DIAWell Cardiolipin IgG Elisa KAPDTCLG02

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1 DIAWell Cardiolipin IgG Elisa KAPDTCLG02 DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

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3 DIAWell Cardiolipin IgG Elisa en 96 test quantitative Enzyme Immunoassay KAPDTCLG02 IN VITRO DIAGNOSTIC DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium - Tel: Fax : INTENDED USE The DIAWell Cardiolipin IgG kit allows the quantitative detection of IgG antibodies to Cardiolipin in human serum. STOP Stop solution 1 vial, 20 ml (colourless) Containing : sulphuric acid 2.5 % PRINCIPLE OF THE TEST The DIAWell Cardiolipin IgG kit is a solid phase enzyme immunoassay using 96 coated breakaway microwells and a peroxidase-tmb detection system. The microwells are coated with highly specific antigen. In the test procedure, serum samples are diluted 1/51 and incubated in the microwells. Human antibodies, if present, bind to the specific antigen. Unbound or excess antibodies are removed by washing and HRP-conjugated rabbit antibodies against human IgG are added to the microwells. The enzyme conjugate binds to the antigen-antibody complexes. After a second washing step to remove excess conjugate, the TMB/substrate solution is added. The enzyme activity, if present, generates a colorimetric (blue) reaction. Diluted acid is added to stop the reaction. Consequently the colour turns from blue to yellow and may be measured at 450 nm using a conventional microplate reader. The absorbance (Optical Density) is directly proportional to the concentration of IgG antibodies bound to the antigen on the microwells surface KIT CONTENTS : MATERIAL PROVIDED IN THE KIT TO BE RECONSTITUED : WASH READY TO USE : DIL SPE CONC (20 x) Wash buffer 1 vial, 50 ml 20 x concentrated (blue) Sample Diluent Containing : Tris, Tween, Methylisothiazolone (Preservative) 1 vial, 50 ml (yellow) Containing : Tris, Tween, BSA, Microtiterplate Frame for strips 1 MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED 12 x 8 well strips with breakaway microwells Coated with purified cardiolipin (bovine) and purified β 2GPI (human) Microtiter plate reader (450 nm reading filter + optional 650 nm reference filter). Glass ware, test tubes for the dilutions. Distilled water. Precision pipettes (10, 100, 200, 500, 1000 µl) or multipipette. Microplate washing device (multichannel pipette or automated system) Absorbent paper. STORAGE Store all reagents and microwells at 2-8 C Once prepared the washing solution is stable for 1 month at 4 C. Reagents and microwells should be used until the expiry date indicated on each component only. PRECAUTIONS SUB Cal Substrate N L Negative 1 vial, 20 ml (colourless) Containing : stabilized TMB/H 2O 2, 1 vial, 1 ml (green) Containing : human serum (diluted), Calibrator 6 vials, 1 ml each 0, 6, 12, 25, 50, 100 U/ml (colour increasing with concentration) Containing : human serum (diluted), 1. Health hazard data THIS PRODUCT IS FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE. Although this product is not considered particularly toxic or dangerous in conditions of normal use, refer to the following recommendations and precautions for maximum safety when handling: The kit contains potentially hazardous components. Reagents may be irritating to eyes and skin thus avoid contact with eyes and skin. Do not smoke, eat or drink when manipulating the kit. All human source material used for some reagents of this kit (controls, calibrators) has been tested and found negative for HbsAg, for Hepatitis C and for HIV 1 and 2 antibodies by approved methods. However, no test can guarantee the absence of viral agents in such material completely. Thus handle kit controls, calibrators and patient samples as if capable of transmitting infectious diseases. Ab HRP H Positive HRP Conjugate 1 vial, 1 ml (blue) Containing : human serum (diluted), 1 vial, 20 ml (blue) Containing : Rabbit anti-human IgG/peroxidase, Methylisothiazolone (preservative) 2. Other precautions Do not mix or substitute reagents or microwells from different lot numbers. This may lead to variations in the results. Allow all components to reach room temperature (18-24C) before use and follow the recommended incubation scheme for an optimimum performance of the test Always pipette reagents with clean tips in order to avoid contamination with exogenous substances. Catalogue nr: KAPDTCLG02 PI number : /en Revision nr : /1

