Bioinformática y modelación de proteínas por homología: un tutorial para principiantes Exploración de los pigmentos visuales humanos

Transcripción

1 Bioinformática y modelación de proteínas por homología: un tutorial para principiantes Exploración de los pigmentos visuales humanos Un tutorial de Gale Rhodes adaptado por León Martínez Castilla (castilla@miranda.ecologia.unam.mx)

2 0.1. Introducción Este tutorial te ayuda explorar las opsinas las proteínas que atrapan la luz para nuestros ojos y los genes que codifican para las opsinas. Sin embargo, de lo que realmente se trata este ejercicio es de que te familirices con la bioinformática el uso de computadoras de buscar para buscar, explorar y utilizar la información sobre genes, genomas, ácidos nucléicos, y proteínas. Al mismo tiempo que aprendes sobre las opsinas humanas, utilizarás algunas de las herramientas de mayor alcance en la bioinformática actual, e incluso construirás un modelo de una proteína cuya estructura detallada es desconocida (lo que se llama modelación por homología). Después podrás continuar este tutorial con un estudio de las opsinas de otros organismos, o explorando cualquier clase de biomoléculas que te interesen. Toma en cuenta que este tutorial apenas toca la superficie de lo que necesitas saber para utilizar la bioinformática con pericia en tu investigación. Si quieres aprender más, incluyendo orientación sobre como juzgar la calidad de tus resultados, te recomiendo leer, por ejemplo Bioinformatics for dummies, por Claverie y Notredame, Wiley Publishing, Inc., Voy a dar por sentado que estás familiarizad@ con bioquímica y biología molecular. Si ves términos desconocidos referentes a los genes, a los mrnas, y a las proteínas usadas como ejemplos aquí, sácale jugo a tus textos de la bioquímica, échale un ojo al índice, y revisa, revisa, revisa Los recursos que exploraremos A medida que sigues este tutorial encontrarás estas bases de datos y herramientas de software. Usa esta página como referencia si no recurdas el significado de unas siglas o del nombre de un programa I. Las bases de datos Genbank Operado por el NCBI (el Centro Nacional Estadounidense para la Información sobre Biotecnología). Contiene todas las secuencias de DNA disponibles públicamente, con anotaciones, que constantemente están siendo extendidas y actualizadas. Las anotaciones incluyen la identificación de los genes, los productos de los genes (si se conocen), y conexiones extensas a toda clase de informaciones sobre el gen en otras bases de datos. NCBI contiene el mismo información sobre secuencias de DNA que 1

3 EMBL (el Laboratorio Europeo de Biología Molecular) y DDBJ (el Banco de Datos de DNA de Japón) OMIM (Enciclopedia en Línea de la Herencia Mendeliana en el Hombre y la mujer, también) Una enciclopedia de genes humanos y de desordenes genéticos, ligada a las entradas de genes en GenBank y a la literatura científica en PubMed. Da una información muy completa y de última hora sobre muchos genes humanos. PDB (el Banco de Datos de Proteínas) Contiene todos los modelos estructurales de proteínas y de ácidos nucléicos, experimentalmente resueltos (por cristalografía de Rayos X y por RMN) y que están disponibles públicamente. No contiene modelos derivados por homología u otros tipos de modelos teóricos. PubMed Descrito en Wikipedia como un motor de búsqueda gratuito para tener acceso a la base de datos de MEDLINE de citas y de extractos de los artículos de investigación biomédica. El tema de base es medicina, y PubMed cubre también los campos relacionados con la medicina, como la enfermería y otras disciplinas de la salud aliadas. También proporciona cobertura muy completa de las ciencias biomédicas relacionadas, tales como biología celular y bioquímica. Es ofrecido por la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos en los Institutos Nacionales de la Salud como parte del sistema Entrez de obtención de información. Base de conocimiento de UniProt (Swiss-Prot y TrEMBL) Operada por el SIB (instituto Suizo de Bioinformática) y el EBI (Instituto Europeo de Bioinformática). Contiene la mayor parte de las secuencias de proteínas disponibles públicamente (no se especializa en DNA o ARN). Las secuencias en Swiss-Prot se anotan manualmente, y te proporcionan directamente o te ligan a prácticamente toda la información publicada sobre una secuencia dada. Las secuencias en TrEMBL se recogen y se anotan automáticamente de bases de datos de secuencias, y eventualmente llegan al Swiss-Prot, pero solamente después que se anotan manualmente para cumplir con los estándares de Swiss-Prot. 2

4 II. Las herramientas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, herramienta básica de búsqueda por alineamiento local) Sirve para encontrar genes o proteínas con secuencias similares a las que estás estudiando en las bases de datos de secuencias. ClustalW Para comparar mediante el alineamiento la secuencia que te interesa con otras, o muchas secuencias unas con otras. DeepView (también conocido como Swiss-PdbViewer) Para ver y explorar modelos macromoleculares en tres dimensiones, y para el modelado por homología manual y semiautomatizado. ExPASy (sistema de análisis experto de proteínas) No tanto una herramienta como una caja de herramientas un sistema muy completo de herramientas de análisis de proteínas. Navegador de mapas del NCBI Para encontrar genes y productos de genes (RNAs y proteínas) de interés para tí, y para ver donde se encuentran en el sistema de cromosomas de cada organismo. PubMed Para buscar TODA la literatura de las ciencias de la vida. Phylip Para hacer árboles filogenéticos rigurosos cuando quieres controlar todos los parámetros. Phylodendron Para imprimir árboles filogenéticos usando datos. PhyML Para hacer árboles filogenéticos rigurosos automáticamente por un método de máxima verosimilitud... el mejor, pero el más lento. 3

