AVANCES EN TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN PEQUEÑOS RUMIANTES. Antonio Gonzalez-Bulnes

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1 AVANCES EN TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN PEQUEÑOS RUMIANTES Antonio Gonzalez-Bulnes Departamento de Reproducción Animal, INIA. Avda. Puerta de Hierro s/n, Madrid, Spain. Resumen El uso de tecnologías de embriones en pequeños rumiantes se ha incrementado en los últimos años, debido tanto a una mayor demanda como a un aumento en la eficiencia de los protocolos y técnicas utilizados. Sin embargo, aún existen puntos críticos susceptibles de mejora; los principales son una alta variabilidad en el número final de embriones transferibles, tanto in vivo como in vitro, en los rendimientos obtenidos después de aplicar técnicas para conservación de los embriones y en la selección y manejo de las hembras receptoras. Esta revisión tiene como objetivo analizar el estado actual de estas técnicas. Palabras clave:oveja, Cabra, Superovulación, Embrión, Congelación de embriones, Transferencia de embriones. Título corto: Avances en transferencia de embriones en pequeños rumiantes Introducción El uso práctico de procedimientos para la producción y transferencia de embriones se ve afectado por uma alta variabilidad en el número de embriones transferibles y de crías nacidas finalmente, tanto in vivo como in vitro entre animales y entre grupos de tratamiento. En la producción in vivo, esta variabilidad se ha relacionado con una falta de uniformidad en la respuesta ovárica a los tratamientos de superovulación necesarios para aumentar el número de embriones. Entre las posibles causas destacan factores extrínsecos (origen, pureza y protocolo de administración de las gonadotropinas) e intrínsecos (raza, edad y estados nutricional y reproductivo); sin embargo, la información actual señala que los factores más importantes serían aquellos de origen ovárico. Posteriormente, los rendimientos se verán afectados por alteraciones en los procesos de fertilización y en la viabilidad de los embriones durante los estadios tempranos de desarrollo. En la producción in vitro, la variabilidad en los resultados se ha relacionado con la eficiencia en La recuperación de los oocitos y en los procesos de maduración, fertilización y cultivo de esos oocitos. Si son usados, también debe considerarse la variabilidad en la respuesta a los tratamientos de superovulación. En ambas técnicas, la posibilidad de almacenar los embriones es esencial en cualquier programa de mejora genética e, incluso mas aún, en cualquier programa de conservación de razas o especies en peligro de extinción. Los procedimientos para la conservación de los embriones son también un punto crítico de la técnica, afectando la viabilidad de los embriones. Finalmente, los rendimientos después de la transferencia de embriones están afectados por la capacidad de las hembras receptoras para mantener la gestación hasta el nacimiento y, posteriormente, por su aptitud maternal. Producción de embriones in vivo En la producción in vivo, como se describe anteriormente, los puntos críticos son la variabilidad en La respuesta ovárica a los tratamientos de superovulación necesarios