4 Protect the chromogen / substrate reagent from light to avoid increase in blank values. SAMPLE COLLECTION, HANDLING AND STORAGE Use preferentially freshly collected serum samples. Do not use icteric, lipemic, hemolysed or bacterially contaminated samples. Sera with particles should be clarified by low speed centrifugation. Blood samples should be collected in dry tubes. After separation, the serum samples should be used immediately, respectively stored at 2-8 C for two or three days, or frozen at -20 C for longer periods. ASSAY PROCEDURE 1. Samples Dilute serum samples 1:51 with sample diluent (ready-to-use) e.g. 500 µl diluent + 10 µl serum. Mix. 2. Wash buffer Dilute the concentrated Wash buffer 1:20 with distilled water Manual washing: Prepare 10 ml final volume per 8 wells or 120ml for 96 wells e.g. 9.5 ml water ml buffer. Mix. Automated washing: consider excess volumes required for setting up the instrument and dead volume of robot pipette. 3. Microwells Calculate the number of wells required for the test. Remove unused wells from the frame, replace and store them in the provided plastic bag, sealed tightly 4. Pipetting Scheme Make sure all reagents are at room temperature before use (18-24 C) Pipette 100 µl of each patient s diluted serum into the designated microwells. Pipette 100 µl calibrators and controls into the designated wells. Incubate for 30 minutes at room temperature (18-24 C). Wash 3 X with 200 µl washing buffer (diluted 1:20). Pipette 100 µl conjugate into each well. Incubate for 30 minutes at room temperature (18-24 C). Wash 3 X with 200 µl washing buffer (diluted 1:20). Pipette 100 µl substrate into each well. Incubate for 10 minutes at room temperature (18-24 C). Pipette 100 µl stop solution into each well, using the same order as pipetting the substrate. Read absorbance at 450 nm (optionally 450/650 nm) within 30 minutes. NOTE: We recommend to pipette a blank in duplex with each run (sample diluent only, instead of a patient's sample). Manual washing procedure Discard liquid from wells by inverting the plate. Knock the microwell frame with wells down-sided vigorously on clean absorbent paper. Pipette 200 µl of diluted wash buffer into each well, wait for 20 seconds, repeat discard and knocking. Repeat the whole procedure twice again. Establish the calibration curve by plotting the optical density of each calibrator with respect to the corresponding units values. For best results we recommend lin/lin algorithm. From the O.D. of each sample, read the corresponding antibody concentrations expressed in U/ml. Normal Range: IgG 12 U/ml INTERPRETATION Negative result Positive result 12 U/ml 12 U/ml NOTE: Borderline samples should be tested again for confirmation. 2. Semi-quantitative interpretation A semi-quantitative interpretation of the results is available by using the 12 U/ml calibrator as a cut off control. Results are expressed in Binding Index, the ratio between the sample and the cut off s O.D.: B.I. = Sample O.D / Cut-off O.D A sample is negative when B.I. < 1.0 A sample is positive when B.I. > 1.0 NOTE: Borderline samples should be tested again for confirmation. 3. Validation of results A test run is considered valid if the following Quality specifications are met. If not check the whole procedure and repeat the test. If the problem persists call manufacturer or distributor for assistance. Quality specifications O.D. Blank (sample diluent) U/ml Negative control < 20% of Postive U/ml Calibrator 50 % of Calibrator 100 U/ml - Positive control PERFORMANCES 1. Linearity Chosen sera have been tested with this kit and found to dilute linearly. However, due to the heterogeneous nature of human autoantibodies individual samples may not follow this rule in every case. Detailed and updated data are available upon request. 