5 Swiss-Model y el espacio de trabajo de Swiss-Model Para los modelos estructurales teóricos construídos automáticamente a partir de su secuencia y basándose en las estructuras conocidas (modelado por homología). Tcoffee Como ClustalW, una herramienta para el alineamiento y las comparaciones de secuencias, pero con un mayor alcance, puede utilizar las estructuras conocidas para mejorar las comparaciones 0.3. Empecemos a buscar genes Resúmen de lo que viene En esta sección utilizarás el navegador de mapas de NCBI y la palabra clave opsin para conseguir una lista de genes de opsinas o genes relacionados con opsinas en el genoma humano Opsinas humanas El tema de este tutorial son las opsinas humanas, que se encuentran en las células de tu retina. Las opsinas atrapan la luz y echan a andar la secuencia de señales que da lugar a la visión. Procederemos haciendo preguntas acerca de las opsinas y los genes que codifican para las opsinas, y usaremos la bioinformática para contestarlas. Cuando proporcione una dirección de la web, copiala y pégala en tu navegador para ir al sitio en una nueva ventana de navegador. Si quieres, agégala a tu lista de páginas favoritas para que puedas encontrarla otra vez. ADVERTENCIA: Las herramientas de la bioinformática se desarrollan rápidamente, más rápidamente que puedo realizar cambios a esta clase particular. Así que si una página no se ve exactamente como yo estoy diciendo que debe verse, o si su título es diferente, mirada alrededor e intenta hacer lo que sería equivalente a lo que dice el tutorial. Debes encontrar las mismas ligas, pero los nombres pueden ser levemente diferentes, o muchos nuevas ligas pudieron haber sido agregadas (las páginas de bioinformática nunca se vuelven más simples). Si las diferencias son tan grandes que no puedes continuar, llámame (si estamos en el mismo salón) o envíame un , y haré los cambios necesarios a las instrucciones tan pronto como sepa sobre ellos. 4

6 Dónde están los genes de opsinas en el genoma humano? Lleva tu navegador a Te encontrarás una lista de organismos para los cuales la información de sus genomas está disponible. Los botoncitos que están en las columnas a mano derecha las columnas derechas al lado de cada organismo hay ligas a las herramientas. Sostén el apuntador del ratón sobre cada símbolo de la herramienta para una breve descripción de lo que lo hace. Encuentra al Homo sapiens (humano), y haz clic en la herramienta de la lupa que está al lado de la construcción (Build) con el número menor (una construcción o build es un ensamblaje de un genoma, algo que se hace en varias ocasiones). Utilizaremos la más vieja estructura porque a veces no todas las herramientas de búsqueda y de visión están conectadas con la construcción más nueva, que está en curso. La herramienta de la lupa te lleva a la página de búsqueda para el organismo, que muestra un diagrama de cromosomas, y proporciona las cajas de la entrada de texto (en la parte superior de la página) para las búsquedas. En la caja que está al lado de Search for, escribe opsin. Haz clic en Find. Verás el diagrama de nuevo, con marcas rojas en tus hits (las secuencias que pescaste ), o sea, las localizaciones de los genes cuyas entradas contienen opsinçomo palabra completa o como parte de una palabra. Debajo del diagrama hay una lista de los genes indicados. Si la lista es muy larga, simplifícala usando la caja Quick Filter a la derecha hasta arriba de la lista; pon una palomita caja que dice gene, y después haz clic en Filter. Si ya estás viendo la lista filtrada, la caja Quick Filter no estará presente. En la lista de genes relacionados con el término de búsqueda opsin, está el gene de la rhodopsina (rhodopsin (RHO)), y tres pigmentos de los conos, opsinas sensibles a las longitudes de onda cortas, medias y largas (para la detección de la luz azul, verde, y roja respectivamente). Cuatro de los hits parecen ser pigmentos visuales, lo que no es de sorprender. A la izquierda de cada entrada está el número de cromosoma, lo que te permite saber qué marca roja corresponde a cada entrada. Observa que varios hits están en el cromosoma X, uno de los cromosomas de determinación sexual. NOTA: En las listas humanas del genoma, verás a menudo los duplicados marcados como reference o Celera, lo que se refiere a los resultados obtenidos a partir de diferentes dos esfuerzos importantes para ordenar el genoma humano. Al principio, estos dos esfuerzos eran separados, pero eventualmente juntaron muchos de sus resultados. Cuando tengas que elegir una opción, elije el reference para que sigas la misma trayectoria que seguí al hacer el tutorial. 5

7 Puedes conseguir más detalles sobre lo que pasa cuando hay hits múltiples en el mismo cromosoma con la liga All Matches para ese cromosoma. Haz clic en All Matches al lado del X. Sé paciente: la página siguiente puede cargar lentamente está llena de información. Verás una figura muy complicada muy complicada (no te asustes vamos a utilizar solamente una parte de esto). A la izquierda está un diagrama del cromosoma de X, con las marcas rojas en las posiciones de los genes que ahs venido siguiendo hasta esta página en nuestro caso, las dos opsinas, la de onda media y la de onda larga, que están situados cerca de la extremidad inferior del cromosoma X. A la derecha hay varias representaciones del cromosoma X, con los listados de las áreas que ya están anotadas. Los dos genes opsinas se destacan en color de rosa. Si pasas tu cursor sobre esta página sin hacer clic, encontrarás que algunos símbolos proporcionan breve información, sobre todo sobre las regiones que todavía no se caracterizan lo bastante bien como para tener una entrada completa. Como puedes ver, hay una cantidad enorme de información en esta página, con ligas hacia mucha más. Si quieres la información completa sobre lo que quieren decir las abreviaturas y los símbolos en esta página, así como las clases de información ligadas a la página, puedes utilizar la ayuda del visualizador del mapa (Map Viewer Help) en la parte de arriba de la página. Encontrarás información abundante sobre el visualizador de mapas, explicaciones de todos los símbolos y ligas, e incluso tutoriales sobre cómo formular y contestar toda clase de preguntas sobre los genomas. El visualizador de mapas es como el Google Earth del genoma, y como con Google Earth, la cantidad de información a veces puede resultar abrumadora. Por ahora, observa la información proporcionada para el gene OPN1LW de opsina (lo que se llama el símbolo del gene gene symbol). Verás que ésta es el gen de la opsina sensible a la longitud de onda larga (rojo), y que es un gen implicado en la acromatopsia o ceguera del color o daltonismo (un rasgo ligado al sexo ninguna sorpresa, porque encontramos el gen en el cromosoma de X) Todo sobre un gen Resúmen de lo que viene En esta sección, explorarás algunas ligas a la extensa información disponible sobre genes específicos Qué saben los científicos sobre las opsinas? En la página de MapViewer, haz clic en OPN1LW. 6

