CULTIVOS CELULARES. Tinción nuclear con DAPI) Prot. Especifica de músclo (verde, MHC) Tinción nuclear con DAPI). No expresan MHC

Transcripción

1 CULTIVOS CELULARES Los cultivos celulares permiten estudiar las células en condiciones de homogeneidad en ausencia de las interferencias de otras células constituyentes del tejido (con sus ventajas e inconvenientes) Mioblastos transformados de ratón en SBF (C2C12) Mioblastos transformados de ratón sin SBF (C2C12) Tinción nuclear con DAPI). No expresan MHC Tinción nuclear con DAPI) Prot. Especifica de músclo (verde, MHC)

2 Cultivo de tejidos (células) a) Esterilidad: Cabina de flujo laminar b) Material y tratamiento de superficies c) Condiciones de cultivo: Estufa de cultivo con CO2

3 Mantenimiento, subcultivo (pases) y criopreservación (almacenaje de células): Microscopio de contraste de fases invertido, cámara de recuento celular (cuentaglóbulos o hemocitómetro), colorante vital.

4 El ph de los medios de cultivo se controla con el sistema tampón CO 3 H 2 CO 3 H - + H + Al aumentar la presión parcial de CO 2 aumenta el CO 3 H 2 en la solución. La acidez se visualiza con rojo fenol que vira al amarillo al bajar el ph y al morado al aumentar Recuento de células en una cámara cuentaglóbulos de Neubauer

5 (rmcc) (rmcc) (rmcc) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (e) (rmcc) (e) rmcc = requerido por muchas células en cultivo; e = esencial Eritropoyetina (cel. hematopoyéticas) IL-2 (linfocitos T) Control de los cultivos celulares Contaminaciones Caracterización celular Patrón de isoenzimas DNA fingerprinting Análisis citogenético Aislamiento de células de tejidos: Explantes y cultivos primarios (Colagenasa, tripsina, EDTA)

6 Selección de células de mezclas: Centrifugación (tamaño ó densidad) Adhesividad diferencial natural o inducida por Ab Los cultivos primarios tienen una vida limitada (unas 50 gener.) y luego envejecen. Ocasionalmente se producen espontáneamente líneas inmortalizadas, particularmente en roedores MolBiolCell Senescencia celular replicativa: Acortamiento y desprotección de los telómeros MolCellBiol Transformación celular espontánea Fluorescente, carga - No fluorescente, carga + Las células también pueden inmortalizarse proporcionándoles la subunidad catalítica de la telomerasa (y anulando puntos de control del ciclo celular introduciendo genes oncogénicos) Fibroblastos Mioblastos Cel. Precursoras oligodendrocitos FACS

7 Las células en cultivo pueden sincronizarse en diferentes puntos de su ciclo celular A. Cultivos primarios Embrionarios o de tejidos adultos B. Líneas celulares a) Inmortalizadas: Expresan el gen de la subunidad catalítica de la telomerasa Se inactivan mecanismos de control de progresión en el ciclo celular (introducción de genes promotores de tumores procedentes de virus oncogénicos o desactivación espontánea) Células de roedores: Telomerasa y desactivación espontánea de mecanismos de control) b) Transformadas: Procedentes de tumores Células transformadas por virus oncogénicos MolCellBiol Pueden crecer en suspensión y formar capas múltiples y generan tumores cuando se inyectan en animales de experimentación C. Células troncales (células madre) -Embrionarias (primeras divisiones del zigoto) o tisulares (regeneración de los tejidos) Células no diferenciadas Pueden proliferar indefinidamente Pueden diferenciarse dando otros tipos celulares (las embrionarias son totipotenciales, las tisulares pueden ser pluripotenciales o totipotenciales) Células troncales neurales células hematopoyéticas o musculoesqueléticas Células de la médula ósea células hematopoyéticas, neumocitos o hepatocitos

8 Inmortalización de linfocitos B productores de un determinado anticuerpo (hibridomas) HGPRT -, TK - Linfocitos transformados (mieloma) Hipoxantina (HGPRT, 6-S-G) Aminopterina (inb. sint. nucleot.) Timidina (5-BrdU) MolBiolCell LOS CULTIVOS CELULARES COMO MODELO EXPERIMENTAL 1. Complejidad de los tejidos 2. Presencia de contaminantes inadvertidos (micoplasmas y virus) 3. Condiciones externas en relación con las condiciones in vivo 4. Manipulación genética Introducción de genes exógenos (transfección): --Microinyección --Microprecipitados DNA-fosfato cálcico --Lipofección, --Electroporación --Policationes (polietileniminas, PEI) Anulación génica 5. Pérdida de mecanismos de regulación (ausencia de factores, interrelación con otras células o ME) Métodos de transfección MolCellBiol