2 para aumentar el número de embriones, lãs alteraciones en los procesos de fertilización y en la viabilidad de los embriones durante los estadios tempranos de desarrollo. La variabilidad en la respuesta ovárica ha sido relacionada con factores extrínsecos (origen, pureza y protocolo de administración de las gonadotropinas) y factores intrínsecos (raza, edad y estados nutricional y reproductivo). Los efectos derivados del origen y pureza de las gonadotropinas fueron identificados en los primeros estudios, que describieron una alta variabilidad asociada con las preparaciones comerciales de FSH, debido a factores como el lote de gonadotropinas usado (Wollen et al., 1985) y, principalmente, el variable contenido en LH (Lindsell et al., 1986), que disminuye la respuesta superovulatoria (Chupin et al., 1987, Torres et al., 1987). Estas observaciones favorecieron el uso de preparados comerciales de gonadotropinas altamente purificadas; sin embargo, cantidades excesivamente bajas de LH al final del tratamiento también inducen bajas tasas de ovulación y alta variabilidad en la respuesta ovulatoria (Picton et al., 1990; Cognie 1999). Por otro lado, la eficiencia de dosis decrecientes, en términos de tasa de ovulación y número medio de embriones recuperados y viables, es mayor que en protocolos con dosis constantes. En cuanto a los factores intrínsecos, el efecto de la raza fue pronto identificado (Bindon et al., 1986) y, como regla general, la respuesta superovulatoria es mejor en razas prolíficas (Nuti et al., 1987; Dufour et al., 2000). La influencia de la edad sobre los protocolos superovulatorios es también bien conocida; las hembras prepúberes pueden ser inducidas a superovular, pero la tasa de ovulación es menor que en adultas (Driancourt y Avdi, 1993); en éstas, los mejores rendimientos son obtenidos hasta los 6 años de edad (Torres et al., 1987). La relación entre nutrición y rendimientos en embriones ha sido establecida en animales subalimentados, en que está comprometida la competencia de folículos y oocitos (O Callaghan et al., 2000), la función luteal (Jabbour et al., 1991) y el desarrollo embrionario (Abecia et al., 1997). El estado reproductivo, específicamente los periodos de anestro (estacional, postparto) tiene también un papel determinante en la eficiencia de los tratamientos superovulatorios (Driancourt y Avdi, 1993; Mitchell et al., 2002a,b), aunque no existen diferencias entre animalesen estación o en anestro estacional en áreas templadas (Baril y Vallet, 1990; Lopez-Sebastian et al., 1990; Samartziet al., 1995; Gonzalez-Bulnes et al., 2003a, 2003b). Entre los factores relacionados con el estado reproductivo, el estado ovárico es considerado clave en lasuperovulación. Actualmente, se acepta que, a pesar del origen de las hormonas y su protocolo de administración,tanto la tasa de ovulación como los rendimientos en número de embriones están estrechamente relacionados conel número de folículos capaces de responder a las gonadotropinas que se encuentran presentes en el ovario en elmomento de administración de la primera dosis de FSH y están favorecidos por la ausencia de folículos dominantesy la presencia de cuerpos lúteos (Gonzalez-Bulnes et al., 2004). Producción de embriones in vitro En la producción in vitro, como se ha descrito anteriormente, los puntos críticos son la eficiencia en larecuperación de oocitos y en los procesos de maduración, fertilización y cultivo. La recuperación de los oocitos puede ser realizada post-mortem, de ovarios procedentes de mataderos(cognie, 1999); esta es una forma barata, fácil y abundante para obtener oocitos para investigación, pero no es útil en programas de mejora o conservación genética. La alternativa es el ovum pick up, o punción folicular, ya seapor laparoscopía o laparotomía; la laparoscopía, menos invasiva, sería el procedimiento de

3 elección (Baldassarre et al., 1996). Habitualmente, el ovum pick-up es combinado con tratamientos de superovulación; el éxito está determinado por el intervalo entre la estimulación y la recogida, por el flujo de aspiración y por los diámetros de catéteres y agujas (Cognie et al., 2004). Los oocitos recuperados en un protocolo in vitro son inmaduros y necesitan, pues, La adquisición de competencia meiótica. Esto se consigue añadiendo fluido folicular a medios de maduración conteniendo FSH y TCM-199; pero tiene el inconveniente derivado de ser un medio no definido, así que los esfuerzos están centrados en la puesta a punto de un medio definido. La adición de factores de crecimiento, principalmente EGF (Guler et al., 2000), y precursores del glutation, como la cisteamina (Rodriguez- Gonzalez et al., 2003), parecen prometedores. Después de la maduración, los oocitos necesitan ser fertilizados. La adición de semen viable es también un punto crítico. El semen puede ser seleccionado, bien por Swim-up o gradientes de Percoll, e incubado posteriormente en medios de capacitación, que normalmente contiene suero de oveja en celo. De nuevo, esto tiene el inconveniente de ser un medio no definido; lo mismo puede decirse de los medios de cultivo in vitro, ya que los más eficientes son en cocultivo con células somáticas, principalmente de oviducto, o en medios semidefinidos (Cognie et al., 2004). Conservación de embriones Los embriones de pequeños rumiantes pueden ser conservados mediante métodos de congelación convencionales o mediante vitrificación. En la congelación tradicional, la viabilidad de los embriones esta afectada por el agente crioprotector (tipo, concentración y método de adición y retirada), el estadio del embrión y la velocidad del procedimiento de congelación y descongelación. Actualmente, se asume que el etilenglicol es el mejor crioprotector para la congelación de embriones (Cocero et al., 1988; Massip, 2001). En segundo lugar, el efecto Del estadio de desarrollo embrionário es también determinante (Massip et al., 1989; Cocero et al., 1996); así, los blastocistos resisten mejor los procedimientos de criopreservación que las mórulas o los embriones tempranos de entre 2-16 células (Garcia- Garcia, 2003). Finalmente, la velocidad de congelación/descongelación permanece como el factor limitante más importante. Diferentes estudios han mostrado que las altas velocidades permiten mejores resultados y, así, La vitrificación se perfila como la alternativa a los problemas inherentes a los métodos convencionales com deshidratación gradual y congelación/descongelación lentas (Rall, 1987; 1992). Hoy día, el objetivo es el uso de pajuelas con el extremo abierto (open-pulled straw; Dattena et al., 2001; El-Gayar y Holtz, 2001), en combinación con la transferencia de los embriones directamente tras su descongelación (Baril et al., 2001; Isachenko et al., 2003). Transferencia de embriones El paso final en las tecnologías de producción de embriones es su transferencia a las hembras receptoras. El éxito está determinado por factores relacionados tanto con la receptora como con la calidad del embrión. La calidad de los embriones, como se describía, está fuertemente determinada por el procedimiento de manejo y, específicamente, por los procedimientos de congelación y descongelación. Los factores relacionados con las hembras receptoras son la raza, la edad, la nutrición, la salud y el estado reproductivo. Por oto lado, uma buena respuesta al tratamiento de sincronización debe ser también considerada, ya que una buena calidad de lãs ovulaciones y una buena sincronización entre donantes y receptoras son críticas. Estos factores determinan la

