío con EtO 96% v-v. El extracto resultante se trató con agua, se filtró y al filtrado obtenido se le fraccionó L/L con CCl 3 y luego con AcOEt. Las fracciones se concentraron, se secaron al ambiente y se guardaron a 4 ºC para evaluarles, posteriormente, su acción antifúngica.

39 CIM EN mg/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES DE PENTACALIA, ANTE ONGOS FILAMENTOSOS Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride 1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4 2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6 2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5 3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5 3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5 1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3 2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6 2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6 2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6 3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5 3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5 3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5

40 EXTRACTO DE MAYOR ACCION ANTIFÚNGICA NGICA Procedimiento: Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceración en frío con CCl 3, durante 8 días; el material se extrajo una segunda vez durante 2 días más. Los extractos se mezclaron, se concentraron y se trataron con Me 2 CO. Los filtrados se concentraron, se redisolvieron en mezclas hidroalcohólicas y se extrajeron L/L con CCl 3. Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera a 4 ºC.

41 CIM EN mg/ml DE LA FCA DE ESPECIES DE PENTACALIA, ANTE ONGOS FITOPATOGENOS Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2 FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3

42 MÉTODOS DE SEPARACIÓN N E IDENTIFICACIÓN MÉTODOS DE SEPARACIÓN Cromatografía en capa delgada preparativa Fraccionamiento sobre lecho de sílica Cromatografía en columna flash Cromatografía en columna de sílica Cromatografía en columna de sephadex MÉTODOS DE IDENTIFICACI TODOS DE IDENTIFICACIÓN Espectrofotometría ultravioleta Espectrometría de masas Resonancia Magnética Nuclear

43 CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR

44 CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR C 3 O C 3 O O O O O O O Escopoletina 7-O-geranilescopoletina

45 FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR

46 QUINOLES DE PENTACALIA O O O O 8 7 O C 3 Jacaranona O O 8 7 O C 2.C 3 Etiljacaranona (1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato...

47 JACARANONA

48 MÉTODO DE CRECIMIENTO RADIAL TODO DE CRECIMIENTO RADIAL Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum

49 SUSTANCIAS ANTIFUNGICAS Sustancias CIM en μg/ml F.oxysporum B.cinerea Escopoletina geraniloxilescopoletina Jacaranona Metiljacaranona

50 INDUCCIÓN N DE ESCOPOLETINA PATÓGENO Virus del mosaico Virus Virus Ceratostomella fimbriata elicobasidium mompa Phytophthora infectans Pseudomonas solanacearum PLANTA Tabaco Tomate Papa Papa Papa Papa Tabaco BIBLIOGRAFÍA Best, 1944 Andreae, 1948 Uritani, 1953 oshiya, 1958 Fang, 1988 ofer, 1984 Paxton, 1944 También se ha encontrado ser inducidas por nemátodos e insectos

51 JACARANONA Marcada acción citotóxica y antitumoral * Activo a 2 mg/kg sobre el sistema leucemia linfocítica P338 * Solamente acción citotóxica marginal (ED 50 ) a niveles de 2,1 μg/ml) Acción inhibidora del crecimiento de Spodoptera litura (Lepidoptera) Concentraciones inferiores a 1000 ppm Mecanismos: como reactivos electrofílicos están implicados con intermediarios de la fosforilación oxidativa y en reacciones de eliminación. Pueden sufrir ataques nucleofílicos posiblemente por constituyentes celulares con grupo-s de una enzima clave.

52 O 4'' 5'' 6'' 1'' 3'' 2'' PENTACALIOSIDOS 2''' O C O 1''' O O 4' O 6' 3' 5' 2' 11 C 3 O O O 1' O O 3 2 O

53 ASIGNACIONES DE LAS SEÑALES DEL ESPECTRO 1 NMR DE PENTACALIÓSIDO A O δ 6,32 δ 7,52 δ 3,10 O C O δ 5,14 δ 3,23 δ 3,73 O δ 4,74 δ 4,14 δ 4,40 O O δ 4,38 δ 4,34 O O C 3 O δ 5,73 O δ 7,05 δ 7,59 δ 7,68 O O δ 6,37 (1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato de 6 -escopolinilo

54 ASIGNACIONES DE LAS SEÑALES DEL ESPECTRO 1 NMR DE PENTACALIÓSIDO B O δ 3,10 δ 2,35; 2,95 δ 2,14; 2,31 O C O δ 5,14 δ 3,23 δ 3,73 O δ 4,74 δ 4,14 δ 4,40 O O δ 4,38 δ 4,34 O O C 3 O O δ 5,73 δ 7,05 δ 7,59 O δ 7,68 δ 6,37 (1-hidroxi-4-oxo-ciclohexanil) acetato de 6 -escopolinilo O

55 CONCLUSIONES 1. Sobre la superficie foliar de Pentacalia corymbosa existen sustancias protectoras contra hongos e insectos. 2. Estas sustancias mostraron estructuras de tipo cumarínico y quinólico. 3. Las cumarinas aisladas fueron la escopoletina y la 7-O-geranilescopoletina. 4. Los quinoles aislados fueron la jacaranona y la etiljacaranona.

56 AGRADECIMIENTOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA COLCIENCIAS UNIVERSIDAD DE STRATCLYDE (Glasgow Escocia) INSTITUTO DE INMUNOLOGIA (Bogotá Colombia)