RIDASCREEN. HSV 2 IgG, IgM. Nº de artículo: K5221 (IgG) K5231 (IgM)
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- Martín Pablo Toro San Martín
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1 RIDASCREEN HSV 2 IgG, IgM Nº de artículo: K5221 (IgG) K5231 (IgM) R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Alemania Teléfono: /Fax:
2 1. Uso previsto Para el diagnóstico in vitro. Las pruebas RIDASCREEN HSV 2 son inmunoensayos enzimáticos (EIA) para la determinación semicuantitativa de IgG o IgM que protegen del virus del herpes simple tipo 2 (HSV 2) en suero humano. La finalidad de estas pruebas es confirmar casos sospechosos de infección con HSV 2 o clarificar el estado inmune. 2. Resumen y explicación de la prueba Tras la infección con HSV, se forman anticuerpos específicos contra agentes patógenos como consecuencia de la respuesta del sistema inmunológico. Gracias al uso de los métodos inmunológicos, es posible determinar los anticuerpos en el suero. El método de prueba utilizado y la elección del antígeno específico para agentes patógenos tienen una especial relevancia en el resultado de la prueba. Ya que es posible diferenciar entre distintas clases individuales de inmunoglobulinas en el ensayo enzimático, podrán realizarse especificaciones más precisas sobre el estado inmunológico de un paciente que aquellas basadas en otros métodos serológicos (p. ej., la prueba de inhibición de la hemaglutinación o la prueba de reacción de fijación de complemento). 3. Principio de la prueba Los antígenos purificados están recubiertos en una placa de micropocillos. Los anticuerpos de las muestras de pacientes se unen a los antígenos y se determinan durante el segundo paso de incubación, mediante el uso de anticuerpos antihumanos etiquetados con enzima (el conjugado). La enzima transforma el sustrato incoloro (H 2 O 2 /TMB) en un producto final de color azul. Para detener la reacción enzimática, hay que añadir ácido sulfúrico, tras lo cual el color de la mezcla cambiará de azul a amarillo al mismo tiempo. La medición final se lleva a cabo en un fonómetro a 450 nm con una longitud de onda de referencia 620 nm. RIDASCREEN HSV
3 4. Reactivos suministrados Tabla 1: contenido del paquete (cada paquete tiene una cantidad de reactivos suficiente para 96 determinaciones) K5221 IgG K5231 IgM Plate 96 det. Placa de micropocillos; 12 tiras de micropocillos (separables) en marco de soporte; recubiertas con glucoproteína purificada G2 (gg2) de HSV 2 Plate 96 det. Placa de micropocillos; 12 tiras de micropocillos (separables) en marco de soporte; recubiertas con antígeno total de HSV 2 SeroPP 110 ml Tampón de muestras, listo para el uso; solución NaCl tamponada con fosfato; teñida de amarillo; contiene timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05% SeroWP 100 ml Tampón de lavado, concentración de 10 veces; solución NaCl tamponada con Tris; contiene Bronidox-L al 0,2 % y Tween 20 al 0,5% Control IgG + tapa verde 2,5 ml Control estándar IgG, listo para el uso; suero humano diluido; teñido de verde; contiene timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05% Control IgM + tapa roja 2,5 ml Control estándar IgM, listo para el uso; suero humano diluido; teñido de rojo; contiene timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05% Control IgG tapa incolora 1,2 ml Control negativo IgG, listo para el uso; suero humano diluido; contiene timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05% Control IgM tapa incolora 1,2 ml Control negativo IgM, listo para el uso; suero humano diluido; contiene timerosal al 0,01% y Tween 20 al 0,05% Control IgG A tapa verde Control IgG B tapa verde 1,2 ml Control A IgG, listo para el uso; suero humano diluido; contiene Timerosal al 0,01 % y Tween 20 al 0,05% 1,2 ml Control B IgG, listo para el uso; suero humano diluido; contiene Timerosal al 0,01 % y Tween 20 al 0,05% Control IgM A tapa roja Control IgM B tapa roja 1,2 ml Control A IgM, listo para el uso; suero humano diluido; contiene Timerosal al 0,01 % y Tween 20 al 0,05% 1,2 ml Control B IgM, listo para el uso; suero humano diluido; contiene Timerosal al 0,01 % y Tween 20 al 0,05% SeroG LD tapa verde 12 ml Conjugado antihumano IgG (cabra), listo para el uso; anticuerpos conjugados con peroxidasa en una solución proteica estabilizada; contiene 10 ppm de Proclin, metilisotiazolinona al 0,01%, bromonitrodioxano al 0,01% SeroM LD tapa roja 12 ml Conjugado antihumano IgM (cabra), listo para el uso; anticuerpos conjugados con peroxidasa en una solución proteica estabilizada; contiene 10 ppm de Proclin, metilisotiazolinona al 0,01%, bromonitrodioxano al 0,01% RIDASCREEN HSV
