UNIVERSIDAD VERACRUZANA

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1 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MEIF QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO TRABAJO PRÁCTICO CIENTÍFICO SÍNTESIS ENZIMÁTICA DE ALCAMIDAS ANÁLOGAS DE CAPSAICINA PRESENTA LUIS EDGAR DOMÍNGUEZ BERNABE ERIKA ARIANA JUÁREZ HERNÁNDEZ DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL DRA. ESMERALDA SÁNCHEZ PAVÓN ORIZABA, VER. MAYO, 2011

2 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS v ABREVIATURAS vi 1 INTRODUCCIÓN 7 2 JUSTIFICACIÓN 10 3 OBJETIVOS Objetivo General Objetivos Específicos 13 4 ANTECEDENTES Generalidades de metabolitos secundarios Alcamidas Capsaicinoides Propiedades Físico-Químicas de los Capsaicinoides Pungencia Síntesis de alcamidas Síntesis química Síntesis enzimática Características de las lipasas Lipasa de Cándida Antárctica Capsaicinoides dentro de la industria 25 5 MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos 27 ii

3 5.1.2 Material y equipos Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG/MSD) Metodología Preparación de placas cromatografías en capa fina (CCFP) Hidrólisis de Ester de pera y Afinina Síntesis enzimática de capsaicinoides 29 6 DISCUSIÓN Y RESULTADOS Aminas terciarias como base de elección en la síntesis Efecto de disolvente (Alcohol) Síntesis enzimática y purificación de capsaicinoides CG/MS 41 7 CONCLUSIONES 46 8 BIBLIOGRAFÍA 48 iii

4 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Reacción general de síntesis de Capsaicinoides. 11 Figura 2. Molécula de Piperina 16 Figura 3. N-isobutil-2E, 6Z, 8E-decatrienamida (afinina) 17 Figura 4. N-(4-hidroxi-3-metoxibencil)-8-metil-6E-nonenamida (capsaicina) 17 Figura 5. Principales capsaicinoides presentes en los frutos de Capsicum 20 Figura 6. Reacción de sustitución y desplazamiento para la obtención de amidenina (2E, 4Z- decadien amida) a partir del éster de pera sintético. 22 Figura 7. Reacción enzimática de amidas utilizando enzima inmovilizada Lipasa Novozym 435 de Cándida antárctica 25 Figura 8. Estructura de DIPEA 31 Figura 9. Estructura de Trietilamina 31 Figura 10. Mecanismo de reacción liberar el clorhidrato de vainillilamiana 32 Figura 11. Reacción de esterificación de alcoholes primarios, secundarios y terciarios. 33 Figura 12. alcohol ter-butanol (2-metil-2-propanol) y alcohol ter-amilico (2-metil-2-butanol) 34 Figura 13. Resultados de cromatograma en CG/MS 36 iv

5 Figura 14. Reacciones enzimáticas partiendo de aminas aromáticas (primarias) y ácidos, catalizadas por una enzima inmovilizada 38 Figura 15. Reacciones enzimáticas partiendo de aminas aromáticas (primarias) y ácidos catalizadas por una enzima inmovilizada 39 Figura 16. Alcamidas obtenidas con los productos de hidrólisis 40 Figura 17. Reacciones enzimáticas de hidrólisis de afinina y éster de pera catalizada por una enzima inmovilizada 41 Figura 18. Cromatograma del producto de la reacción 3d 42 Figura 19. Espectro de masas del compuesto con Rt= min 43 Figura 20. Comparación cabeza-cola del espectro de masas del ácido undecanoico 43 Figura 21. Espectro de masas del compuesto con Rt = min 44 Figura 22. Comparación cabeza-cola del espectro de masas del producto de la síntesis enzimática 3d 45 Tabla 1. Alcamidas sintetizadas por medio de diferentes ácidos carboxílicos en presencia de NH 4 OH. 22 Tabla 2. Tabla de rendimientos en relación a equivales de la base 35 v

6 ABREVIATURAS CAL-B CCF CCFP CG/MSD DCC Et 3 N H NH 4 OH Na 2 SO 4 THF UV Lipasa de Cándida Antárctica fracción B Cromatografía en capa fina Cromatografía en capa fina preparativa Cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas. Diciclohexilcarbodiimida Trietilamina Hora Hidróxido de amonio Sulfato de sodio Tetrahidrofurano Luz ultravioleta visible vi

7 1. INTRODUCCIÓN Si quieres ser sabio, aprende a interrogar razonablemente, a escuchar con atención, a responder serenamente y a callar cuando no tengas nada que decir. Johann Kaspar Lavater ( ) Filósofo, poeta y teólogo suizo.

8 Introducción Las plantas producen una gran cantidad y diversidad de compuestos orgánicos que no parecen tener una función directa en el crecimiento y desarrollo. Estas sustancias se conocen con el nombre de metabolitos secundarios, productos secundarios, o productos naturales. Los metabolitos secundarios no tienen función reconocida o directa en los procesos de fotosíntesis, respiración, transporte de solutos, síntesis de proteínas, asimilación de nutrientes, en otros. Se creía que estos compuestos eran sencillamente productos finales del metabolismo sin función o metabolitos de desecho. Posteriormente, se descubrió que muchos metabolitos secundarios poseían importantes funciones ecológicas en las plantas. 1 Entre los principales grupos de metabolitos secundarios se encuentran las alcamidas, que desde el punto de vista biogénico se forman al combinarse dos diferentes rutas metabólicas. Las alcamidas son consideradas bioactivas debido a que una pequeña cantidad de ellas produce una notable respuesta a las células receptoras. Se manifiestan en unos cuantos grupos de plantas de los cuales los más importantes están presentes en las familias Astaraceae, Sonalaceae (familia de las papas), específicamente en la especie de Capsicum (chiles) y en la familia Piperaceae (familia de la pimienta). El compuesto bioactivo más importante del genero Capsicum es la alcamida capsaicina que es realmente una alquenamida, su estructura tiene similitud con la afinina encontrada en casi todas las especies con alcamidas. La diferencia más importante en sus estructuras es, en capsaicina, la presencia de un anillo aromático que la hace más pungente, por otro lado esta carece de una doble ligadura conjugada al carbonilo de las alcamidas del chilcuague, que le confiere propiedades bactericidas, fungicidas e insecticidas. 2 El chile es el saborizante más importante en la actualidad y contiene un grupo de compuestos químicos denominados capsaicinoides. Hoy en día, se utiliza en aplicaciones farmacéuticas, cosméticas y alimentarias, así como también en preparación de gases lacrimógenos para defensa personal. 8