2. Reproducibility Three control sera (High, medium, low) were assayed for intraassay and interassay imprecision in a statistically relevant repetition. The variation coefficients are <10% intra- and <20% inter-lot. Detailed and updated data are available upon request. 3. Clinical Sensitivity and Specificity Sensitivity is estimated to be > 99 % Specificity is estimated to be > 99 % Clinically defined populations (confirmed positive with disease specific reference methodologies) have been used for checking the sensitivity. Specificity was checked with control groups that embrace a normal healthy population as well as clinically defined control groups. Detailed data are available upon request. 4. Expected Values The expected value for a normal patient is a negative result. The number of positives, and the degree of positivity is dependent upon parameters such as population type being tested, treatment, etc. Each laboratory should consequently establish its own expected values based upon the specimens typically being tested. CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS 1. Quantitative interpretation TEST LIMITATIONS 1. A diagnosis should not be made solely on the basis of the test results. Catalogue nr: KAPDTCLG02 PI number : /en Revision nr : /1

5 2. Test results should always be interpreted in conjunction with the complete clinical evaluation and the results of other diagnostic procedures, only. 3. DIAsource ImmunoAssays SA and its authorized distributors shall not be liable for damages indirectly or consequentially brought about by changing or modifying the procedure indicated. The kit should be performed by trained technical staff only. 4. In any case, GLP should be applied with all general and individual regulations to the use of this kit. BASIC TROUBLE SHOOTING Optical density too low Please, check the following possibilities: Inappropriate reader filter (use 450 nm or 450/650nm) Correct dilution of washing buffer (under-diluted) Correct dilution of samples (overdiluted) Inactivation of conjugate (by exogenous substances e.g.). Use clean tips only. Optical density too high Please, check the following possibilities: Insufficient washing (See manual washing procedure) Excess incubation time or temperature Correct dilution of samples (under-diluted) Contamination of substrate reagent (by conjugate e.g. color obviously blue already in the bottle). Use clean tips only. Contamination of samples (by micro-organisms e.g.). Use preferentially fresh samples. BIBLIOGRAPHY Up to date literature is available upon request. Please inquire at Revision date : Catalogue nr: KAPDTCLG02 PI number : /en Revision nr : /1

6 DIAWell Cardiolipin IgG Elisa es 96 test quantitative Enzyme Immunoassay KAPDTCLG02 IN VITRO DIAGNOSTIC DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium - Tel: Fax : INDICACIONES El kit DIAWell Cardiolipin IgG ELISA sirve para la detección cuantitativa de anticuerpos IgG contra Cardiolipin en el suero humano. 2. PRINCIPIO DEL ENSAYO El kit DIAWell Cardiolipin IgG ELISA es un enzimoinmunoensayo de fase sólida que utiliza 96 micropocillos recubiertos, así como un sistema de detección de peroxidasa-tmb. Los micropocillos están recubiertos de cardiolipin purificado y 2GPI recombinant humana. En el procedimiento del ensayo, las muestras de suero están diluidas al 1/51 y son incubadas en los micropocillos. En el caso de existir anticuerpos humanos, éstos se unen al antígeno específico. Los anticuerpos no unidos o sobrantes se eliminan mediante lavado y los anticuerpos de conejo HRPconjugados contra la IgG humana son vertidos en los micropocillos. El conjugado enzimático se une a los complejos antígeno-anticuerpo. Tras un segundo proceso de lavado para eliminar el exceso de conjugado, se añade la solución TMB/sustrato. La actividad enzimática, en el caso de producirse, genera una reacción colorimétrica (azul). Se añade ácido diluido para detener la reacción. Por consiguiente, el color varía del azul al amarillo y puede medirse a 450 nm, utilizando un lector de microplacas convencional. La absorbancia (densidad óptica) es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos IgG unidos al antígeno presente en la superficie de los micropocillos. 