1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO

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1 1 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica 1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO Objetivos Conocer la importancia de realizar un reporte científico. Conocer las características o partes de un reporte científico: Introducción, hipótesis, objetivo, métodos, resultados, discusión y conclusiones, y referencias. Conocer cómo se formulan las hipótesis. Plantear hipótesis. Aprender a realizar un reporte científico. Introducción Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son expresados de manera clara y fácil de seguir, difícilmente serán tomados en cuenta. Es de gran valor, tanto para empresas como para instituciones educativas y de investigación, contar con personal que pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral. En el desarrollo de las ciencias, la comunicación de las observaciones, resultados y propuestas, es fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte científico. En él, no sólo se informa sobre los resultados de una investigación, sino también se recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnológicos que pueden ayudar a replantear la dirección de una investigación o llevar a la resolución de un problema en particular. Uno de los pasos comunes dentro del llamado método científico es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observación (Figura 1.1.). Así como en el reporte, en todos los pasos que conforman al método científico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lógica. Por ejemplo, en el planteamiento de la hipótesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto, estableciendo en una frase corta las variables que se están manipulando o las mediciones que se harán, siempre en términos mensurables. Adicionalmente, la hipótesis incluye aquella información que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigación. Para ayudarnos a construir la hipótesis generalmente se utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente ejemplo: Si observamos que la garganta nos duele, nos planteamos: Si tengo dolor de garganta entonces podría deberse a que tengo una infección debida a bacterias o virus, o bien porque grité mucho el día anterior. Sin embargo, la anterior hipótesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir: Si sé que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera contagiado, y además fuí a un juego de fútbol en donde grité mucho, entonces es probable que esto último me causará el dolor de garganta. A pesar de que mejoró, la hipótesis no establece como se validará o no la predicción. Se podría plantear otra diciendo: Si no tengo fiebre o síntomas de una infección en la garganta, pero sí una inflamación en la garganta, entonces el cultivo de exudado faríngeo y otros estudios clínicos darán negativo para una infección bacteriana o viral, por lo que la inflamación se deberá a un uso excesivo de las cuerdas vocales. La hipótesis es una parte importante en una investigación y como se mostró, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se está investigando, el conocimiento

2 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica previo y el diseño del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hipótesis con los resultados sé llegan a conclusiones válidas, que permiten replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado. Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método científico. Se observa que las flechas van hacia delante pero también pueden en cualquiera de los puntos regresar. El método científico es un proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron analizados. Reporte científico Como se comentó con anterioridad, el principal propósito de escribir un reporte científico es el de comunicar la información que ha sido compilada como resultado de la investigación o experimentación y el análisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tópicos pero usualmente se enfocan en transmitir la información con un propósito claro y para una audiencia específica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe también estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector mantenga la atención en él. Generalmente, el valor de una investigación se evalúa a través del reporte, es decir el reporte escrito es el único producto tangible de muchas de horas de trabajo. Debido a que se juzga el trabajo a través de un reporte escrito, éste debe ser de gran calidad. Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusión de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la 2

3 3 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuación se da una breve descripción de cada una de las secciones que conforman un reporte científico. Resumen. Su función es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes más relevantes, una frase sobre el objetivo del experimento, una descripción corta del método que se usó, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo párrafo de 100 a 200 palabras. Introducción. Contiene la información necesaria para que el lector conozca por qué es importante el reporte, así como de que trata. La información que se utiliza en la introducción va de lo general a lo específico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tópico de la investigación en un área particular de estudio. Después, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura específica) para ayudar a justificar la presente investigación. La introducción finaliza con un párrafo en el que se plantea la hipótesis. En algunos casos se requiere que la parte final de la introducción contenga los objetivos del estudio. Métodos. El propósito de está sección es describir precisamente los materiales y métodos usados para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda repetir el procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qué se usó un método en particular. La sección de métodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo. Resultados. En esta sección se describe pero no se explican los resultados; sólo presenta los hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algún resultado que es particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La sección de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas puede ser muy útil para mostrar o enfatizar la información en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta útil para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Es esencial que las figuras estén integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que sean referidas inmediatamente después de mencionarlas y deben explicarse. Un error común es mencionar la figura, colocarla y sólo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es decirle al lector en qué dato debe poner atención en la figura, aquello que es significativo y que podría utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del siguiente experimento. Discusión. La sección de discusión tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o causal. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hipótesis han sido contestadas; c) mostrar cómo los resultados de la investigación se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadísticamente significativos, o si existió algún defecto en el diseño o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas áreas de interés. Conclusiones. Está sección puede ser incluída como parte de la discusión o bien como una sección aparte. Establece de manera clara y concisa cuál es la relevancia del trabajo y sus implicaciones. Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabético, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la información