9 Técnicas de observación de la célula y sus componentes Inmuno(histo)citoquímica, hibridación in situ Técnicas de fluorescencia y de observación in vivo Técnicas de microscopía electrónica Microscopía de campo próximo: AFM Microscopía amplificada por vídeo y ensayos de motilidad in vitro INMUNOHISTOQUIMICA 1. Anticuerpo 1º (policlonal de conejo) 2. anti-ig de conejo (p.ej. en cabra) unido a HRP (peroxidasa de rábano) 3. Diaminobencidina (sustrato soluble de HRP que produce un precipitado marrón) 4. Amplificación de la señal: anticuerpo 1º biotinilado y complejos (estrept)avidinabiotina (ABC) en los que las moléculas de biotina están unidas a HRP Cortes de hígado de rata

10 HIBRIDACIÓN in situ (ISH): Análisis de la expresión génica en tejidos intactos por detección de mrnas mrna implicado en desarrollo de somitas en un embrión MolCellBiol Y X FISH (múltiple fluorescencia, pintado de cromosomas) El dsrna inhibe la expresión del mrna cuya secuencia contiene MolBiolCell, Alberts y col. 4ª Ed, Garland Science

11 MolBiolCell MolCellBiol MolCellBiol MolBiolCell, Alberts y col. 4ª Ed, Garland Science Inmunofluorescencia (indirecta) Ligandos fluorescentes (faloidina) MolBiolCell MolCellBiol Microscopía de fluorescencia Espejo dicroico

12 Recuperación de fuorescencia tras fotoblanqueo Reactivos fluorescentes enjaulados (fotoactivación) Dinámica de tubulina en el huso acromático Rojo: Tub-rodamina Azul: Fluorocromo que se une a DNA (DAPI) Amarillo: Tub-fluoresceína (enjaulada) Los genes que codifican GFP y otras proteínas fluorescentes pueden mutarse para que produzcan variantes proteicas, generalmente con un único aa diferente, que apenas tienen fluorescencia en condiciones normales de excitación pero se puede inducir una fluorescencia intensa activándola con un pulso intenso de luz a una λ diferente (estudio del comportamiento in vivo de proteínas expresadas como proteínas de fusión) MolBiolCell Pérdida de fuorescencia en fotoblanqueo

13

14 d Aequorea victoria (a-c) Localización del órgano bioluminiscente de la medusa Aequorea victoria en el borde de la sombrilla; (d) La proteína verde fluorescente, GFP, está formada por 238 aa, 11 láminas β que se organizan en forma de tarro en cuyo interior los aminoácidos 65, 66 y 67 (que se modifican autocatalíticamente) generan la bioluminiscencia verde cuando la proteína se excita con luz azul o UV; (e, f) Proteínas bioluminiscentes de arrecifes de coral, de izquierda a derecha, AmCyan1, ZsGreen1, ZsYellow1, DsRed2, AsRed2, and HcRed1 (BD Biosciences) observadas en el tubo de ensayo o tras co-expresión con proteínas celulares proporcionando bioluminiscencia a las células. (g) Espectros de excitación y emisión de estas proteínas fluorescentes de corales g e f

15 Identificación de proteínas in vivo con GFP y otras proteínas fluorescentes Usos: Localización de células (que expresan el trans-gen de GFP u otra proteína fluorescente) en un animal vivo ó co-expresión con otro gen para producir la proteína quimérica fluorescente Tricomas de Arabidopsis observados mediante el microscopio electrónico de barrido (A) o tras transformar con un plásmido que contiene los genes de Talina-GFP (B) MolCellBiol, Lodish y col. Vectores de localización subcelular Living colors (BD Biosciences) prara localizar in vivo orgánulos o estructuras subcelulares Etiquetado de proteínas con GFP Gen de la proteína que interesa Se inserta el DNA que codifica el epítopo marcador, p. ej. de GFP Se introduce en la célula, p. ej. por transfección Proteína con el epítopo marcador, p. ej. GFP Extracción y purificación de la proteína con Ab contra el epítopo marcador MolBiolCell Fluorescencia verde, o localización con Ab contra el epítopo marcador GFP (para inmunohistoquímica)

16 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): Estudio de interacciones moleculares en la célula usando variantes de proteínas fluorescentes.el espectro de emisión de uno de los fluorocromos debe solapar con el de absorción del segundo y encontrarse suficientemente próximo a él (1-10 nm). La luz absorbida por el primero se transmitirá al segundo. Se excita el primer fluorocromo y se mide la emisión característica del segundo

17 MolCellBiol Enfoque de la fluorescencia Microsc. Confocal, analógica (de barrido) y computacional (microscopio de desconvolución, función de difusión puntual) MolBiolCell λ>510 nm laser azul nm Fluoresceína (verde) nm Bioquímica, Mathews y col.