3. CONTENIDO DEL KIT 3.1 Material incluido en el kit Para reconstituir: WASH Listo para usar: DIL SUB Cal Ab STOP SPE N HRP CONC L H 20x tampón de lavado 1 vial, 50 ml - 20 x concentrado (azul) Contenido: Tris, Tween, Diluyente de muestra Sustrato negativo Calibrador positivo HRP Conjugado Solución de parada 1 vial, 50 ml (amarillo) Contenido: Tris, Tween, BSA, 1 vial, 20 ml (incoloro) Contenido: TMB/H 2O 2 estabilizado, 1 vial, 1 ml (verde) Contenido: suero humano (diluido), 6 viales, 1 ml cada uno: 0, 25, 50, 100, 200, 400 U/ml. (el color aumenta con la concentración Contenido: suero humano (diluido), 1 vial, 1 ml (azul) Contenido: suero humano (diluido), 1 vial, 20 ml (verde) Contenido: IgA/peroxidasa de conejo anti-humana, Metilisotiazolona (conservante) 1 vial, 20 ml (incoloro) Contenido: ácido sulfúrico al 2.5 % 12 x 8 tiras con micropocillos Placa de microvaloración separados Recubiertas con cardiolipin purificado (bovino) y β 2GPI purificado (humano) Soporte para las tiras Material necesario pero no suministrado Lector de placa Microtítulo (filtro de lectura de 450 nm + filtro de referencia opcional de 650 nm). Frascos de cristal, tubos de ensayo para las diluciones. Agua destilada. Pipetas de precisión (10, 100, 200, 500, 1000 µl) o multipipeta. Dispositivo de lavado de microplacas (pipeta multicanal o sistema automatizado). Papel absorbente. 4. ALMACENAMIENTO Y VIDA ÚTIL Almacene todos los reactivos y micropocillos a 2-8 C. Una vez preparada la solución de lavado (consulte el apartado 7.2), ésta es estable durante un mes a 4 C. Los reactivos y micropocillos sólo deben utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en cada componente. 5. PRECAUCIONES DE USO 5.1 Información sobre el riesgo para la salud ESTE PRODUCTO ES PARA USO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO Y SÓLO DE USO PROFESIONAL. Si bien este producto no se considera particularmente tóxico o peligroso en condiciones normales de uso, consulte las recomendaciones y precauciones siguientes para garantizar la máxima seguridad durante su manipulación: El kit contiene componentes potencialmente peligrosos. Los reactivos pueden irritar los ojos y la piel, por lo que conviene evitar su contacto con estas partes del cuerpo. No fume, ni ingiera alimentos o bebidas durante la manipulación del kit. Todo el material de origen humano utilizado para algunos reactivos contenidos en este kit (controles, estándares) ha sido analizado y ha dado negativo en las pruebas HbsAg, de Hepatitis C y de anticuerpos HIV 1 y 2 mediante métodos aprobados. No obstante, ningún análisis puede garantizar la ausencia total de agentes virales en dicho material. Por esta razón, se recomienda manipular los controles, estándares y muestras de pacientes contenidos en el kit, considerándolos como potencialmente infecciosos. 5.2 Precauciones adicionales No mezcle ni sustituya reactivos o micropocillos de distintos números de lote. Esto puede provocar variaciones en los resultados. Deje que todos los componentes alcancen la temperatura ambiente (18-24ºC) antes de utilizarlos y siga el método de incubación recomendado para el desarrollo óptimo de la prueba. Utilice pipetas con los extremos limpios para evitar contaminar los reactivos con sustancias exógenas. Proteja el sustrato cromógeno reactivo de la luz para evitar que se incrementen los valores en blanco. 