9 Introducción Ya que las alcamidas son un grupo de compuestos de gran importancia y al ser de bajo rendimiento su extracción mediante plantas, se ha recurrido a la síntesis de estos compuestos las cuales tienen lugar en condiciones de laboratorio mediantes métodos químicos o enzimáticos. El descubrimiento de que algunas enzimas son activas catalíticamente en solventes orgánicos propicia a que puedan ser utilizadas como biocatalizadores, la síntesis enzimática constituye una estrategia mediante la cual se pueden obtener moléculas de alcamidas similares a las que son producidas naturalmente por las plantas. Por lo cual en este trabajo se lleva a cabo la síntesis enzimática de alcamidas análogas de capsaicina, debido a que presentan gran interés farmacológico y económico. 9

10 2. JUSTIFICACIÓN El ignorante afirma, el sabio duda y reflexiona. Aristóteles (384 AC-322 AC) Filósofo griego.

11 Justificación Los metabolitos secundarios como los capsaicinoides son de gran interés en la actualidad por su amplia aplicación en la sociedad, siendo de utilidad en diferentes industrias como la farmacéutica, alimentaria, cosmética entre muchas más. Los procesos de extracción de estos metabolitos a grandes escalas pueden llegar a tener un impacto masivo sobre la flora y la fauna de nuestro ecosistema. Por lo cual, es de mayor interés optimizar métodos para la obtención de estos metabolitos sin dañar el medio ambiente, una de las soluciones es la síntesis química de dichos productos, permitiendo obtener un mejor rendimiento y purificación, haciendo una óptima viabilidad de estos para utilizarlos en el campo requerido. Los productos a sintetizar se muestran en la figura 1. Figura 1. Reacción general de síntesis de Capsaicinoides. 11

12 3. OBJETIVOS Lo que sabemos es una gota de agua; lo que ignoramos es el océano. Isaac Newton ( ) Matemático y físico británico.

13 Objetivos 1.1 Objetivo General Sintetizar enzimáticamente alcamidas análogas de capsaicina 1.2 Objetivos Específicos Hidrolizar enzimáticamente el 2E,4Z decadienoato de etilo (éster de pera), N-isobutil-2E,6Z,8E-decatrienamida (afinina), para posteriormente ser utilizado en la síntesis de capsaicinoides. Sintetizar alcamidas análogas de capsaicina utilizando como precursores: esteres, ácidos y aminas aromáticas catalizadas por una lipasa. Identificar y cuantificar los productos de las reacciones mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CG/MS. 13

14 4. ANTECEDENTES Todos somos muy ignorantes. Lo que ocurre es que no todos ignoramos las mismas cosas. Albert Einstein ( ) Científico Alemán

15 Antecedentes 4.1 Generalidades de metabolitos secundarios. Las plantas son productoras de dos diferentes tipos de metabolitos, los primarios y los secundarios. Los metabolitos primarios son sustancias esenciales para que el organismo pueda llevar a cabo su desarrollo y reproducción. Estos metabolitos se caracterizan por tener una función metabólica directa, ser compuestos esenciales intermedios en las vías catabólica y anabólica y encontrarse en todas las plantas. De igual manera existen los metabolitos secundarios, los cuales son sustancias químicas que no son necesarias para el desarrollo y subsistencia de la planta. En algún tiempo se llegó a pensar que los metabolitos secundarios no tenían un papel definido, sin embargo, algunos autores indican que constituyen señales químicas importantes para el ecosistema. La distribución de estos metabolitos es restringida a ciertas plantas, la cual muchas veces es característico de un género dado o una especie dada, algunas funciones de estos metabolitos son, la interacción de la planta con su entorno (competencia), donde la planta tiene la característica de sintetizar sustancias alelopáticas para inhibir el crecimiento de plantas vecinas, la interacción planta microorganismo (defensa), debido a que la planta está expuesta a cualquier tipo de ataque, ya sea por insectos, herbívoros o microorganismos patógenos, y la interacción planta insecto (reproducción), en la cual la planta sintetiza esencias para atraer a polinizadores así como una gama de colores diferentes. Los metabolitos secundarios son de gran interés ya que el hombre los ha utilizado para la elaboración de diferentes productos, los cuales son de una gran importancia económica y farmacológica. 4.2 Alcamidas Dentro del grupo de las amidas existen productos con actividad biológica denominadas alcamidas, reciben este nombre debido a que tienen unida a su estructura una cadena alquílica, su importancia radica en la actividad de efectos que presentan, dependiendo de su estructura y el número de enlaces o dobles ligaduras que contienen. 3 15

16 Antecedentes Las alcamidas son un grupo de metabolitos secundarios que comprenden un conjunto de aproximadamente 200 compuestos distribuidos en las plantas. 4 Estas representan una clase singular de productos naturales que desde el punto de vista biogénico, se forman al combinarse dos diferentes rutas metabólicas, conocidas como ruta del fenilpropaoide y ruta de síntesis de ácidos grasos. De igual manera son consideradas compuestos bioactivos, esto es, una pequeña cantidad del compuesto evoca una respuesta notable en las células receptoras. Las alcamidas por su actividad bactericida y fungicida deben constituir un elemento de defensa en especies vegetales pertenecientes a grupos taxonómicos muy distantes. La mayor parte de las especies en las que se han encontrado alcamidas han sido frecuentemente utilizadas por el hombre como plantas medicinales. 5 Se han realizado diferentes estudios en plantas productoras de alcamidas entre ellas existe el estudio de Acmella radicans es una planta anual de la familia de las Asteraceas que ha sido reportada por contener un gran número de alcamidas. 6 Sin embargo el cultivo de esta planta es de bajo rendimiento debido a su pobre propagación vegetativa y su baja tasa de germinación en los invernaderos. 7 En Piper nigrum de igual manera ha encontrado la capacidad de sintetizar alcamidas siendo la piperina (figura 2) la principal alcamida presente en esta planta. Las alcamidas presentes en los frutos de esta planta son los principales responsables del sabor picante de la pimienta, aunque también caracterizan su sabor el notable surtido de alcaloides. Figura 2. Molécula de Piperina 16