18 Límite de resolución del ojo mm. Microscopio óptico unos 200 nm (2.000 x). Microscopio electrónico 0.1 nm (cerca de x adicional, 2-4 x 10 6 veces menor que el del ojo) 0.61.λ r = n.sen α r = límite de resolución (el límite de detección puede ser menor, p.ej. en fluorescencia ) λ = longitud de onda (luz visible de menor λ, 450 nm; haz de electrones nm) n = índice de refracción (aceite de inmersión, 1,33-1,5) α = apertura angular (máxima 70 grados, sen 70 = 0.94; n.sen α = apertura numérica )

19 En el SEM los electrones se enfocan mediante las lentes condensadora y objetivo sobre una muestra recubierta por metal. Bioquímica, Mathews y col. 3ª Ed, Addison Wesley Las espirales de barrido desplazan el haz de electrones sobre la muestra y los electrones difractados se recolectan en un tubo fotomultiplicador de detección. El aire difracta los electrones por lo que en ambas técnicas se requiere vacío elevado O cámara CCD

20 Microscopio electrónico de barrido Bioquímica, Mathews y col. 3ª Ed, Addison Wesley

21 Bioquímica, Mathews y col. 3ª Ed, Addison Wesley

22 Bioquímica, Mathews y col. 3ª Ed, Addison Wesley

23 Inmunomicroscopía electrónica y autorradiografía electrónica (pulso y caza) Síntesis de insulina y acumulación en vesículas de secreción tras un pulso con leucina tritiada y caza con concentraciones elevadas de aminoácido sin marcar (granos de plata)

24 A B C D MolBiolCell Generación de contrastes: Células teñidas: Reducción de la amplitud de la luz de determinadas longitudes de onda Células sin teñir: Diferencias en el índice de refracción y espesor. Los detalles estructurales pueden visualizarse utilizando cambios en la fase de la luz MolBiolCell Observación de células sin teñir: A) Campo claro B) Contraste de fases: Claro-oscuros dependientes del índice de refracción C) Contrate de interferencia diferencial (DIC), óptica de Nomarski: Interferencias de luz polarizada (sección óptica fina) D) Campo oscuro A MolCellBiol C, seudorelieve B, claro-oscuros Cinematografía de tiempo pulsado Procesamiento de imágenes digitalizadas con cámaras CCD (charge-coupled device) para extraer información latente. Resuelven las limitaciones del ojo humano que: 1) No puede ver con luz muy tenue y 2) No percibe diferencias pequeñas de intensidad de luz en un fondo de luz brillante. El procesamiento permite acercarse a los límites de resolución y amplificar el contraste

25 Ensayos de movilidad in vitro Amplificación por video del contraste de interferencia diferencial Pinzas ópticas. Un rayo laser intenso enfocado sobre un objeto con un índice de refracción mayor que el del entorno, puede detener el objeto debido al cambio de dirección de los fotones al refractarse la luz. Las pinzas ópticas tienen aplicación en la caracterización de proteínas motoras. Para ello se usan láseres infrarrojo. Cuando la λ de la luz es menor, la radiación laser puede absorberse por el material biológico y pude matar células, cortar o quemar material biológico (bisturís ópticos usados en microcirugía)

26 Bioquímica, Mathews y col., Addison Wesley Microscopía de campo próximo: Microscopio de fuerzas ( o de fuerza atómica), AFM. Punta: silicio o nitruro de silicio (fabricada con nanotecnología) Interacción sonda-muestra: Fuerza mecánica, corriente eléctrica, radiación electromagnética, flujo de calor Modos: a) contacto (de nnewton). La punta barre la superficie manteniendo una fuerza de interacción con ella constante (recorre el relieve) b) Oscilante (frecuencia y/o amplitud de oscilación) Puede medir la fuerza que percibe la punta al desplazarse sobre la superficie. Puede usarse para atrapar y desplazar moléculas individuales actuando a modo de pinzas ópticas moleculares. Usos: 1. Obtención de imágenes superficiales a escala molecular 2. Determinar propiedades mecánicas de moléculas proteicas individuales, tales como la energética de plegamiento de dominios proteicos deformando (desplegando) la proteína en cuestión