6. RECOGIDA, MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Use preferentemente muestras de suero recogido recientemente. No utilice muestras ictéricas, lipémicas, hemolizadas o contaminadas con bacterias. Los sueros con partículas deberán aclararse mediante centrifugado a baja velocidad. Las muestras de sangre deben recogerse en tubos secos. Tras su separación, las muestras de suero deberán utilizarse inmediatamente, almacenándose respectivamente a 2-8 C durante dos o tres días, o bien congelándose a -20 C cuando se trate de periodos más largos. 7. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO 7.1 Muestras Diluya las muestras de suero a 1:51 con diluyente de muestras (listo para usar) por ejemplo, 500 µl de diluyente + 10 µl de suero. Mézclelos. 7.2 Tampón de lavado Diluya el tampón de lavado concentrado a 1:20 con agua destilada. Lavado manual: Prepare 10 ml de volumen final para 8 pocillos o 120ml para 96 pocillos por ejemplo, 9.5 ml de agua ml de tampón. Mézclelos. Catalogue nr: KAPDTCLG02 PI number : /es Revision nr : /1

7 Lavado automatizado: Cuando configure el instrumento, calcule un volumen superior al del lavado manual, así como un volumen muerto si va a utilizar una pipeta automatizada. 7.3 Micropocillos Calcule el número de pocillos necesarios para la prueba. Quite de la placa los pocillos no utilizados, sustitúyalos y almacénelos en la bolsa de plástico que se incluye en el kit, sellándola cuidadosamente. 7.4 Uso de la pipeta Asegúrese de que todos los reactivos se encuentran a temperatura ambiente antes de usarlos (18-24 C) Pipetee 100 µl de suero diluido de cada paciente en los micropocillos designados para este propósito. Pipetee 100 µl de estándares y controles en los pocillos designados para este propósito. Sométalos a incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-24 C). Lávelos 3 veces con 200 µl de tampón de lavado (diluido a 1:20). Pipetee 100 µl de HRP conjugado en cada pocillo. Sométalo a incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-24 C). Lávelo 3 veces con 200 µl de tampón de lavado (diluido a 1:20). Pipetee 100 µl de sustrato en cada pocillo. Sométalo a incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente (18-24 C). Pipetee 100 µl de solución de parada en cada pocillo, siguiendo el mismo orden que utilizó para verter el sustrato. Realice una lectura de la absorbancia a 450 nm (opcionalmente, a 450/650 nm), transcurrido un periodo de 30 minutos. Nota: Por cada pipeteo, recomendamos realizar uno en blanco (sólo con diluyente de muestra, en lugar de utilizar muestras de paciente). Procedimiento de lavado manual Deseche el líquido de los pocillos invirtiendo la placa. Golpee fuertemente la placa con los pocillos colocados en posición invertida sobre papel absorbente limpio. Pipetee 200 µl de tampón de lavado diluido en cada pocillo, espere 20 segundos, vuelva a tirar el líquido y a golpear la placa. Repita todo el procedimiento otras dos veces. 8. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 8.1 Interpretación cuantitativa Establezca la curva estándar trazando la densidad óptica (O.D.) de cada estándar en relación con los valores unitarios correspondientes. Para obtener resultados óptimos, recomendamos el algoritmo lin/lin. A partir de la densidad óptica de cada muestra, lea las concentraciones de anticuerpos correspondientes expresadas en U/ml. Rango normal: IgG 12 U/ml INTERPRETACIÓN Resultatdo negative Resultado positivo 12 U/ml 12 U/ml Nota: Las muestras con resultados situados en valores límite deben comprobarse nuevamente para confirmar dichos resultados 8.2 Interpretación semicuantitativa Resulta disponible la interpretación semicuantitativa de los resultados si se utiliza el estándar 12 U/ml como control de corte. Los resultados se expresan en B.I. (Binding Index o Índice de Unión), que constituye la relación entre la densidad óptica de la muestra y la del control de corte: B.I. = O.D. de la muestra/o.d. del control de corte Una muestra es negativa cuando B.I. < 1.0 Una muestra es positiva cuando B.I. > 1.0 Nota: Las muestras con resultados situados en valores límite deben comprobarse nuevamente para confirmar dichos resultados. 