17 Antecedentes Heliopsis longipes es una planta cuyas raíces son conocidas con el nombre de chilcuague. En la medicina tradicional se utiliza como analgésico, anestésico local, así como antibiótico para infecciones del aparato respiratorio y digestivo. Esta planta acumula gran cantidad de alcamidas en sus raíces, crece de forma silvestre y también de manera rudimentaria. La afinina (figura 3) es la principal alcamida responsable de los efectos biológicos observados en esta raíz, entre los que se pueden considerar la actividad anestésica local, saborizante, insecticida y bactericida. 5 Figura 3. N-isobutil-2E, 6Z, 8E-decatrienamida (afinina) De igual manera el género Capsicum que incluye trece especies de chiles es productor de alcamidas. Todas las especies de este género presentan propiedades organolépticas, similares en diferente grado y se encuentran contenidas exclusivamente en los frutos. Su producto bioactivo importante es la alcamida denominada capsaicina (figura 4), su estructura tiene similitud con la afinina encontrada en todas las especies con alcamidas. La diferencia más importante en sus estructuras es, en capsaicina la presencia de un anillo aromático que la hace mayormente pungente, la capsaicina carece de una doble ligadura conjugada al carbonilo de las alcamidas del chilcuague que le confiere propiedades bactericidas, fungicidas e insecticidas. 5 Figura 4. N-(4-hidroxi-3-metoxibencil)-8-metil-6E-nonenamida (capsaicina) 17

18 Antecedentes 4.3 Capsaicinoides Los chiles son frutos de plantas del genero Capsicum los cuales se caracterizan por su sabor pungente o picor siendo el responsable de este la presencia de capsaicinoides. Los capsaicinoides son un grupo de amidas ácidas derivadas de la vainillilamina y ácidos grasos de 8 a 13 átomos de carbono, que son sintetizadas y acumuladas en el tejido de la placenta. Las diferentes especies de Capsicum pueden variar en grado de picor lo cual se relaciona con la capacidad de acumular capsaicinoides, esto dependiendo del número de carbonos de cadena lateral o el grado de insaturaciones que presentan. 8,9 La capsaicina (N-(4-hidroxi-3-metoxibencil)-8-metil-6E-nonenamida) es el capsaicinoide más pungente y abundante de esta familia. Estructuralmente pose un anillo aromático denominado vainilloide que por sí solo es la base estructural de la vainillina la cual posee un sabor dulce y agradable, pero que al estar unida a una cadena hidrocarbonada insaturada le confiere características totalmente opuestas, que la hacen un compuesto sumamente pungente e irritante. 10 Se ha comprobado que la capsaicina es una molécula con distintas actividades biológicas y farmacológicas, como la estimulación del sistema cardiovascular, la analgésica, antiinflamatoria, lacrimógena, bactericida, antiparasitaria y antifúngica, 11 de igual manera tiene aplicaciones en industrias como alimentos, cosméticos, fármacos, entre otras. Por otra parte es bien sabido que la ingesta excesiva de chile produce alteraciones en el tracto digestivo y en el proceso de digestión Propiedades Físico-Químicas de los Capsaicinoides Los capsaicinoides exhiben propiedades muy particulares que desde hace varias décadas han despertado el interés científico: como las propiedades sensoriales que es la pungencia activa que poseen, actividad antibacterial con agentes patógenos, actividad antioxidante, efectos sobre el sistema nervioso de microorganismos asociados a la transmisión del dolor así como propiedades antiinflamatorio. 18

19 Antecedentes Las propiedades de los capsaicinoides no solo los convierten en un recurso de alto valor en la industria alimenticia, sino que además aumenta su campo de aplicación a otros rubros como la medicina. Sin embargo, todas las aplicaciones industriales de los capsaicinoides demandan su previo aislamiento de la materia prima, con lo que se ha planteado la necesidad de sintetizarlos Pungencia La sensación de ardor que acompaña al consumo de frutos de muchas variedades de Capsicum es el factor de calidad organoléptica conocida de este género. Esta irritación reside en un conjunto de sustancias de la familia de los vainilloides denominadas capsaicinoides, las cuales se acumulan en la placenta de los frutos y son exclusivas del género Capsicum. En la actualidad están identificados una veintena de capsaicionoides, aunque tres de ellos, capsaicina, dihidrocapsaicina y nordihidrocapsaicina, (Figura 5) suponen habitualmente más del 90% de los capsaicionoides totales. El efecto estimulador de los capsaicinoides, los convierte en un atributo muy deseable, otro aspecto es que los capsaicinoides favorecen la conservación de alimentos y además se les atribuye efectos benéficos para la salud

20 Antecedentes Capsaicinoide Estructura molecular Capsaicina Dihidrocpasaicina Nordihidrocapsaicina Homocapsaicina Homodihidrocapsaicina Figura 5. Principales capsaicinoides presentes en los frutos de Capsicum 20

21 Antecedentes 4.4 Síntesis de alcamidas La síntesis de alcamidas puede llevarse a cabo en un laboratorio en diversas condiciones mediante métodos químicos y enzimáticos. El desarrollar nuevas metodologías de síntesis de compuestos bioactivos permite resolver la problemática que se tiene con los bajos rendimientos al extraerlo de una planta Síntesis química La síntesis química consiste en obtener compuestos a partir de las sustancias más simples. Su objetivo principal es la creación de nuevas sustancias, así como el desarrollo de métodos más baratos y eficaces, para sintetizar sustancias ya conocidas. 13 La síntesis de compuestos es una de las más importantes dentro de la química orgánica, por lo cual ha aumentado considerablemente y crece a medida que se descubren o inventan nuevas reacciones, se mejoran otras conocidas y se comprenden mejor los mecanismos estudiados. Las problemática de la síntesis química son las grandes limitaciones que se llegan a tener, ya que consiste en procesos laboriosos debido a la complejidad de las moléculas orgánicas su construcción eficiente requiere de varias etapas, cada una de las cuales usa reacciones químicas que llevan específicamente a una estructura. Por ejemplo, la síntesis química de capsaicinoides por la condensación de alcohol vainillilico y un ácido graso, presenta desventajas en su producción, como la toxicidad en la condensación y en los agentes catalíticos utilizados, además de la formación de subgrupos y la protección y desprotección del grupo hidroxilo aromático. 13 Otro ejemplo es, la síntesis de la 2E, 4Z- decadien amida (amidenina), una alcamida sustituida de cadena de 10 carbonos, aislada originalmente del hongo Amycolatopsis sp., donde se utilizó un método químico basado en una reacción de sustitución y desplazamiento para la obtención de este compuesto(figura 6)