4 SeroSC 12 ml Sustrato; H 2 O 2 /tetrametilbenzidina; listo para el uso SeroStop 12 ml Reactivo de parada 0,5 M de ácido sulfúrico; listo para el uso 5. Instrucciones de almacenamiento Este Kit, almacenado a una temperatura entre 2 y 8 C, puede ser utilizado hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. : El buffer de lavado diluido se puede conservar 4 semanas si se mantiene a 2 8 C, o una semana a temperatu ra ambiente (20 25 C). Después de la fecha de caducidad no se asume ninguna garantía de calidad. La bolsa de aluminio que contiene la placa de micropocillos debe abrirse con cuidado de no arrancar el cierre a presión. Las tiras de micropocillos que no se necesiten deberán volver a introducirse inmediatamente en la bolsa de aluminio con una temperatura de almacenamiento de 2-8 C. Es preciso evitar la contaminación de los reactivos y la exposición del substrato incoloro a la luz directa. 6. Reactivos necesarios adicionales y equipo requerido 6.1. Reactivos Agua destilada o desionizada 6.2. Accesorios Estufa a 37ºC Tubos de prueba Mezclador de vórtices Micropipetas con volúmenes de µl y µl Cilindro de medición (1.000 ml) Reloj de parada Instrumento de lavado para las microplacas o pipeta multicanal Lector de microplacas (450 nm, longitud de onda de referencia 620 nm) Papel de filtro (toallas de laboratorio) Contenedor de residuos con una solución de hipoclorito sódico al 0,5 % RIDASCREEN HSV
5 7. Precauciones para los usuarios Sólo para el diagnóstico in vitro. Esta prueba debe llevarla a cabo exclusivamente el personal de laboratorio cualificado. Debe cumplir en todo momento las directrices de trabajo para laboratorios médicos así como las instrucciones para la realización la prueba. No pipetee las muestras o los reactivos con la boca y evite el contacto con una herida en la piel o membranas mucosas. Cuando manipule muestras, debe utilizar guantes desechables y lavarse las manos después de finalizar la prueba. No fume, coma ni beba en las zonas donde se están utilizando muestras o reactivos de prueba. Se han analizado los sueros de control del kit (control estándar y control negativo, control A y control B) en busca de HIV- y HCV-Ab o HbsAg con resultados negativos. Sin embargo, de forma similar a las muestras de pacientes y todos los materiales con los que han estado en contacto, se deben tratar como potencialmente infecciosos y manipularse según las normativas de seguridad nacionales correspondientes. El control estándar y el control negativo, el control A y el control B, así como el tampón de muestras contienen timerosal al 0,01 % como agente conservante. Evite el contacto de esta sustancia con la piel o membranas mucosas. El tampón de lavado contiene Bronidox-L al 0,2 % como agente conservante. Evite el contacto de esta sustancia con la piel o membranas mucosas. El H 2 O 2 (sustrato) puede provocar quemaduras. Manipule esta sustancia con cuidado. El reactivo de parada contiene 0,5 M de ácido sulfúrico. Evite el contacto con la piel y la ropa. En caso de entrar en contacto el reactivo de parada, enjuague la parte afectada de la piel con agua. Todos los reactivos y materiales que entren en contacto con las muestras potencialmente infecciosas deben tratarse con desinfectantes apropiados o colocarse en un autoclave una hora como mínimo a 121 C. ATENCIÓN: para prevenir la fo rmación de gases venenosos, es preciso neutralizar todos los líquidos que contengan reactivo de parada antes de añadirlos a la solución de hipoclorito. 8. Recolección y almacenamiento de las muestras La prueba tiene como objeto analizar las muestras de suero humano. Después de su extracción, la sangre debe separarse lo antes posible de los coágulos para evitar la hemólisis. Las muestras deben estar almacenadas en frío o congeladas hasta que se realice la prueba. Debe evitar a toda costa los ciclos repetidos de congelación/descongelación y la contaminación RIDASCREEN HSV