4 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica bibliográfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros los formatos que se utilizan. Actividades sugeridas 1. Después de la explicación de lo que es un reporte científico, el profesor proporcionará al menos un artículo de investigación, para que identifiquen en éste las partes de un reporte. Después cada equipo expondrá sus resultados. 2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hipótesis y diseñen un experimento. Se realizarán dos formas de reporte de ésta actividad: La primera será un reporte oral al final de ésta sesión y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesión. Cuestionario 1. Qué implicaciones para la humanidad tendría el no reportar las investigaciones? 2. Qué información debe contener un reporte científico? 3. Investiga como se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye cuáles son las variables independientes, las dependientes y las control? 4. Qué estructura debe tener una hipótesis? 5. Cuáles son las secciones de un reporte científico? 6. Qué diferencia (s) hay entre la sección de resultados y la discusión? 7. Qué información bibliográfica deben de contener las referencias, si son libros, artículos o catálogos o páginas de internet? Referencias Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman, PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA Objetivos Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. Construir curvas de calibración y comprender su importancia. Introducción El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Parte de la identificación de una molécula se determina por el trazado del espectro de absorción (en función de la longitud de onda λ) en la región visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación del compuesto mediante una reacción química). Leyes que rigen la espectrofotometría Cuando un haz luminoso de intensidad P 0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P 0. La relación entre ambos se denomina transmitancia, T: 4

5 T= P/P (1) 5 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación ΔP, que es proporcional a ΔN. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación general: -log P/ P 0 = abc (2) donde: c es la concentración b es la longitud de la celda o paso óptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que la relación -log P / P 0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A λ = a λ bc (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superíndice λ así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción (ε). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de ε son cm -1 mol -1 L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice. Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es εb. Conociendo ε y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción. Determinación de la concentración de proteínas Dos aplicaciones comunes de la determinación de la concentración de proteínas son: 1) para reportar la actividad específica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogéneo de proteína en geles de poliacrilamida-sds. Dado que hay varios métodos para medir proteínas totales, Cómo se escoge entre estos métodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida-sds, la precisión es más importante. Cuantificación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm. El uso de la absorbancia en la región ultravioleta para medir la concentración de proteína es posiblemente el método más simple y rápido, aunque puede producir resultados poco exactos. La cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm, depende de la presencia de aminoácidos aromáticos: tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). La medida a 260 nm depende de la

6 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica presencia de fenilalanina (Phe) ya que es en esta longitud de onda donde presenta su absorbancia máxima. Un alto orden de estructuración puede modificar la contribución de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del péptido o proteína y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el ph y fuerza iónica del medio. Debido a que en extractos celulares hay otros compuestos que también absorben en la proximidad de los 280 nm, Warburg y Christian (1942) desarrollaron un método para corregir la interferencia por los ácidos nucleicos. concentración de proteína (mg/ml)= A 280 * F siendo F un factor de corrección, que para una solución de proteína con 0% de ácidos nucleicos es 1.12; mientras que para una mezcla de proteínas con un 20% de ácidos nucleicos es de Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico. El ensayo de determinación de proteínas por el método de Lowry es uno de los más usados en Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína. Material y equipo Celdas de plástico y de cuarzo para espectrofotómetro Tubos de vidrio de 13 X 100 mm Tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 µl (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 µl (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta µl 1 Micropipeta µl Vórtex Espectrofotómetro (por grupo) Reactivos Albúmina de suero bovino o BSA. Disolución de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composición en apéndice. 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH H 2 O Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H 2 O. Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volúmenes de H 2 O. Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse Desarrollo experimental Determinación de proteínas por absorbancia a 280 ηm 1. Rotular los tubos de microfuga 2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la tabla y completar con agua. Volúmenes y cantidades del estándar de BSA para determinar proteína, utilizando la absorbancia a 280 nm. 6