22 Antecedentes Figura 6. Reacción de sustitución y desplazamiento para la obtención de amidenina (2E, 4Z- decadien amida) a partir del éster de pera sintético. Más ejemplos son la síntesis de análogos a la amidenina utilizando como disolvente DCC, con un tiempo de reacción de 72 h a una temperatura constante de 80º C en NH 4 OH, las alcamidas sintetizadas mediante esta metodología se muestran en la tabla Tabla 1. Alcamidas sintetizadas por medio de diferentes ácidos carboxílicos en presencia de NH 4 OH. PRODUCTO RENDIMIENTO 44.20% Octanamida 70.27% Undecamida 27.44% Trans-2-hexenamida 47.68% Trans-2-octenamida 22

23 Antecedentes Síntesis enzimática Al ser bajos los rendimientos en los procesos de extracción de capsaicinoides en los chiles y la limitada disponibilidad de capsaicina se ha implementado tecnología enzimática como alternativa para una gran variedad de síntesis. En la actualidad las enzimas utilizadas en la síntesis química de moléculas orgánicas son de gran importancia en la comparación con la síntesis química no enzimática. Las enzimas de origen microbiológico son ampliamente utilizadas en diferentes industrias comerciales dejando de lado el campo de la síntesis orgánica selectiva de compuestos de interés biológico, debido a la baja disponibilidad de las moléculas orgánicas de origen natural y al difícil acceso en los métodos de extracción, se ha optado por la utilización de nuevas alternativas en la síntesis enzimática de moléculas orgánicas. El descubrimiento de que algunas enzimas son activas catalíticamente en solventes orgánicos, propicia que puedan ser utilizadas como biocatalizadores al manifestar este comportamiento. Por ejemplo las lipasas en condiciones adecuadas catalizan reacciones de esterificación y transesterificación. Lo cual sería difícil de lograr utilizando métodos convencionales. 15 La síntesis enzimática es una alternativa para optimizar la obtención de compuestos con actividad biológica, y propicia la manipulación de la reacción para obtener estructuras cuya actividad biológica sea más específica. En los últimos 15 años la aplicación de enzimas ha tenido grandes avances con implementaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica, gracias a la diversidad de enzimas inmovilizadas capaces de catalizar la reacción en un medio orgánico libre de agua y permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable a corto plazo. 23

24 Antecedentes Características de las lipasas Las lipasas aisladas de microorganismos como hongos y bacterias han sido estudiadas con mayor interés, estas presentan su máxima actividad a intervalos de ph que van de 5.6 a 8.5, con una mejor estabilidad a ph neutro, siendo activas a intervalos de temperatura que van de -20 a 45 ºC, teniendo un intervalo óptimo de 30 a 45 ºC. 17 Debido a la oferta comercial de enzimas microbianas inmovilizadas, se han logrado obtener productos de alto valor agregado, obteniendo así compuestos de alta demanda dentro de diferentes industrias mercantiles, conociéndose diferentes biotransformaciones para la producción de precursores farmacéuticos o agroquímicos Lipasa de Cándida Antárctica La lipasa de Cándida Antárctica (CAL-B) es un biocatalizador eficaz por su amplia especificidad hacia el sustrato y que mejores resultados ha dado en la resolución de ésteres quirales y aminas a través de reacciones de aminólisis con una alta regio-, quimio- y estereoselectividad. No obstante que los aminoácidos y sus ésteres tienen una gran importancia en la síntesis de compuestos naturales y farmacéuticos, tanto en la forma racémica como quiral, son pocos los trabajos que muestran el uso de CAL-B en reacciones de aminólisis y de amino ésteres protegidos en el grupo amino. 18,19 Un ejemplo del uso de enzimas inmovilizadas es la obtención de la cis-pellitorina a partir de un éster aislado de pera con isobutilamina en presencia de la enzima CAL-B. 16 Esta enzima se utiliza de igual manera en la síntesis de diferentes tipos de alcamidas, debido a su gran selectividad. Algunas de estas alcamidas son: análogos de capsaicina (Figura 1), N- (2-feniletil)-hexanamida, N-(2-feniletil)-octanamida (figura 7), las últimas dos inhiben el crecimiento de bacterias B. Subtillis Gram (+). 24

25 Antecedentes Figura 7. Reacción enzimática de amidas utilizando enzima inmovilizada lipasa Novozym 435 de Cándida antárctica 4.5 Capsaicinoides dentro de la industria Los capsaicinoides tienen un alto valor comercial, debido a que poseen aplicaciones en diferentes rangos de la industria, como lo es en la industria alimentaria donde se emplean en la elaboración de agentes saborizantes, aderezos, salsas dulces y picantes así como la elaboración de dulces y confitería. Se emplea de igual modo como colorantes tanto en la industria alimenticia como en la cosmética. Dentro de la industria farmacéutica los capsaicinoides se utilizan como agentes antiinflamatorios, debido a que tienen el efecto de dilatar los vasos sanguíneos, tienen potencial anestésico, debido a que desplazan el umbral del dolor, por otro lado la capsaicina destruye la llamada sustancia P la cual se encarga de trasportar la señal de dolor al cerebro. La capsaicina además es el principio activo de muchas cremas para el tratamiento del dolor muscular, dolor de espalda, artritis, reumatismo o lumbago. 20 Los capsaicinoides además de proporcionar el sabor picante se utilizan en la industria tabacalera, de pinturas, 21 en numerosos productos comerciales como repelentes y linimentos (recubrimientos de cables de luz, telefonía, pinturas para barcos, entre otros). 22 En forma más reducida se agrega en pequeñas cantidades a pastas dentales, enjuagues bucales, dulces y chicles a base de menta y canela, para resaltar el sabor y ofrecer una sensación refrescante. 2 25

26 5. MATERIALES Y MÉTODOS Así como el hierro se oxida por falta de uso, también la inactividad destruye el intelecto. Leonardo Da Vinci ( ) Pintor, escultor e inventor italiano.