6 microbial. La utilización de muestras inactivadas por el calor, lipémicas, hemolíticas, ictéricas o turbias puede provocar resultados erróneos. Tabla 2: almacenamiento de las muestras Suero no diluido Suero diluido 2-8 C -20 C 2-8 C 1 semana >1 semana 7 horas 9. Procedimiento de la prueba 9.1. Información general Antes de su uso, es preciso que todos los reactivos y la placa de micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25 C). No extraiga las tiras de micropocillos de la bolsa de aluminio hasta que estén a temperatura ambiente. Mezcle bien los reactivos justo antes de su utilización. Justo después de su uso, el kit debe volver a almacenarse a 2-8 C. Emplee únicamente el volumen de reactivo necesario para el procedimiento de la prueba. No vuelva a verter los reactivos en los viales ya que esto puede ser contaminante. No vuelva a verter los reactivos en los viales para evitar la contaminación de los reactivos. Las tiras de micropocillos no se pueden utilizar más de una vez. Los reactivos y las tiras de micropocillos no se deben utilizar si el envase está dañado o si los viales presentan fugas. Algunos reactivos del kit no son específicos de la prueba. Los reactivos con la etiqueta Sero (como SeroPP) también se pueden utilizar con otros ensayos EIA RIDASCREEN Sero con los reactivos correspondientes. Los sueros de control están relacionados con el lote. No se deben entremezclar sueros de control de kits de diferentes números de lote. Los controles A y B de RIDASCREEN Sero ELISA se suministran adicionalmente en los kits RIDASCREEN Sero ELISA. Son controles para realizar un control de calidad adicional, siendo su uso optativo. Contienen suero control humano a distintas concentraciones de anticuerpo Preparación del tampón de lavado Se mezcla 1 parte de concentrado de tampón de lavado SeroWP con 9 partes de agua destilada. Para ello, vierta 100 ml de concentrado en un cilindro de medición de ml y añada la solución a ml de agua destilada. Si hay cristales presentes en el concentrado, se deben disolver antes mediante un baño de agua a 37 C. El buffer de lavado diluido se puede conservar 4 semanas si se mantiene a 2 8 C, o cinco dias a temperatura ambiente (20 25 C). RIDASCREEN HSV
7 9.3. Preparación de las muestras Diluya las muestras de suero que va a analizar con el tampón de muestras SeroPP 1:100 antes de empezar la prueba. Por ejemplo, 10 µl de suero µl de SeroPP Para determinaciones de IgM, se recomienda someter el suero a absorción de IgG (por ej., con absorbente RIDA RF-Absorbent, nº de artículo Z0202) antes de las pruebas. A continuación, ajuste la dilución necesaria para la prueba con el tampón de muestras. Nota: el control negativo y el control estándar y los controles A y B se suministran listos para su uso y NO se deben diluir ni absorber Primera incubación espués de introducir un número suficiente de pocillos en el soporte, pipetee 100 µl de suero diluido y 100 µl de control listo para utilizar en cada uno de los pocillos correspondientes dejando vacía la posición A1 (valor de blanco de reactivos). Añada el control negativo Control IgG - o Control IgM - una vez y el control estándar Control IgG + o Control IgM + por duplicado.. Añadir el control A y el control B una vez. Cubra la placa e incube a 37 C durante 30 minutos en una estufa. Durante este proceso, el fondo de los pocillos no debe tocar materiales conductores de calor (como metales o papel húmedo). La placa de micropocillos debe estar cubierta durante la incubación. Se deben utilizar los controles que se corresponden con la determinación (IgG o IgM). A1 Valor del blanco de reactivos B1 Control negativo C1 Control estándar D1 Control estándar E1 Control A F1 Control B G1, H1 Suero de pacientes 1, 2, etc. Nota: la placa de micropocillos no se debe colocar en un contenedor de incubación frío que alcance los 37 C durante la incubación. La tempera tura del contenedor se debe ajustar a 37 C previamente Lavado RIDASCREEN HSV
8 Los pocillos se deben vaciar en un contenedor de residuos con solución de hipoclorito para su desinfección. A continuación, coloque la placa sobre papel absorbente para eliminar la humedad residual. Lave entonces la placa 4 veces con 300 µl de tampón de lavado cada vez. Asegúrese de que los pocillos están completamente vacíos volcándolos sobre una parte no utilizada del papel absorbente tras cada lavado. Si utiliza un instrumento de lavado para microplacas, asegúrese de que el equipo está correctamente ajustado al tipo de placa en uso. Tras el lavado, coloque la placa sobre papel absorbente limpio para eliminar la humedad residual Segunda incubación Añada 100 µl de conjugado SeroG LD o SeroM LD a los pocillos correspondientes (incluido el A1). A continuación, cubra la placa e incube a 37 C durante 30 minutos en una estufa (consulte el apartado 9.4) Lavado Realice 4 lavados tal como se indica en el apartado Tercera incubación Añada 100 µl de sustrato SeroSC a cada pocillo. A continuación, cubra la placa e incube a 37 C durante 30 minutos en una cámara húmeda / inc ubatora. Detenga entonces la reacción añadiendo 100 µl de reactivo de parada SeroStop en cada pocillo. Después de mezclar cuidadosamente (golpeando suavemente el extremo de la placa), mida la absorbancia a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 nm) en un fotómetro para palcas. Calibre el valor del blanco de reactivos (posición A1) a cero. Nota: antes de realizar la medición, limpie con un paño la cara inferior de la placa de micropocillos para eliminar el agua condensada. 