8 Acabas de entrar en la página OPN1LW opsin 1 de Entrez Gene, que es una especie de glorieta de caminos con salidas hacia toda clase de informaciones sobre este gene. Revisa rápidamente de arriba a abajo la página. Algo de la información es muy llana y comprensible, mientras que hay otra que es muy críptica. Una de las ligas más accesibles va hacia la OMIM (Herencia Mendeliana en el Hombre en Línea), un catálogo de genes humanos y desordenes genéticos. Ve a la parte de abajo de la página y encuentra la sección sobre fenotipos (Phenotypes), y observa las ligas llamadas MIM. Éstas son ligas a las entradas de OMIM. Haz clic en uno de ellos. Cada entrada de de la ficha OMIM te habla de este gen y de los tipos de ceguera del color, desórdenes genéticos asociados a mutaciones en este gene. Lee todo lo que quieras. Sigue las ligas hacia otras fuentes de información. Para más información sobre OMIM en sí mismo, haz clic en la insignia de OMIM en la parte de arriba de la página. Con OMIM, tienes disponible una gran cantidad de información para los genes que se encuentran en el genoma humano, y toda la información es sostenida por referencias a los últimos artículos de investigación. Una vez que hayas satisfecho tu apetito intelectual, regresa a la página de Entrez Gene (utiliza el botón de regreso de tu navegador o la lista de la historia del mismo). Al lado del botón Display, tira hacia abajo el menú y selecciona las ligas (calculadas) de PubMed (PubMed (Calculated) Links). Acabas de entrar a PubMed, una base de datos gratuita de literatura científica, para ver los resultados de una búsqueda completa de los artículos asociados directamente con este locus génico. Haciendo clic en los autores de cada artículo, puedes ver los resúmenes (abstracts) del artículo. Si estás en un área de la Universidad donde hay acceso en línea a las revistas específicas, puede ser que también veas ligas a los artículos completos. PubMed es un punto de entrada a una gran variedad de literatura en las ciencias de la vida. En el lado izquierdo de cualquier página de PubMed, encontrarás ligas a una descripción de la base de datos, a las secciones de ayuda, y a tutoriales sobre como hacer búsquedas eficientes. Ahora vuelve a la página de Entrez Gene para OPN1LW opsin Encontrar secuencias Resúmen de lo que viene En esta sección, aprenderás cómo obtener la información de las secuencias de ácidos nucléicos o de proteínas, en un formato llamado FASTA, que es un formato sencillo y muy útil para iniciar consultas con las herramientas de la bioinformática. 7

9 Cuál es la secuencia de nucleótidos de este gen? Recuerda que ahora estás viendo la información sobre el gen para la opsina sensible al rojo en la visión humana, y que este está situado cerca de la extremidad inferior del cromosoma X. En la página de Entrez Gene para OPN1LW opsin 1 avanza hacia abajo ( muy abajo!) hasta llegar a las secuencias de referencia de NC- BI (NCBI Reference Sequences (RefSeq)). En la primera subdivisión, mrna and proteins, todo esto está disponible: la secuencia del mrna (secuencia de bases nucleotídicas del ARN mensajero), aquí la verás enlistada como NM (la M indica que se trata de un registro de mrna); la secuencia de la proteína (secuencia del producto de este gen: la opsina del rojo), aquí enumerada como NP ( P para la proteína); las secuencias fuente (secuencias enteras de los todos los fragmentos sobrelapados en el genoma en los que se encontró a esta secuencia, de GenBank). Observa que las dos ligas a la secuencia del mrna y a la secuencia de la proteína están dados como NM NP , la flecha quiere decir que la secuencia de la ficha NM es traducida (durante la síntesis de la proteína) para dar la secuencia de la ficha NP. Haz clic en el número de la ficha para la secuencia del mrna: NM Esto es un archivo de nucleótidos típico de GenBank, y es difícil de leer, pero algunas cosas están claras. Primero fíjate que, bajo las referencias, están las citas a la publicación de esta secuencia en la literatura científica. Para ver un abstract del artículo en el cual este gen fue descrito, haz clic en la liga de PubMed (un número) debajo de la primera referencia y léelo. Desplázate hasta la parte inferior de esta larga página. La última cosa, etiquetada como ORIGIN, es la secuencia de este ARN mensajero. Estás viendo la lista real de las A s, las T s, las G s, y las C s que componen el mensaje para la síntesis de esta opsina. Pero Qué pasa aquí?! Tu sabes bien que el ARN no contiene ninguna T. En la mayoría de las bases de datos de nucleótidos, el uracilo U del ARN se representa como T, para facilitar la comparación de las secuencias de DNA y RNA. Esta información de la secuencia no está en la forma en la que es más útil para buscar en las bases de datos, por ejemplo, para buscar genes emparentados entre sí. Mostremos la información de esta ficha en un formato que sea más útil para buscar. En la parte de arriba de la página, al lado del botón Display, tira hacia abajo el menú desplegable que dice GenBank (el formato de representación por defecto 8

10 para cada entrada o ficha), y selecciona FASTA (nota que también están disponibles varias otras opciones de visualización ). Ahora puedes ver la línea descriptiva o línea comment, que comienza con el >, seguida por la secuencia de nucleótidos. Este pequeño texto (la descripción de la secuencia y la propia secuencia de nucleótidos) es todo lo que necesitas para buscar las bases de datos de nucleótidos secuencias similares a esta. Guárdalo para el uso futuro, como sigue: haz clic en y arrastra en la página Web para seleccionar todo desde el > hasta los útlimos nucleótidos (CCAA). Ten cuidado de no seleccionar todo lo demás. Con el menú Edit o Editar de tu navegador, selecciona copiar para hacer una copia de esta información en el portapapeles, para que luego la puedas pegar en otra parte. Ahora echa a andar un procesador de textos simple (usa TextEdit en una Mac, Notepad en Windows, emacs o vi en linux o UNIX es importante usar editores o procesadores de texto que trabajen con el formato texto simple a fin de evitar cambios inadvertidos en el formato de los archivos de la secuencia o la introducción de caracteres invisibles que en realidad no tienen lugar en el formato fasta), haz un nuevo documento, y pégalo. Tanto el comentario como la secuencia FASTA deben aparecer. En caso de necesidad, selecciona todo el texto y cambia la fuente a Courier o a Mónaco estas fuentes monotipo o de máquina de escribir facilitan el alinear letras en columnas, porque todas las letras son del mismo ancho. Guarda este archivo, eligiendo texto o texto simple como formato de tipo de archivo. Llámalo mrnaroja.txt (para la secuencia del mrna de la opsina roja). Guárdalo en un lugar conveniente en el que puedas encontrar este y otros archivos con los que hagas búsquedas posteriores (otra opción es que te los envíes a tu cuenta de correo). Haz clic en el botón de regreso de tu navegador hasta que vuelvas a la página de Entrez Gene para este gen Cuál es la secuencia de aminoácidos de este gen? Bajo NCBI Reference Sequences (RefSeq), haz clic en el número NP de la ficha para la secuencia de la proteína. Las cosas se ven como antes, pero esta es una entrada de proteína (la visión clásica es que los productos de genes son proteínas, pero muchos no lo son), que contiene la secuencia de aminoácidos en abreviaturas de una letra. Igual que como hiciste con la ficha del mrna, convierte esto en una visualización FASTA, y cópialo en un nuevo documento con el programa de edición de textos. Sálvalo en formato de texto como protroja.txt (para la secuencia de proteína de la opsina roja). Vuelve a Entrez Gene. 9