7 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica Tubo H 2 O BSA (1mg/mL) µl µl 10 µl µl 20 µl µl 30 µl µl 40 µl µl 50 µl µl 60 µl µl 70 µl A 280 ηm Proteína (µg) 3. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de la determinación y seleccionar la λ de 280 ηm. 4. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones. 5. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua. 6. Realizar las lecturas. 7. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 8. Calcular la concentración de proteína de acuerdo al volumen añadido de la solución estándar. Determinación de proteínas por Lowry 1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la tabla. Importante: mezclar con el vórtex después de añadir cada una de las disoluciones. 2. Encender el espectrofotómetro, seleccionar la λ de 750 nm. 3. Utilizar las celdas de plástico para realizar las mediciones. 4. Ajustar el espectofotómetro con la disolución del primer tubo de la tabla (sin BSA). 5. Realizar las lecturas. 6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 7. Construir las gráficas de absorbancia vs concentración de proteína (µg). Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA, utilizando el método de Lowry para su determinación. Tubo H 2 O BSA Reactivo Reactivo (1mg/mL) A B µl 1000 µl 500 µl µl 10 µl 1000 µl 500 µl µl 20 µl 1000 µl 500 µl µl 30 µl 1000 µl 500 µl µl 40 µl 1000 µl 500 µl µl 50 µl 1000 µl 500 µl µl 60 µl 1000 µl 500 µl µl 70 µl 1000 µl 500 µl Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos A 750 ηm Proteína (µg) Cuestionario 1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer). 7

8 Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica 2. Menciona el fundamento de determinación de proteínas por Lowry y por absorbancia a 280 nm. 3. De acuerdo al fundamento de los dos métodos de cuantificación de proteínas aplicados en está práctica cuáles son las principales diferencias entre ambos métodos? 4. Cuál es más rápido?, Cuál es más fácil de hacer? y Cuál consideras que es más barato? Fundamenta tu respuesta. 5. Qué sustancias pueden interferir con cada una de las determinaciones? 6. Respecto a la sensibilidad de ambos métodos. Cuál es la masa de proteína que se necesita en la celda para obtener una absorbancia de 0.1?. 7. Compara tus datos con los de tus compañeros y analiza Qué tan reproducibles son los datos? 8. Se obtiene una línea recta después de graficar absorbancia vs µg proteína? 9. De acuerdo a tus resultados, cuál es el intervalo en el que se podría determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación de proteínas por Lowry? Da una explicación. 10. Cuáles son las aplicaciones en general de una curva de calibración o estándar? Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein Methods in Enzymology 182, Peterson GL A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83,

9 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO. Objetivos - Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad. - Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes celulares. - Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. - Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de purificación de una proteína. Introducción Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. Los aspectos que deben considerarse para establecer un método de purificación de una proteína son: el uso, las características (tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas, no obstante, si hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una proteína toma en consideración lo siguiente: A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares. C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario. G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica. Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de diferente peso molecular. Una fase posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por la

10 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas adición de sales o disolventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar una proteína. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína; microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas, entre otras. La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida. PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesto la proteína y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el ph de la solución, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugación. La centrifugación aprovecha la propiedades de tamaño, forma y densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación: Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo. La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en solución y las moléculas ligeras sedimentan. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en su superficie pueden

11 11 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas, cambio de ph, incremento en la temperatura, adición de disolventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH 4 ) 2 SO 4. Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentraciones de iones, fenómeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, la disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan ( salting out ). El mecanismo del salting-out se basa en la exclusión del co-disolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentración de los iones la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de la proteína y el disolvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas, produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy económico, se han diseñado tablas y formulas en las que se pueden determinar las cantidades a añadir de (NH 4 ) 2 SO 4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración dada. Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular. La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirán reducir la concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis, el costo de la membrana de diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h. Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes se retienen, al adicionar el amortiguador de elución, las proteínas de bajo peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero, después eluyen las de peso molecular mayor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde las proteínas o moléculas de bajo peso molecular. TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio. Cromatografía de intercambio iónico. Es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas depende del ph en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pi. La carga neta de una proteína es positiva a valores de ph < pi, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador aniónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe encontrarse en valores de ph > pi, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo catiónico que contienen grupos cargados positivamente. Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el ph o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación de las

12 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración. Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD + o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.1). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina a muchos contaminantes. A B Figura 2.1. Comparación entre las moléculas de Cibacron blue 3GA y el NAD +. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD +. En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación con (NH 4 ) 2 SO 4. En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad. Por último, en la parte III del protocolo se evaluará la pureza de la proteína y el rendimiento, al determinar la cantidad total de proteína y su separación y visualización en un gel de poliacrilamida-sds. Material biológico 60 g de carne de res Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo) 1 Tijeras 1 Espátula 1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de látex Colador de aluminio Gasa 2 Vasos de precipitados de 1000 ml 1 Probeta de 50 ml 2 Botellas de centrífuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio 2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 ml 12