27 Materiales y Métodos 5.1 Reactivos Se utilizaron aminas, ésteres y solventes así como hidrocloruro de vainillilamina (4-hidroxi- 3-metoxi-benzilamina hidroclorada, 98% Aldrich), dopamina hidroclorada, trietilamina (99% sigma-aldrich), éster de pera (etil 2,4-decadienoato, 98%), ácido trans-2-octenoico, ácido decanoico, ácido undecanoico (Aldrich). Lipasa B de Cándida antárctica inmovilizada en resina acrílica (sigma), sulfato de sodio anhidro (99% karal), sílice gel 40g para cromatografía en capa fina (60GF 254 Merck), alcohol ter-butilico (2-metil 2-propanol, 99% Sigma-Aldrich), alcohol etílico absoluto (99.5% karal), hexano (98.5% karal), acetato de etilo (99.5% karal), metanol (99.8% kem), nitrógeno gas (AOC) Material y equipos Matraces balón de 20, 50, 100 ml, (pyrex), matraces Erelenmeyer de 250ml (pyrex) agitadores magnéticos, parrilla de calentamiento y agitación, termómetro, pipetas de 5, 10 ml (pyrex) pipetas pasteur, placas de vidrio, rotavapor (laborota 4001 heidolph), balanza analítica, espectrofotómetro UV-visible (entela model UVGL-58) Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG/MS) Para el análisis cuantitativo y cualitativo de las muestras se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies GC system 7890A) acoplado a un detector de masas con ionización por impacto electrónico y cuadrupolo (Hewlett Packard 5973N) y un inyector automatico (Agilent Technologies 7683B). Las condiciones de corrida se describen a continuación. Para el cromatógrafo de gases: temperatura del inyector 250 ºC, temperatura inicial de horno 70 ºC mantenida durante 5 min, y a continuación un incremento de temperatura a una tasa de 5 ºC min -1 hasta una temperatura final de 280 ºC que se mantuvo por 15 min. Se utilizó Helio como gas acarreador con un flujo de constante de 1mL min -1. Se inyecto 1µL de muestra columna capilar Agilent modelo HP-5MS (30m x 0.25 mm x 0.25 µm). Para el dector de masas, la interfase se mantuvo a 250 ºC, la fuente de ionización a 230 ºC y el cuadrupolo a 150 ºC. 27

28 Materiales y Métodos 5.2 Metodología Preparación de placas cromatografías en capa fina (CCFP) Para realizar la cromatografía en capa fina preparativa se pesaron 40 g de sílice 60 GF 254 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se agregaron 80 ml de agua destilada. La mezcla se agitó vigorosamente y posteriormente se dispersó sobre vidrios para obtener 5 placas con un espesor de 0.5 mm. Habiendo gelificado la sílice sobre las placas de vidrio, se colocaron en un porta-placas dentro de un horno a 100º C durante una hora para ser activadas. Posteriormente se esperó que las placas estuvieran a temperatura ambiente y se prosiguió a aplicar la muestra a purificar, para después ser analizada en un cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas CG/MS Hidrólisis de Ester de pera y Afinina Se realizó la hidrólisis de afinina, así de igual manera la hidrólisis del Ester de pera. En un matraz limpio y seco se agregó 2.2 mg de afinina en 5 ml de agua, haciéndola reaccionar con 50 mg de enzima CAL-B a una temperatura de 60 ºC durante 72 h. De igual manera la hidrólisis del éster de pera se llevó acabo en un matraz limpio y seco donde se agregó 9.8 mg de éster en 5 ml de agua, haciéndola reaccionar con 50 mg de enzima CAL-B a una temperatura de 60 ºC durante 72 h. La hidrólisis se monitoreo por cromatografía en capa fina (CCF), al término de la reacción se extrajo la fase orgánica con acetato de etilo, el cual se secó con 15 mg de Na 2 SO 4, posteriormente se filtró y se evaporo el solvente, el residuo obtenido se emplea, para posteriormente ser acoplado a vainillilamina para la síntesis de capsaicinoides. 28

29 Materiales y Métodos Síntesis enzimática de capsaicinoides Se realizó la síntesis enzimática de análogos a la capsaicina, utilizando métodos descritos en la bibliografía con diferentes modificaciones. Teniendo como variante la cadena alquílica, donde se utilizó ácido 2-octanoen-oico, ácido decanoico, ácido undecanoico, el producto de la hidrólisis del éster de pera (etil 2E,4Z-decadienoato). En un matraz limpio y seco se hicieron reaccionar 0.25 mmoles de hidrocloruro de vainillilamina (4-hidroxi-3-metoxibencilamina hidroclorada), 2.5 mmoles de trietilamina en 2.6 ml de ter-butanol (2-metil-2-propanol). La mezcla se preincubó durante 60 minutos en una parrilla de calentamiento que se ajustó a 70º C con agitación constante, posteriormente se adicionaron 0.25 mmoles del ácido correspondiente, después se adicionaron 40 mg de sulfato de sodio anhidro y 40 mg de la enzima lipasa de Cándida Antárctica inmovilizada en resina acrílica. Se continuó la incubación durante 96 h y se monitoreo por placa cromatografía a diferentes horas. Transcurrido el tiempo de reacción se retiró el matraz de la parrilla de calentamiento y se dejó enfriar en un tiempo de 30 minutos, a continuación se extrajo la fase orgánica con ayuda de un embudo de separación y se prosiguió a evaporar el solvente a sequedad en un rota vapor. El producto fue purificado por cromatografía en capa fina preparativa, donde se utilizó placas de sílice siendo reveladas a UV-visible para después ser analizadas en CG/MS. 29

30 6. DISCUSIÓN Y RESULTADOS Las personas no son recordadas por el número de veces que fracasan, sino por el número de veces que tienen éxito. Thomas Alva Edison ( ) Físico e inventor estadounidense.