11 Cómo se ve la vecindad de este gen? (Prepárate para una sorpresa. Aquí te va una pista: OPN1LW es un gen humano, y los seres humanos son eucariontes. Cuando la gente comenzó a secuenciar genes eucarióticos, les esperaba una gran sorpresa). Ahora echa una ojeada a la región del cromosoma que contiene el gen de opsina roja. Desplázate hasta la parte de arriba de la página de Entrez Gene para OPN1LW, a la sección llamada Genomic Context. El diagrama lmuestra que el gen de la opsina roja está en el cromosoma X, dentro de un segmento de los pares de bases (bp s) que van de la posición a la posición (una distancia de pares de bases). [No te preocupes si estos números no son exactamente los que ves; estos recursos están siendo constantemente actualizados.] La localización de OPN1LW, indicada con la flecha roja, está cerca del tercer cuarto de este segmento. Ahora observa en el diagrama en la sección precedente, las secciones de Genomic regions, transcripts, y products. Este diagrama te permite ver con más detalle el segmento de OPN1LW, representando solamente las posiciones a ( bp s). La línea más baja muestra regiones codoficantes como bloques rojos, y las regiones no codificantes como líneas rojas. Aquí está la sorpresa: Tu ya sabías, aunque a lo mejor lo habías olvidado, que los genes eucarióticos son interrumpidos a menudo por regiones no codificantes llamadas secuencias de intervención o intrones. Las regiones codificantes se llaman exones. Con este diagrama, puedes ver que el gen de OPN1LW consiste de 6 exones y 5 intrones, y que los intrones son mucho más grandes que los exones. De los bp s en del gen, solamente 1095 bp s codifican para la proteína, así que significa que menos del 8 % de los pares de bases contienen el código para la proteína. Cuando este gen se expresa en células de la retina humana, una copia del ARN del gen entero se sintetiza. Entonces las regiones de intrones se cortan, y las regiones de exones se ensamblan juntas para producir el mrna maduro (un proceso llamado empalmar o splicing). el cuál será traducido por los ribosomas para hacer hacer la proteína de opsina roja. En este caso, el 92 % de la transcripción inicial del ARN se tira, dejando sólo el código puro de la proteína. Parece derrochador, pero no olvides que nuestra comprensión de cómo funciona todo esto, si bien es impresionante, sigue siendo bastante fragmentaria. El mañana nos dirá lo que no entendemos hoy, pero no lo que no entenderemos mañana. En los extremos de la línea más baja en el diagrama, hay ligas a NM y a NP , las entradas para el mrna y secuencias de la proteína para este gene. Ya visitaste estas páginas en las dos secciones anteriores. Haz clic en CCDS 10

12 en la extrema derecha del diagrama para ir a la página de la Secuencia Codificante Consenso para este gen. Esta p;agina muestra cómo el transcrito del gen OPN1LW se divide en exones. Bajo el letrero Chromosomal locations for CCDS hay una tabla que enlista las posiciones de inicio y fin apara cada exón. Debajo de eso está la secuencia de nucleótidos completa del mrna maduro, con secciones azules y negras alternantes que indican los límites de los exones. Más abajo está la secuencia de aminoácidos, dividida otra vez en exones alternando azul y negro, indicando con rojo los residuos cuyos codones están en parte en un exón y en parte en el exón siguiente. Esto hace ver claramente cómo el mrna se ensambla de los exones. Pero todavía no has visto las secuencias reales de los intrones. Vuelve a la página de Entrez Gene para OPN1LW. Bajo el letrero Genomic regions, Transcripts and Products haz clic en Go to reference sequence details. Esto te lleva a NCBI Reference Sequences. Ya habías estado aquí, para conseguir las secuencias de mrna y proteína. Esta vez, haz clic en la secuencia de cuatro números de entrada (los cuatro forman una sola liga) al lado de Source Sequences. Esto te lleva a la página de Entrez nucleotide que contiene la información sobre los cuatro de los fragmentos genómicos del Proyecto del Genoma Humano que contienen todo o parte del gen de la opsina roja, junto con la información sobre cómo cada clona fue producida. Esta entrada muestra así al gen en el contexto más grande de los fragmentos clonados en los cuales el gene fue encontrado. Estas secuencias permiten que explores las regiones que flanquean el gen, lo que puede ser útil en el diseño de los cebadores, o primers de la polimerización en cadena para hacer copias de esta región en cantidades útiles. En esta página, también podrás encontrar secuencias vecinas si quieres mirar más lejos. Como antes, puede visualizar esta entrada en formato FASTA. Vas a obtener una serie de entradas, cada una corresponde a una de las diferentes clonas que fueron utilizadas para construir esta región del genoma Primera búsqueda con BLAST Resúmen de lo que viene En esta sección, utilizarás una secuencia FASTA como query (consulta) para usar BLAST, un programa que busca en una base de datos genómicos secuencias similares (hits o correspondencias). También aprenderás cómo juzgar si una correspondencia se presenta por casualidad o por ancestría común. 11