8.3 Validación de los resultados Una prueba de diagnóstico se considera válida si se cumplen las siguientes especificaciones de control de calidad. En caso contrario, consulte el apartado 11, verifique todo el procedimiento y repita la prueba. Si el problema persiste, consulte al fabricante o al distribuidor de este producto. Especificaciones de control de calidad O.D. U./ml En blanco (diluyente de muestras) negativo U/ml estándar 50 % de 100 U/ml estándar - positivo RESULTADOS 9.1 Linealidad Los sueros elegidos han sido analizados con este kit y se ha establecido su idoneidad para su dilución lineal. No obstante, debido a la naturaleza heterogénea de los anticuerpos humanos, las muestras individuales pueden no ceñirse a esta regla en todos los casos. Existe información detallada y actualizada a este respecto a disposición del interesado. 9.2 Reproducibilidad Tres sueros de control (alto, medio y bajo) fueron analizados para establecer la imprecisión intraensayo e interensayo en repeticiones estadísticamente relevantes. Los coeficientes de variación son <10% intralote y <20% interlote. Existe información detallada y actualizada a este respecto a disposición del interesado. 9.3 Sensibilidad y especificidad clínicas La sensibilidad se estima en un 99.0% La especificidad se estima en un 99.0% Las poblaciones definidas clínicamente (confirmadas positivas mediante metodologías de referencia específicas de cada enfermedad) han sido utilizadas para comprobar el grado de sensibilidad. Se verificó la especificidad mediante grupos control que albergaban una población normal sana, así como grupos control definidos clínicamente. Pueden obtenerse datos detallados a petición del interesado Valores esperados El resultado esperado en el paciente normal debe tener un valor negativo. El número de resultados positivos, así como el grado de positividad depende de parámetros tales como el tipo de población que está siendo analizada, el tratamiento, etc. Por consiguiente, cada laboratorio deberá establecer sus propios valores esperados en base a los especímenes que se analicen con mayor frecuencia. 10. LIMITACIONES DE LA PRUEBA 1. No se deberá realizar un diagnóstico basado exclusivamente en los resultados de la prueba. 2. Los resultados de las pruebas deben interpretarse siempre conjuntamente con la evaluación clínica completa y sólo confrontándose con otros procedimientos de diagnóstico. 3. DIAsource ImmunoAssays S.A. y sus distribuidores autorizadas no son responsables de los daños causados indirectamente si los métodos de uso no se respetaron escrupulosamente. El kit se debe realizar por el personal técnico entrenado solamente. 4. En todo caso, GLP se debe aplicar con todas las regulaciones generales e individuales al uso de este kit. 11. RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS BÁSICOS Densidad óptica demasiado baja Verifique las siguientes posibilidades: Filtro de lectura inadecuado (use 450 nm o 450/650nm). Correcta dilución del tampón de lavado (compruebe que no esté poco diluido). Correcta dilución de las muestras (compruebe que no esté sobrediluida). Inactivación del conjugado (por ejemplo, mediante sustancias exógenas). Use sólo pipetas con los extremos limpios. 12. BIBLIOGRAFÍA Densidad óptica demasiado alta Verifique las siguientes posibilidades: Lavado insuficiente (consulte el procedimiento de lavado manual en el apartado 8.4). Demasiado tiempo de incubación o temperatura excesiva. Correcta dilución de las muestras (compruebe que no estén poco diluidas). Contaminación del sustrato reactivo (mediante el conjugado se observa, por ejemplo, cuando el color de la botella es desde el principio de color azul). Use sólo pipetas con los extremos limpios. Contaminación de las muestras (por ejemplo, por microorganismos). Use preferentemente muestras recientes. La literatura actualizada se encuentra disponible a petición del interesado. Sírvase solicitarla en Tech.Support@diasource.be. Última revisión : Catalogue nr: KAPDTCLG02 PI number : /es Revision nr : /1