31 Discusión y Resultados 6.1 Aminas terciarias como base de elección en la síntesis Para la obtención de las alcamidas, esta se lleva a cabo mediante los ácidos carboxílicos 1a-1f, la enzima CAL-B, vainillilamina 2 o dopamina 4, una base y disolvente (Figura 1). Las aminas aromáticas a utilizar en este trabajo son obtenidas en el mercado como clorhidrato. Para llevar a cabo el ataque nucleofílico de la vainillilamina y dopamina, estas se deben desproteger mediante el empleo de una base, por lo cual es de suma importancia el empleo de bases impedidas, confiando en su baja nucleofilicidad, la base de Hünig (N,Ndiisopropil-etilamina) (Figura 8) se utilizó para los ensayos de síntesis de capsaicinoides. Observando la semejanza de la base de Hünig y el impedimento estérico de esta, se empleó también como base trietilamina (Figura 9). Figura 8. Estructura de DIPEA (N,N-diisopropil etilamina) Figura 9. Estructura de Trietilamina Para lograr la obtención de las alcamidas. En primer lugar fue necesario liberar el clorhidrato de las aminas aromáticas 2 y 4, mediante el empleo de la base de Hünig o trietilamina, las cuales se dejaron reaccionar estás durante 60 minutos a 60 ºC (Figura 10). 31

32 Discusión y Resultados Figura 10. Mecanismo de reacción para liberar el clorhidrato de vainillilamiana y dopamina 6.2 Efecto de disolvente (Alcohol) En la literatura para la síntesis enzimática existen reportes de disolventes como: tolueno, acetonitrilo, dioxano, THF, Alcoholes terciarios. En nuestro caso se empleó tanto al alcohol ter-butílico como al alcohol ter-amílico como el mejor sistema de disolución en la síntesis enzimática. La selección del disolvente de reacción ésta basado en el impedimento estérico de éste ya que es importante tratar de evitar el acoplamiento y la esterificación del mismo por acción de la lipasa CAL-B (Figura 11). 32

33 Discusión y Resultados Figura 11. Reacción de esterificación de alcoholes primarios, secundarios y terciarios. La esterificación por parte del alcohol o la sustitución catalizada por la lipasa depende de la actividad catalítica que presente la enzima, mediada por la temperatura y el tiempo de reacción, siempre y cuando el impedimento estérico de la amina no imposibilite su disposición molecular para ser acoplado al ácido correspondiente. El uso del alcohol impedido es crucial en la síntesis capsaicinoides la interrogante surge respecto a la solubilidad de las materias primas y su disposición en la reacción. En la figura 12 podemos observar las constantes dieléctricas de los alcoholes empleados en este trabajo. Figura 12. Constantes dieléctricas de ter-butanol y 2-metil-2-butanol 33

34 Discusión y Resultados Ambos disolventes tienen baja polaridad en comparación con alcoholes primarios y secundarios, dado por el impedimento estérico, el cual es adecuado para la solubilidad de los sustratos en presencia de lipasas. Estos fueron disolventes adecuados tomando en cuenta que solubilizamos alcamidas aromáticas con una polaridad significativa, cuando se comparan con amidas en general de cadena alifática mayor a C8 las cuales presentan baja polaridad. 6.3 Síntesis enzimática y purificación de capsaicinoides Los capsaicinoides pueden ser sintetizados por métodos químicos y métodos enzimáticos, se han reportado algunas metodologías que hacen uso de la enzima de lipasa de Cándida antárctica inmovilizada en resina de acrílica. 9 ª,9b,10 En este trabajo los primeros ensayos para obtener capsaicinoides se realizó con los ácidos 1b, 1e, 1f empleando vainillilamina 2 o dopamina 4, base de Hünig y alcohol ter-amílico, según la metodología descrita por castillo et al., Para lograr la síntesis de amidas el primer paso fue la liberación de la vainillilamina y la dopamina mediante la base de Hünig en una relación molar (1:10) tal como se menciona en la literatura. Cabe mencionar que para corroborar este dato se realizaron ensayos de desprotección de la amina en relaciones molares (1:2) (1:4) (1:8) (1:10) a 60 ºC durante 60 minutos, después de analizar las mezclas de reacción por CG/MS corroboramos que con 10 equivalentes de la base se logra un 90% de liberación del clorhidrato de las aminas 2 y 4 (tabla 2). 34

35 Discusión y Resultados Tabla 2. Rendimientos en relación a equivales de la base Sustrato Eq. Base Rendimiento % % % % Posteriormente la reacción de condensación entre el ácido correspondiente 1b, 1e, 1f y las aminas 2 y 4 liberadas previamente se dejan reaccionar con la enzima CAL-B y el alcohol ter-amílico a 60 ºC, debido a que se ha observado que es la temperatura óptima para llevar a cabo la reacción, además de que a temperaturas superiores permiten a la enzima hidrolizar la amida formada. Estas reacciones fueron monitoreados por CG/MS cada 24 h, donde después de 72 h en el caso cuando se emplea la vainillilamina, se comienza a observar la formación de la amida correspondiente, por lo cual la reacción se continuo hasta las 114 h, después de este tiempo la mezcla de reacción se purifica y se analiza por CG/MS observando en relación al ácido una conversión de 50% a la amida. En base a estos resultados la reacción se continua hasta alcanzar 150 h. Terminado este tiempo las mezclas de reacción se purificaron por CCFP, y los productos obtenidos se analizaron por CG/MS. En el cromatograma se observan 3 picos mayoritarios que en relación a la base de datos y al ión molecular, estos picos corresponden a las materias primas y al producto de interés; sin embargo la relación ácido 1b, 1e, 1f y producto 3 y 4 muestra una proporción 4:1 En base a los cromatogramas el rendimiento obtenido de las alcamidas es menor al 28% (Figura 13). 35