13 Qué proteínas en los seres humanos son similares a la opsina roja? Ahora vuelve al visualizador de mapa de NCBI. Vas a buscar en el genoma humano secuencias similares a la de la opsina roja. Haz clic en el símbolo de BLAST (una B encerrada en un círculo) junto al letrero Homo sapiens (human). Éste es la herramienta de búsqueda con BLAST de NCBI. BLAST es un programa ampliamente utilizado para encontrar secuencias similares a un query en el que estás interesad@. Escoje estas opciones de los varios menús: Base de datos: Proteínas del ensamblaje (build) ANTERIOR (lo puedes ver hasta abajo del menú de la base de datos). Esto significa que buscarás las secuencias de proteína en la construcción anterior de la base de datos. (a veces no todas las herramientas están disponible en el más reciente ensamblaje, que está actualmente bajo construcción.) Programa: BLASTP (la versión de BLAST que compara secuencias de proteína, a diferencia de BLASTN, que compara secuencias de nucleótidos.) Otros parámetros: No realices ningún cambio. Después, copia los datos FASTA del archivo protroja.txt a tu portapapeles, y pégalos en la caja de captura de texto de BLAST, sobre la cual dice, Enter an accession... Comprueba que el primer carácter en la caja es el > al principio de los datos de FASTA. Entonces haz clic en Begin search. La página siguiente es para dar formato a tus resultados de búsqueda. Acepta todos los ajustes por defecto, y sólo haz clic en el botón View results. Cuando tus resultados estén listos, aparece la página results of BLAST. Observa el resumen gráfico, una caja que contiene porciones de líneas coloreadas. Cada línea representa una correspondencia de tu búsqueda BLAST. Si pasas el cursor del ratón sobre una línea roja, laparece una breve descripción del hit. Verás que la primera correspondencia es la opsina roja. Eso es bueno, porque la mejor correspondencia de una secuencia tomada de una base de datos debería ser la propia secuencia. El segundo hit es la opsina verde recuerda que la entrada de PubMed reportó que los pigmentos rojos y verdes son los más similares. Los tercero y cuarto hits son la opsina azul y la rhodopsina del pigmento de las células bastón. Otros hits tienen números más bajos de residuos que corresponden, y están coloreados cifrado según un puntaje de correspondencias. Si haces clic en cualquiera de las líneas coloreadas unas de los, saltarás a más información sobre ese hit, y puedes evaluar cuánto semejanza tiene cada una con la opsina roja, tu secuencia original de consulta. Mientras vas hacia 12

14 abajo de la lista, cada secuencia sucesiva tiene menos en común con la opsina roja. Cada secuencia se demuestra en comparación con la opsina roja en lo qué se llama alineamientos pareados de secuencia. Más adelante, harás alineaciones múltiples de secuencia con las cuales puedes discernir relaciones entre genes. Trata de imaginarte lo que significan las números. Las identidades son los residuos que son idénticos en el hit y la secuencia de consulta (opsina roja), cuando los dos se alinean óptimamente. Los positivos son los residuos que son muy similares en uno y otro (véase el residuo número 1 en la opsina azul, es treonina en la opsina roja, y serina, que es muy similar, en la azul). Los huecos o gaps se introducen a veces en un hit para mejorar su alineación con la secuencia de consulta. Entre más identidades y positivos, y menos los huecos, más alta es la cuenta. Observa que la opsina azul y la rhodopsina son solamente cerca de 45 % idénticas a la opsina roja. Otras proteínas, que no son al parecer pigmentos visuales, tienen incluso cuentas más bajas Interludio: los valores de expectativa y los puntajes de BLAST Estas visualizaciones contienen dos medidas prominentes de la significancia del hit, 1) la cuenta de la BLAST BLAST Score [etiquetada como Score (bits) ], y 2) el valor de expectativa (etiquetado como Expect o E). El puntaje de BLAST indica la calidad de la mejor alineación entre la secuencia de consulta y la secuencia encontrada (hit). Cuanto más alta es la cuenta, mejor es la alineación. Las cuentas son reducidas por las correspondencias inadecuadas y los huecos en la mejor alineación. El cálculo de la cuenta es complejo, implicando una matriz del substitucion, que es una tabla que asigna una cuenta a cada par de residuos alineados. La matriz más ampliamente utilizada para la alineación de proteínas se conoce como BLOSUM62. El valor de expectativa E de un hit dice si es probable que una correspondencia sea resultado de la semejanza azarosa entre el hit y la secuencia de consulta, o de la ancestría común del hit y de la de consulta. (Si E es más pequeño que , se da a veces como 0.0.) El valor de expectativa es el número de hits que esperas obtener simplemente por casualidad si buscaste una secuencia en un genoma al azar del tamaño del genoma humano. E = 25 significa que podrías esperar encontrar 25 correspondencias en un genoma de este tamaño, puramente por casualidad. Así que un hit con E = 25 es probablemente una correspondencia azarosa, y no implica que la secuencia del hit comparta ascendencia común con la secuencia con la que iniciaste la búsqueda. Los valores de expectativa de alrededor 0.1 pueden o no ser biológicamente significativos (otras pruebas serían necesarias para decidir). Pero valores muy pequeños de E significan que el hit es biológicamente significativo; es decir, la 13

15 correspondencia entre tu secuencia de búsqueda y este hit debe ser consecuencia de la ancestría común de ambas secuencias, porque las probabilidades son simplemente demasiado bajas de que el hit pueda presentarse por casualidad. Por ejemplo, E = para un hit en el genoma humano significa que esperas que solamente un hit as i de bueno por casualidad en un billón de millones de diversos genomas del mismo tamaño del genoma humano. La razón por la que creemos que todos venimos de antepasados comunes es que la enorme semejanza de las secuencias en todos los organismos es simplemente demasiado poco probable como para ser una ocurrencia azarosa. Cualquier familia de secuencias similares a través de muchos organismos debe haberse desarrollado a partir de una secuencia común en un antepasado remoto. Un lugar para descubrir más sobre búsquedas y estadísticas de BLAST es la herramienta de análisis de la secuencia de BLAST ( books/bv.fcgi?rid=handbook.chapter.ch16) en el manual de NCBI ( Ahora vamos a ver donde se encuentran todas estas secuencias hit en los cromosomas humanos Dónde (en el genoma humano) están todos los genes para estas otras proteínas? Justo arriba del resumen gráfico (Graphic View), haz clic en Human Genome View. Ahora estás de regreso en el diagrama de los cromosomas humanos y puedes ver todos los hits que encontraste con colores que corresponden a los scores de BLAST tal como los viste en el resumen gráfico. Fíjate en que hay alrededor de 100 proteínas con 40 % o más de positivos al alinearlas con la opsina roja. Las opsinas son miembros de una familia aún más grande que se llama familia de Receptores acoplados a proteínas G que juegan un papel clave en la transducción de señales Relaciones familiares Resumen de lo que viene En esta sección, aprenderás cómo recolectar un grupo de secuencias emparentadas en formato de FASTA, y después usarlas como entradas para el programa ClustalW. 14