13 1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 100 ml 1 Espátula Tubos para microfuga de 1.5 ml 1 Caja con puntas de 200 µl (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 µl (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta µl 1 Micropipeta µl 1 Bandeja pequeña 1 Barra magnética 1 Agitador magnético Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) Reactivos 0.03M KOH. (NH 4 ) 2 SO 4 sólido. Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4 C). Mantener las soluciones y suspensión proteíca en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el volumen de la solución de homogenización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los pasos de purificación (Figura 2.2). Valores necesarios para calcular el rendimiento, contenido de proteína y actividad enzimática. A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos. 1. Cortar en trozos pequeños 60 g de tejido (eliminar el tejido graso que acompaña a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto frío hasta su uso). 2. Agregar 8 volúmenes de 0.03 M KOH por cada g de tejido y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 10 seg para evitar que la licuadora se caliente. 3. Debido a la textura del homogeneizado, se recomienda primero filtrar en una malla gruesa (colador de aluminio) y después filtrar la mezcla sobre cuatro capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente y colectar el filtrado en un vaso de precipitados de 1L. 4. Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4 C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1L, el botón tiene una consistencia gelatinosa y está muy laxo. Al sobrenadante lo denominamos homogenizado total (Fracción 1). 5. Apartar 1 ml de la fracción 1 en un tubo de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso. Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho. B. Precipitación con sulfato de amonio por equipo. 6. Tomar 30 ml de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados. 7. Agitar el sobrenadante de manera continua en un agitador magnético, mientras se añade lentamente sulfato de amonio sólido (calcular la cantidad a añadir considerando g de (NH 4 ) 2 SO 4 por cada ml del sobrenadante). La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver 13

14 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la solución se caliente. 8. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 45% con sulfato de amonio. 9. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrífuga a 10,000 rpm 4 C por 10 minutos. 10. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 ml de la fracción 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a 20 C para su posterior uso. 11. Calcular el peso de (NH 4 ) 2 SO 4 para obtener una solución al 72% de saturación, (considerar 0.19 g de (NH 4 ) 2 SO 4 por cada ml del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente. 12. Una vez disuelto el (NH 4 ) 2 SO 4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 5 min y descartar el sobrenadante. 13. Resuspender el botón en 1 ml de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 ml. 14. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe contener 750 µl, se usará ese volumen en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a 20 C. 14

15 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas g Tejido Homogeneizado ml 0.03 M KOH Moler Filtrar con malla de aluminio Filtrar con gasa Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4 C Botón Sobrenadante (SN) ml VOLUMEN TOTAL (FRACCIÓN 1; ml) A ml SN añadir g (NH 4) 2SO 4 (45% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4 C Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 2; ml) Añadir g (NH 4) 2SO 4 (70% saturación) Agitar Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 5 min, 4 C Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 3) Añadir 1 ml de H 20; volumen total obtenido ml Figura 2.2 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas. 15

16 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas Cuestionario 1. Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas? 2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué. 3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso y solubilidad. 4. Es posible clasificar a todos los métodos para purificar a una proteína sólo de acuerdo a las propiedades mencionadas anteriormente. Explica 5. Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4 C? 6. Qué otro método de homogeneización sería recomendable utilizar para obtener las proteínas del músculo? 7. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como pi, actividad enzimática, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. 8. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína?. 9. Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico? Referencias Allen T, Mark W Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Castle DJ Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Localización QP514.T4 Protein purification Handbook Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number Pp 94. Salem J Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página Sheehan D, O Sullivan S Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Sitios recomendados para 1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas página desarrollada por el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres. 2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. 16

17 17 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD Objetivos - Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado de extractos proteicos. - Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y por afinidad para purificar una proteína. Material biológico Fracción 3 obtenida en la sección anterior Material y equipo 1 Columna de cromatografía vacía 1 Columna de cromatografía pre-empacada con Sephadex G-25* 1 Probeta de 50 ml 4 tubos de vidrio de 13X100 mm Tubos para microfuga de 1.5 ml 1 Recipiente para hielo 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez Micropipeta de 1000 µl Micropipeta de 200 µl 1 caja de puntas de 1000 µl para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µl para micropipeta Adaptadores para tubos de 15 ml (por grupo) Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Reactivos Desalado 2.5 % Sephadex-G25 (p/v). La columna contiene 1 ml de volumen de cama de Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega pre-empacada para su uso inmediato. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mm de Tris/HCl ph 8.8 y 0.5 mm β- Mercaptoetanol. Ver preparación en el apéndice. 400 mm PMSF Amortiguador Tris--β-Mercaptoetanol-PMSF (Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol + 1 mm de PMSF). Los alumnos la prepararan poco antes de su uso. Tomar un volumen adecuado del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol y añadir PMSF para una concentración final de 400 mm. Determinar el volumen a preparar por cada equipo ya que no todos los equipos realizarán la cromatografía de afinidad. Ver apéndice. Agua destilada estéril para el lavado de las columnas. Purificación por cromatografía de intercambio iónico Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (se entregará previamente lavada, ver Apéndice). Amortiguador de equilibrio. Contiene 50 mm de amortiguador de fosfatos ph 7.0. Amortiguador de elusión. Contiene 50 mm de amortiguador de fosfatos ph 7.0 y 1 M de NaCl. Purificación por cromatografía de afinidad DEAE affi-gel blue gel (previamente lavada ver Apéndice).