36 Discusión y Resultados Figura 13. Resultados de cromatogramas en CG/MS Por otro lado, cabe mencionar que después de analizar la reacción con dopamina no se logró observar ninguna conversión en el CG/MS, solo se detecta los iones moleculares de las materias primas. Debido a estos resultados y con la finalidad de establecer una metodología que se obtenga mejores rendimientos se realizaron algunas modificaciones a la técnica anterior, en lugar de utilizar la base de Hünig se llevaron a cabo los ensayos con trietilamina manteniendo la misma relación (1:10). El primer ensayo para establecer las condiciones fue con el ácido 1b, Et 3 N, la enzima CAL-B y alcohol ter-amílico, esta reacción se dejó durante 96 h monitoreándola cada 24 h por CCF después de analizar esta reacción por CG/MS los resultados fueron muy similares a los anteriores. 36

37 Discusión y Resultados Por lo tanto, en base a esto se decide realizar la reacción con el mismo sustrato ensayando con otros disolventes como THF, dioxano, acetonitrilo, alcohol terbutilico. En THF, dioxano y acetonitrilo se observa que la materias primas no son solubles por los cual no se lleva un acoplamiento, mientras que en alcohol ter-butilico se observa una mejor disolución de las materias, por lo cual es de elección en la síntesis de capsaicinoides. Una vez establecido la base y el disolvente se extiende este procedimiento a los demás ácidos 1a, 1b, 1c, 1d, manteniendo la temperatura de 60 ºC, durante 96 horas, mediante estas condiciones los compuestos obtenidos se muestran en la figura 14 y

38 38 Discusión y Resultados CAL-B R1) Ácido trans 2-octenoico (3a) CAL-B R2) (3b) Figura 14. Reacciones enzimáticas partiendo de aminas aromáticas (primarias) y ácidos, inmovilizada lipasa Novozym 435 de Cándida antárctica a 60º C en terbutanol catalizadas por una enzima 38

39 39 Discusión y Resultados CAL-B R3) (3c) CAL-B R4) (3d) Figura 15. Reacciones enzimáticas partiendo de aminas aromáticas (primarias) y ácidos catalizadas por una enzima inmovilizada lipasa Novozym 435 de Cándida antárctica a 60º C en terbutanol 39

40 Discusión y Resultados Existe interés en obtener las alcamidas con la cadena insaturada de 10 carbonos, así como con una cadena con tres instauraciones 3d (Figura 16). Figura 16. Alcamidas obtenidas con los productos de hidrólisis Estas se pueden obtener a partir del éster de pera y a la afinina como sustratos, sin embargo se ha observa que la enzima CAL-B presenta mayor selectividad a residuos de ácidos carboxílicos, obteniendo un mejor acoplamiento en la síntesis con vainillilamina. Debido a esto fue necesario llevar a cabo la hidrólisis enzimática (CAL B) a 60 ºC de dicho éster y la afinina en una relación 2 milimolar del sustrato respecto al agua (figura 17). Estas muestras se analizaron igualmente por CG/MS sin embargo la hidrólisis después de 72 h en el caso del éster de pera no se logra completar, observándose las materias primas. En el caso afinina no se logra detectar el ácido correspondiente por CG/MS. 40

41 41 Discusión y Resultados CAL-B R5) (6a) CAL-B R6) Éster de pera (6b) Figura 17. Reacciones enzimáticas de hidrólisis de afinina y éster de pera catalizada por una enzima inmovilizada lipasa Novozym 435 de Cándida antárctica a 60º C en agua 41

42 Discusión y Resultados 6.4 CG/MS Los productos fueron purificados por CCFP, posteriormente se analizaron por CG/MS. El cromatograma del compuesto 3d se muestra en la figura 18. En la que se presentan tres picos con tiempo de retención (Rt) = , , El espectro de masas del compuesto con Rt = se muestra en la figura 19, mientras tanto el pico con Rt= corresponde al producto deseado el cual se muestra en la figura 21. Abundanc e 1.2e+07 T IC: Esme2r.D \ data.ms e+07 1e T ime--> Figura 18. Cromatograma del producto de la observan 3 picos con Rt= , , minutos reacción 3d (ácido undecanoico). Se 42

43 Discusión y Resultados A b u n d a n c e S c a n ( m in ): E s m e 2 r.d \ d a ta.m s m / z --> Figura 19. Espectro de masas del compuesto con Rt= min, (ión molecular del ácido undecanoico) De igual manera el espectro masas del pico con Rt = fue comparado cabeza-cola en la base de datos, donde se observó que el ácido undecanoico no reaccionó en su totalidad para llevar a cabo la síntesis de capsaicinoides (figura 20) Scan 796 ( min): Esme2r.D\ data.ms Head to Tail MF=908 RMF=909 Undecanoic acid Figura 20. Comparación cabeza-cola del espectro de masas del ácido undecanoico. En color rojo se muestra es espectro de masas del compuesto con Rt = y en color azul el espectro de masas de la biblioteca NIST. 43

44 Discusión y Resultados A b u n d a n c e S c a n ( m in ): E s m e 2 r. D \ d a t a. m s m / z --> Figura 21. Espectro de masas del compuesto con Rt = min. Producto de la síntesis enzimática 3d cuya estructura se ilustra con los fragmentos mayoritarios. 44

45 Discusión y Resultados De igual manera el espectro con Rt = fue comparado cabeza-cola en la base de datos. El compuesto que mostró la biblioteca fue el de dihidrocapsaicina el cual fue comparado cabeza cola con el espectro antes mencionado, la cual mostro mayor similaridad con valores de: 206, 195, 178, 168, 160, 151, 137, 122, 110, 94, 77, 55 (Figura 22) Scan 6397 ( min): Esme2r.D\ data.ms Head to Tail MF=786 RMF=859 Dihydrocapsaicin Figura 22. Comparación cabeza-cola del espectro de masas del producto de la síntesis enzimática 3d. En color rojo se muestra el espectro de masas del compuesto con Rt = y en color azul el espectro de masas de la biblioteca NIST. En base a estos resultados es necesario realizar otros ensayos para establecer una metodología que nos permita lograr la conversión total del sustrato, ya que los ácidos 1a, 1b,1c,1d, se siguen observando después de 150 h de reacción en el CG/MS. 45

46 7. CONCLUSIÓN Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un esfuerzo total es una victoria completa. Mahatma Gandhi ( ) Político y pensador indio.