16 El resultado es un alineamiento múltiple de secuencias (MSA), con el cual usted puedes deducir muchas cosas sobre la forma en que las secuencias se asemejan y se diferencian entre sí. Luego utilizarás el MSA como entrada a los programas que sirven para dibujar árboles filogenéticos, que son resúmenes visuales de las relaciones de genealogía entre los genes Cómo se relacionan entre sí los diferentes genes de las opsinas? Para contestar esta pregunta necesitamos hacer un alineamiento múltiple de secuencias y luego usarlo para construir un árbol filogenético. Para estas tareas nos vamos a ir a una base de datos diferente, en la que es un poco más fácil reunir muchas secuencias diferentes en un sólo archivo FASTA. Lleva tu navegador a Verás la página de entrada de ExPASy, el sistema de análisis experto de proteínas. Como ya mencionamos, ExPASy es toda una caja de herramientas para estudiar proteínas. Con ExPASy, puedes hacer casi cualquier análisis o comparación imaginable de las secuencias y de las estructuras de las proteínas. En mi humilde opinión, las herramientas suizas de la base de datos suiza de secuencias están entre las más fáciles de usar. Haz clic en UniProt Knowledgebase (SwissProt and TrEMBL) debajo del letrero que dice Databases. Lee la introducción de estas bases de datos. Son bases de datos de muy alta calidad de secuencias de proteínas (no de ácidos nucléicos) y están abundantemente anotadas, sufren de muy poca redundancia y tienen muchas conexiones a otras bases de datos. Haz clic en New UniProt Website. La nueva (2008) página de UniProt contiene ligas a la información sobre este recurso. Haz clic ahí para aprender más sobre el sitio, y después vuelve a esta página. Pon esta página (UniProt Welcome) en tu lista de páginas favoritas como buen punto de partida para el uso futuro de UniProt, de Swiss-Prot, o de TrEMBL. Hasta arriba de la página hay una herramienta de búsqueda engañosamente simple pero de gran alcance. Un menú te permite elegir entre conjuntos de datos a explorar. Echa una ojeada la lista del menú, y regresa a la base de conocimiento de proteínas (UniProtKB). En la caja de captura de texto Query, escribe opsin y haz clic en Search. La búsqueda produce más de 4000 entradas, que son las entradas de proteína que son opsinas o incluyen la palabra o el fragmento de palabra -opsin-. Obviamente, necesitas ser más específico. Limita la búsqueda a las opsinas humanas, como sigue: haz clic en Fields, al lado de la caja Query. El área de búsqueda Search se amplía para incluir un menú con operadores lógicos (con el operador por defecto Y (en inglés, AND)), un 15

17 menú del campo de ficha al que te refieres al especificar una búsqueda Field, y una caja para el término que buscas Term. Bajo Field, escoge Organism. En la caja Term, empieza a mecanografiar human. A medida que escribes, la herramienta de búsqueda te muestra todos los términos de búsqueda permitidos que encajan con lo que has escrito hasta ese momento En el momento en que aparezca human [9606], hazle clic para ponerlo en ña caja Term y haz clic en Add and Search. Fíjate que ahora la caja Query dice opsin AND organism: human [9606]. Esto quiere decir que has limitado tu búsqueda a las entradas relacionadas con opsinas que además (AND) son proteínas humanas. También observa que la liga Links está de nuevo disponible, de manera que puedes agregar más términos adicionales a tu búsqueda, con los operadores lógicos Y, O, y NO (AND, OR y NOT) para especificar cómo utilizar los términos adicionales. Pero la búsqueda es ya bastante específica como para hacer nuestra tarea fácil: hay solamente 25 resultados para esta búsqueda. Antes de mirar los resultados, observa los otros campos que puedes buscar. Las entradas de UniProt son archivos que se dividen en secciones, llamados campos, que contienen de clases específicas de información. Puedes limitar las búsquedas a los términos que residen en campos específicos, o puedes buscar simplemente en las entradas enteras, o sea en todos los campos de las fichas. Ahora mira los resultados. En 2008/09/19, esta búsqueda dio 25 hits, incluyendo la rhodopsina del pigmento de las células de bastones (OPSD), junto con los tres pigmentos del cono (OPSB, OPSG, OPSR). Hay también un receptor de peropsina similar a pigmentos visuales (visual pigment-like receptor peropsin) OPSX, que aún, más de diez años después de su descubrimiento en el genoma, es de función desconocida. En el resto de este tutorial, incluirás esta proteína misteriosa en tus investigaciones sobre los pigmentos visuales de la retina humana Una pequeña digresión Ahora ahora una breve digresión sobre la cuestión de cómo estas proteínas se relacionan evolutivamente, y descubrirás más sobre la peropsina. En el proceso, te harás una idea de la abundancia de la información dentro de, y ligada a, una entrada típica de UniProt. En la columna Accesion, haz clic en O14718, al lado de OPSX HUMAN. A propósito, un número de accesión tal como O14718 se puede utilizar como input para casi cualquier herramienta de ExPASy para el análisis de la secuencia correspondiente. 16