18 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas Amortiguador Tris-PMSF (solución que se uso en el desalado). Amortiguador de NAD +. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol adicionado con 5 mm de NAD +. Disolver el NAD + justo antes de usarse, ver apéndice. Desarrollo experimental. Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular 1. Tomar 750 µl de la fracción 3 y añadirle 750 µl del amortiguador Tris-PMSF (para reducir la concentración de la sal a la mitad). 2. Sujetar a un soporte universal la columna, como se muestra en la Figura Adicionar a la columna de Sefadex poco a poco la mezcla de proteína y amortiguador del punto 1 y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente 10 min). Posteriormente colocar la columna sobre un tubo de vidrio de 13X100 mm y centrifugar a 3,000 rpm 10 min, 4 C. Se desecha la solución que sale de la columna, proteínas o moléculas que no se retuvieron en la columna. 4. Para eluir las proteínas se adicionan 750 µl de amortiguador Tris-PMSF y se centrifuga a 3000 rpm a 4 C durante 5 min. La fracción que sale contiene a la LDH, Fracción 4. Se mide la cantidad de fracción 4 y se guardan 100 µl para llevar a cabo medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el siguiente paso. NOTAS. 1 La columna se lava con agua destilada estéril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregar al profesor lavada. 2 No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna. Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad. La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de la fracción 4. A. Preparación de la columna para la fase tres de la purificación. Adicionar 2 ml de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar intercambio catiónico o de afinidad. Dejar de drenar o colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4 C. Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante. B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico 1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico. 2. Equilibrar la columna adicionando en la parte superior de la columna 1.0 ml de amortiguador de equilibrio. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4 C. 3. Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio a salido se adicionan 600 µl de la fracción 4 y se deja que pase el líquido por la columna o se centrífuga como se menciono anteriormente. 4. Para la elución se adicionan 1.0 ml de amortiguador de elución y se recolectan 2 fracciones de 500 µl cada una (Figura 2.3). Las dos fracciones obtenidas las denominamos, Fracción purificada A (FPA) y Fracción purificada B (FPB). Posteriormente, se usaran ambas fracciones. NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 2 ml de amortiguador de equilibrio y se guarda la columna para ser reutilizada. Entregar al profesor. 18

19 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas Figura 2.3 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución. C. Purificación por cromatografía de afinidad. 1. Se utiliza una columna pre-empacada con DEAE Affi-gel Blue. 2. Se equilibra la columna al adicionar 1 ml de amortiguador Tris-PMSF, el volumen que drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4 C. 3. Enseguida se adicionan 600 µl de la fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min a 4 C o se deja drenar, se desecha el eluído. 4. Añadir 600 µl del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la columna. Centrifugar nuevamente a 3000 rpm por 5 min a 4 C. 5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 µl de buffer de NAD + y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga (Fracción purificada A o FPA). 6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de proteína que haya quedado aún unida a la columna (Fracción purificada B o FPA). NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 2 ml del buffer Tris-β-mercaptoetanol, y entregar la columna al profesor para ser utilizada nuevamente. 19

20 Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas Cuestionario 1. Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fracción 3 del protocolo experimental? 2. Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas? 3. Investiga cuál de los métodos de cromatografía es más caro, intercambio iónico o de afinidad. 4. De acuerdo a lo anterior menciona que procedimiento es el que elegirías como primera instancia. 5. Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de intercambio catiónico? 6. Porqué el eluyente para la cromatografía de intercambio iónico contiene NaCl? 7. Podrías usar otra solución diferente de elución? Si es así menciónala y explica porque. 8. Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad? 9. Porqué el eluyente para la cromatografía de afinidad es el NAD +? Referencias Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Localización QP514.T4 Protein purification Handbook Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catálogo Pp 94. Salem J Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página Sheehan D, O Sullivan S Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Sitios recomendados para 1. aprender sobre cromatografía 2. realizar una autoevaluación sobre los fundamentos de la cromatografía 20