47 Conclusiones Los resultados de este trabajo permiten llegar a las siguientes conclusiones: Se obtuvo de manera enzimática la hidrólisis del éster de pera, aislando el ácido 2,4 decadienoico. La utilización de la enzima Lipasa de Cándida Antárctica inmovilizada en resina acrílica permitió síntesis de los siguientes alcamidas: (N-(4-hidroxi, 3- metoxibenzil)) 2-trans octenamina, (N-(4-hidroxi, 3-metoxibenzil)) decanamida, (N-(4-hidroxi, 3-metoxibenzil)) undecanamida, (N-(4-hidroxi, 3-metoxibenzil)) 2,4- decadienamida, análogas a la capsaicina presentando rendimientos menores del 28%. Es necesario variar parámetros de la reacción para lograr mejores resultados en la síntesis de las alcamidas. Es necesario variar parámetros de la reacción para lograr mejores resultados en la síntesis de las alcamidas. 47

48 8. REFERENCIAS Todo lo que una persona puede imaginar, otros pueden hacerlo realidad. Julio Verne ( ) Escritor francés

49 Referencias 1. Taiz L, Zeiger E (2006) Metabolitos secundarios en Fisiología Vegetal. Volumen 1. Editorial Universitat Jume; paginas Molina Torres Jorge, G. C. (2001). alcamidas en plantas: distribucion e importancia. avance y perspectiva vol Molina-Torres J, Garcia-Chavez A, Ramirez-Chavez E. (1999) Antimicrobial properties of natural alkamides traditionally used in Mesoamerica: Affinin and Capsaicin. Journal of Ethnopharmacology 64, Ramírez-Chávez E, López-Bucio J, Herrera-Estrella M, Molina-Torres J (2004). Alkamides Isolated from Plants Promote Growth and Alter Root Development in Arabidopsis. Plant physiology 134: García-Chávez A, Ramírez-Chávez E, Molina-Torres J (2004). El género Heliopsis en México y las alcamidas presentes en sus raíces. Acta botánica Mexicana vol. 69: Ríos-Chávez P, Ramírez-Chávez E, Armenta-Salinas C, Molina-Torres J (2003). Acmella radicans var radicans: in vitro culture establishment and alkamide content, In vitro cell. Dev. Biol. Plant 39: Torres-Arreguin G, Molina-Torres J, Ríos-Chávez P (2004) Establecimiento de múltiples brotes en Acmella radicans una planta productora de alcamidas. XIII Congresso Italiano-latino America di Etnomedicina 8. Vázquez-Flota F, Miranda-Ham M, Monforte-González M, Gutiérrez-Carbajal G, Velázquez-García C, Nieto-Pelayo Y (2006). La biosíntesis de capsaicinoides, el principio picante del chile. Rev.Fitotec.Mex vol 30: a, Fernández-Barbero G. (2007). Extracción, análisis, estabilidad y síntesis de capsaicinoides. Universidad de Cádiz. Facultad de Ciencias, Departamento de Química Analítica. Tesis Doctoral b, Molina-Torres J, Santos-Escobar F, González-Arnao M, Ramírez-Chávez E, Sánchez-Pavón E (2008). Síntesis 49

50 Referencias enzimática de alcamidas en sistemas no acuosos y ensayo de su actividad in vitro. Lat. Am. J. Pharm. 27(5): Castillo E, Torres-Gavilán A, Severiano P, Navarro A, López-Munguía A (2007). Lipase-catalyzed synthesis of pungent capsaicin analogues. Food Chemistry 100: Molina-Torres J, García-Chávez A, Ramírez-Chávez E, (1999). Antimicrobial properties of natural alkamides traditionally used in Mesoamerica: Affinin and Capsaicin. Journal of Ethnopharmacology 64: Rodríguez-Barruezo A, Nuez Viñals F. Mejora genética de la calidad en plantas, capitulo XV Mejora de la calidad del pimiento. Recuperado el día 15 de marzo de 2011 en Kobata K, Kawaguchi M, Watanabe T (2002) Enzymatic synthesis of a Capsinoid by the Acylation of Vanillyl Alcohol whit Fatty Acid Derivatives Catalyzed by Lipases. Biosci. Biotechnology. Biochem. 66(2: ). 14. Saenz Rosete D (2010) El papel de las alcamidas en el mecanismo de señalización Quorum sensing en cultivos in vitro. Universidad Veracruzana. Facultad de Ciencias Químicas. Tesis de licenciatura Amador-Cobos L, González-Avelino G (2009) Síntesis de alcamidas análogas a la amidenina. Universidad Veracruzana. Facultad de Ciencias Químicas. Tesis de licenciatura Ley JP Hilmer J-M, Weber B, Krammer G, Gatfield IL, Bertram H-J (2004) Stereoselective Enzymatic Synthesis of cis-pellitorine, a Taste Active Alkamide Naturally Occurring in Tarragon, European Journal of Organic Chemistry :

51 Referencias 17. Arroyo-Sánchez M (1995). Síntesis de ácidos 2-aril-propionicos homoquirales mediante esterificación enantioselectiva catalizada por lipasas inmovilizadas. Tesis doctoral. Universidad Complutense, Madrid. Facultad de Farmacia. Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. 18. Gallardo-Rivera R, Rojas-Cruz A, Valerio-Alfaro G (2004). Efecto del grupo protector en la especificidad de sustrato de lipasa de Cándida Antárctica en la aminólisis de amino esteres en disolvente orgánico. Rev. Soc. Quin. Mex, 48: Klibanov A M (2001). Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature. 409: Introduciendo la Oleorresina Capsicum recuperado el día 15 de marzo de 2011 en Borges-Gómez L, Cervantes-Cárdenas L, Ruiz-Novelo J, Soria-Fregoso M, Reyes- Oregel V, Villanueva-Couoh E (2010). Capsaicinoides en chile Habanero (Capsicum Chinense Jacq) bajo diferentes condiciones de humedad y nutrición. Terra Latinoamericana vol. 28, numero Lucio-Juárez J (2010). Método asistido por ultrasonido para disminuir el tiempo de secado del chile habanero (Capsicum Chinense) experimentos y simulación. Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Premio Nacional en Ciencia y Tecnología de Alimentos. 51