4 aptitud de la hembra receptora para mantener la gestación; así que la elección de las receptoras más adecuadas es decisiva para mejorar los resultados de un protocolo de transferencia de embriones (Alabart et al., 1995, 2003). Las condiciones ováricas y uterinas de las receptoras son obviamente relevantes. En nuestro grupo, se utiliza la ecografía transrectal para el examen del ovario y útero de las posibles receptoras y, así, rechazar aquellas con respuesta ovulatoria inadecuada o con alteraciones ováricas o uterinas. Los ultrasonidos son también útiles para diferencia verdaderos cuerpos lúteos de folículos anovulatorios luteinizados (Gonzalez-Bulnes et al., 1999); y, lo que es más, las características morfológicas y ecogénicas del cuerpo lúteo están relacionadas con su secreción de progesterona y son, por ello, útiles para determinar la función luteal y La capacidad para mantener la gestación (Gonzalez-Bulnes et al., 2000). Estas acciones han mostrado ser útiles para aumentar la probabilidad de éxito en la transferencia, permitiéndonos alcanzar hasta un 80% de fertilidad al parto (Santiago-Moreno et al., 2001). Conclusiones Actualmente, la mayoría de los aspectos técnicos de las tecnologías de embriones han sido mejorados; los avances futuros deben basarse en un amplio conocimiento de la endocrinología y la fisiología ováricas, tanto em las hembras donantes como receptoras. Esto dará lugar a nuevos tratamientos para mejorar el número de embriones transferibles obtenidos por hembra donante y para mejorar la fertilidad de las hembras receptoras. La conservación de los embriones sería el tercer punto a considerar. Referencias bibliográficas Abecia JA, Lozano JM, Forcada F, Zarazaga L. Effect of level of dietary energy and protein on embryo survival and progesterone production on day eight of pregnancy in Rasa Aragonesa ewes. Anim Reprod Sci 1997; 48: Alabart JL, Folch J, Fernandez-Arias A, Ramon JP, Garbayo JM, Cocero MJ. Screening of some variables influencing the results of embryo transfer in the ewe. Part II: two-dayold embryos. Theriogenology 2003; 59: Alabart JL, Folch J, Fernández-Arias A, Ramón JP, Garbayo A, Cocero MJ. Screening of some variables influencing the results of embryo transfer in the ewe. I. Five-day-old embryos. Theriogenology 1995; 44: Baldassarre H, Furnus CC, De Matos DG, Pessi H. In vitro production of sheep embryos using laparoscopic folliculocentesis: Alternative gonadotrophin treatments for stimulation of oocyte donors. Theriogenology 1996; 45: Baril G, Traldi AL, Cognie Y, Leboeuf B, Beckers JF, Mermillod P. Successful direct transfer of vitrified sheep embryos. Theriogenology 2001; 56: Baril G, Vallet JC. Time of ovulation in dairy goats induced to superovulate with porcine follicle stimulating hormone and out of the breeding season. Theriogenology 1990; 34:

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