18 Ahora puedes ver la visualización de UniProtKB de la entrada O14718 [nota: ese primer carácter es la mayúscula O, no el número cero (0)]. Lee esta entrada e intenta averiguar que es lo que se piensa que hace esta proteína similar a la rhodopsina. Bajo General Annotation (comments), aprenderás que se encuentra en la retina (en el RPE o epitelio pigmentario retinal), y que puede detectar la luz, o quizás monitorear los niveles de retinoides, la clase general de compuestos que son los que propiamente absorben la luz en las opsinas. Además, bajo Similarity en la misma sección, verás, según lo mencionado anteriormente, que esta proteína es un miembro de la familia grande de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). Si haces clic en G-protein coupled receptor 1 Family, estarás lanzando una búsqueda de miembros de esta familia- cuyo resultado es cerca de hits en UniProt. Limita esta búsqueda a los seres humanos (cerca de 1200 hits). De regreso en la página de O14718 la página, haz clic en Opsin subfamily para encontrar una lista de todos los presuntos miembros de esta subfamilia en UniProt (cerca de 220). Limita la búsqueda a los seres humanos (menos de 20). De nuevo, regresa a la página de la entrada de UniProtKB para O Bajo References encuentra la cita de revista, Peropsin, a novel visual pigmentlike protein located in the apical microvilli of the retinal pigment epithelium. Haz clic en la liga PubMed con esa referencia para ver un extracto (abstract) del artículo. En la página del resumen, haz clic en las ligas Free Full, Text Article para obtener el artículo completo desde el sitio de la revista (PNAS) o el de PubMed Central, que distribuye muchos artículos. Como muchas revistas, PNAS pone los artículos completos en línea tan sólo 6 a 12 meses después de su publicación. Vuelve a O14718, y mira alrededor en la página de la entrada. Usted encontrará referencias recíprocas (Cross References) a esta proteína o a su gen en otras bases de datos, características estructurales predichas de la proteína, y la secuencia, que puedes tomar en formato de FASTA si quieres buscar más de sus parientes. Observa también las ligas a un número de herramientas de ExPASy para el análisis adicional de esta secuencia. Prueba con una de ellas: bajo Cross-references, encuentra PROSITE, y haz clic en Graphical view, la visualización gráfica. Ahora tienes una forma que te permita buscar las firmas de función o los sitios funcionales en la peropsina. Deja todos los ajustes como están, y haz clic en scan al lado de la imagen gráfica (verde) de la proteína. Aquí hay otra forma, con el número de accesión O14718 ya incorporado. Una vez más deja el resto de los ajustes como están (pero nota que hay muchas maneras de modificar esta búsqueda), y haz clic en START THE SCAN. PROSITE encuentra tres cosas identificables sobre esta secuencia. Un hit by profileïdentifica a la peropsina como un receptor acoplado a proteína G. También se 17

19 muestran dos hits by pattern. Uno es una secuencia corta que además permite identificar a la peropsina como una GPCR, mientras que el segundo hit identifica un sitio de enlace para retinal. PROSITE indica tan que, al igual que sus parientes las opsinas visuales, la peropsina también une específicamente al retinal, el pigmento visual que nosotros fabricamos a partir de la vitamina A. Observa también que, por semejanza con otras proteínas relacionadas, PROSITE predice la presencia de un enlace disulfuro, entre los residuos 98 y 175. (Más adelante, descubrirás más sobre la estructura tridimensional de la peropsina construyendo un modelo de esta. Utilizarás una proteína relacionada de estructura conocida como plantilla para hacer este modelo. Este proeceso se llama modelado por homología.) Final de la digresión Ahora contestarás la pregunta principal de esta sección: cómo se relacionan unos con otros los pigmentos visuales (y la peropsina)? Al parecer, divergieron de una opsina ancestral común, pero puedes conseguir un cuadro mucho más claro de cual de estas opsinas vino primero, y cuáles son las más estrechamente vinculadas. Para contestar a esta pregunta, alinearás todas tus secuencias (lo que se llama una alineación múltiple de secuencias) y después producirás un pequeño árbol de la familia. Uni- Prot proporciona un fácil acceso a ClustalW, un programa que hace las alineaciones múltiples de secuencia super rápido, así como tambien la información necesaria para imprimir un árbol filogenético a partir de la información de la alineación. Regresa a los resultados de la búsqueda de UniProt, con sus 25 hits para las entradas del genoma humano que incluyen la descripción opsins. Tu tarea siguiente es comparar las secuencias de peropsina y de cuatro pigmentos visuales. Comienza haciendo clic para poner palomitas en la columna izquierda de la tabla de resultados, al lado de las primeras cuatro opsinas de las entradas (rhodopsina y las opsinas sensibles al azul, al rojo y al verde) y también en la fila para la peropsina, O Mientras que pones en la primera palomita, una banda verde aparece en la parte inferior de la ventana, proveyendo una barra de herramientas con opciones para manejar múltiples secuencias. Después de que hayas comprobado las entradas según lo indicado, haz clic en el botón de alinear (Align) en la barra verde de herramientas. Esto es una petición de utilizar ClustalW para hacer una alineación de múltiples secuencias usando las entradas seleccionadas. La página de los resultados de Clustalw aparece. En la parte de arriba, en la caja Sequences, están los listados en formato FASTA de todas las secuencias comparadas. Tómate un momento para corregir este listado para hacer alineaciones y los árboles subsecuentes más fáciles interpretar. En las secuencias FASTA enumeradas 18

20 en la caja Sequences, haz los cambios siguientes: 1. Cambia P03999 a azul 2. Cambia P08100 a Rhodopsina 3. Cambia P04001 a verde 4. Cambia P04000 a rojo 5. Cambia O14718 a Peropsina Después de corregir, haz clic en Align para hacer de nuevo la alineación con los nuevos encabezados. Para guardar esta alineación en el formato necesario para la sección siguiente, haz clic en el botón anaranjado TEXTO a la derecha de Clustalw Results. Copia el archivo de texto que se exhibe, pégalo en un nuevo archivo de texto, y nómbralo OpsinMSAEditado.txt. Ahora regrésate a los resultados de Clustalw. Debajo de la tabla que nombra cada opsina con sus nuevos títulos está la alineación múltiple de secuencias. En bloques de 60 residuos, Clustalw ha alineado cinco secuencias. Debajo de cada columna de cinco residuos, los símbolos indican que tan bien se emparejan los residuos de las cinco proteínas. * significa que las 5 proteínas alineadas tienen el mismo residuo de aminoácido en esta posición (residuos completamente conservados, dentro de este grupo); : significa que todos los residuos en esta posición son muy similares de tamaño, carga, y polaridad (los reemplazos son muy conservadores);. significa que son clase de aminoácidos similares (los reemplazos algo conservadores); y la ausencia de símbolo significa que los residuos en esa posición varían grandemente en las características (residuos no conservados). (Qué sugiere cada símbolo sobre la importancia de ese residuo en la función de esta familia de proteínas?) En la parte inferior de la página de resultados hay varias barras de herramientas. Juega con las primeras dos para ver lo que hacen. Encontrarás que modifican la visualización del alineamiento de secuencias múltiples para destacar tipos de los residuos o las firmas de la proteína. Usando estas herramientas, puedes conseguir una visíon general de semejanzas y de diferencias entre las proteínas. Pero la comparación se puede hacer mucho más explícita usándola para hacer un árbol filogenético para este grupo de proteínas. La anterior barra de herramientas proporciona un árbol de ClustalW. Aprenderás más sobre el significado de varios tipos de árboles más adelante. Como puedes ver en la parte inferior, esta página también proporciona la información necesaria para imprimir un árbol con más flexibilidad, y una herramienta en la Universidad de Indiana puede utilizar esa información. Desafortunadamente, este árbol 19

21 no es un árbol filogenético verdadero; es un árbol simple que demuestra el orden en que ClustalW realizó las alineaciones pareadas mientras que construía la alineación múltiple de secuencias. Este árbol demostrará los pares que son más estrechamente vinculados el uno al otro, pero debes utilizar un programa de generación de árboles de mayor alcance para obtener un árbol más riguroso. NOTA: Este tipo de archivo de trabajo del árbol de ClustalW tiene siempre un sufijo o terminaci on de.dnd. Para los árboles filogenéticos realmente buenos, no utilices los archivos de.dnd. De todas formas, podemos utilizar este árbol simplemente para aprender cómo imprimir árboles una vez que usted tenemos uno confiable de cualquier fuente (sección siguiente). Este procedimiento funcionará si tienes archivos de descripción del árbol en el formato Newick, y ese es precisamente el caso para el archivo del árbol proporcionado en esta página. Consigue el archivo que necesitas para hacer un árbol yendo a la parte superior de la página y haciendo clic en el botón anaranjado TREE. Tu navegador mostrará un archivo de texto muy pequeño, que debe de estar lleno de paréntesis. Copia y salva este archivo como ClustalwTreeData.txt. Éste es los datos en el formato de Newick, un formato de descripción de árboles ampliamente utilizado por los programas de impresion de árboles. Utilizarás los datos en este archivo para imprimir tu primer árbol. Un impresor de árboles bastante bueno, Phylodendron, está situado en Cuando llevas tu navegador a este URL, encuentras la forma de entrada para este impresora de árboles filogenéticos. Pega el contenido de tu ClustalwTreeData.txt en la caja de los datos del árbol cerca de la parte superior de la forma. Escribe un título en la caja de título, algo como Árbol de la Familia de Opsinas ;. Para conseguir un árbol que se parezca al mío (abajo, figura 0.7.3), escoge Phenogram de los estilos del árbol en la parte superior. Luego bajo Extra options, selecciona: Format: GIF image; anchura y altura: 400 pixeles, Font: Helvetica; Estilo: llano; Tamaño: 12. Deja el resto de los ajustes como los encontraste, y escribe Submit. Tu árbol debe aparecer en tu navegador. Guárdalo como OpsinTree.gif. Asegurate de quitar el.cgi del nombre por default, de modo que tu archivo sea reconocible como archivo del GIF normal. Puedes pegar estos archivos en los documentos para los informes y las publicaciones. Juega con otras opciones en Phylodendron, y ve cómo afectan a la imagen del árbol. Con los ajustes dados arriba, mi árbol es como el que se ve en la figura En un árbol filogenético verdadero (éste no lo es), la dimensión representada en el eje horizontal puede ser el tiempo (si se cumplen ciertas condiciones sobre la evolución de las secuencias) y la longitud de las ramas representa que tan diferentes son 20

22 Figura 1: Un fenograma de las opsinas 21

23 las secuencias entre sí. La dimensión vertical no tiene una interpretación especial. Cada extremidad representa una secuencia actualmente existente. Cada bifurcación representa una secuencia ancestral (casi siempre hipotética), y un acontecimiento de divergencia entre los linajes a los que pertenecen dos secuencias actuales. La distancia horizontal entre una bifurcación y las extremidades de la bifurcación representa el tiempo desde esa divergencia. Como este árbol, la mayoría de los árboles producidos por las herramientas de la bioinformática son árboles no enraizados; es decir, el árbol demuestra las distancias, basadas en diferencias de la secuencia, entre las extremidades, pero no intenta demostrar el orden en que ocurrieron las ramificaciones; por ejemplo, parece que la figura indica que la divergencia entre la opsina azul y la rhodopsina ocurrió antes que la divergencia entre la opsina roja y la verde pero no se vale sacar este tipo de conclusiones de un árbol no enraizado. Los programas de comparación de secuencias no pueden imaginar la orden o la dirección de la evolución. Pueden determinar solamente la magnitud de diferencias entre secuencias. Si tu sabes qué secuencia es el progenitor de todas las otras o bien que secuencia representa al grupo hermano de todas las demás secuencias incluídas en un árbol(en este caso nosotros no lo sabemos), puedes arraigar el árbol con esa secuencia. El resultado será que la primera rama separará esa secuencia de las otras. Resulta que nuestro árbol puede ser arraigado con la peropsina, y por eso muestra la primera rama como la divergencia de la peropsina del progenitor del resto de las opsinas. Programas más avanzados de construcción de árboles permiten que elijas la secuencia de la raíz para un árbol, pero recuerda que la pura información de la secuencia no te dirá donde poner la raíz Cuidado! Las conclusiones del párrafo anterior se basan en el examen de este árbol impreso. Veremos más adelante que este árbol es muy similar a un árbol hecho por un método más riguroso. Esto significa simplemente que este árbol particular es fácil de determinar. La mayoría de los árboles no son así de fáciles, y métodos más rigurosos darán resultados que son substancialmente diferentes de los que se obtienen con el archivo de trabajo.dnd de ClustalW. Recuerda también que la verdad de cualquier conclusión extraída de un árbol depende de la exactitud de la alineación múltiple de secuencias y de los scores de la alineación. En este tutorial estás utilizando ajustes por defecto en muchos parámetros ocultos en los procesos de comparar y de alinear secuencias. Si quieres extraer conclusiones sobre las relaciones filogenéticas que sobrevivan al escrutinio científico, necesitas aprender mucho más sobre los funcionamientos internos de las herramien- 22