10. Control de calidad e Indicios de inestabilidad o deterioro El control estándar (por duplicado) y el control negativo se deben utilizar cada vez que se realiza la prueba para garantizar la calidad de la misma. Sabrá que la prueba se ha realizado correctamente si el promedio de absorbancia del control estándar en 450/620 nm se encuentra dentro del intervalo establecido en la hoja de datos adjunta. Si las dos mediciones individuales difieren del valor medio en más de un 20 %, habrá que volver a repetir la prueba. La absorbancia del control negativo en 450/620 nm debe ser < 0,3. RIDASCREEN HSV
9 Los controles A y B de RIDASCREEN Sero ELISA son controles adicionales para realizar control de calidad que pueden emplearse opcionalmente. Los valores diana están indicados en el certificado de calidad de lote. Los valores obtenidos (U/ml, IU/ml o mui/ml) deberían tomarse como valores de referencia para el aseguramiento de calidad en laboratorios acreditados. Si los valores son distintos a los requeridos, si el reactivo está turbio o si el sustrato se ha vuelto azul antes de añadirlo a los pocillos, es posible que los reactivos estén caducados. Si no se obtienen los valores estipulados, se deben comprobar los siguientes aspectos antes de repetir la prueba: La fecha de caducidad de los reactivos utilizados La funcionalidad del equipo utilizado (por ej.,calibración) El correcto procedimiento de la prueba Inspección visual de los componentes del kit en busca de contaminación o fugas. No se debe utilizar una solución de sustrato que se haya vuelto de color azul. Si tras repetir la prueba siguen sin cumplirse las condiciones, póngase e contacto con su distribuidor local de R-Biopharm. 11. Evaluación e interpretación La prueba se puede evaluar con tres métodos distintos: 1. Con la curva estándar suministrada en el kit 2. Con la tabla de valores (consulte la hoja de datos suministrada con el kit) 3. Matemáticamente, con le método de 4-parámetros o el método α Hay que restar el valor del blanco de reactivos a cada valor medido antes de llevar a cabo la evaluación Evaluación con la curva estándar suministrada en el kit Para llevar cabo una evaluación mediante la curva estándar, debe corregirse primero el valor medio para el control estándar, a fin de tener en cuenta cualquier fluctuación que pudiera producirse de un día a otro. El factor de corrección F se calcula a partir del valor medio actual del control estándar y su valor nominal. La hoja de datos incluye el valor nominal, el cual depende del lote. F = valor nominal del control estándar valor medio medido para el control estándar RIDASCREEN HSV
10 Todos los valores de OD de las muestras deben multiplicarse por el factor F. Con los valores corregidos, se hace entonces una lectura del valor correspondiente en U/ml en la curva estándar Evaluación mediante la tabla de valores La absorbancia correspondiente al control estándar se utiliza para identificar la columna de la tabla con el intervalo de valores aplicable a la medición actual. La absorbancia medida de la muestra se asigna al intervalo apropiado de valores y en la segunda columna, de izquierda a derecha, se hace una lectura del contenido en U/ml. Por ejemplo, el valor de absorbancia del control estándar para una medición determinada es 0,86. En este caso, hay que utilizar la columna de la tabla con el intervalo entre 0,85 y 0,91 para determinar los resultados. Por tanto, una muestra de paciente con una absorbancia de 0,65 se corresponde con el rango de contenido entre 50,1 y 100,0 U/ml. (Los valores citados son sólo ejemplos y pueden diferir de la información actualmente mostrada en la hoja de datos.) La evaluación de los resultados determinados (positivo (+), negativo (-) o equívoco (?)) debe basarse en la primera columna de la tabla de valores. RIDASCREEN HSV
11 U/ml Intervalo de valores del control estándar 0,85-0,91 - < 16,0 < 0,26? 16,0-20,0 0,26-0,30 20,1-50,0 0,31-0,54 50,1-100,0 0,55-0, ,1-200,0 0,79-1,04 200,1-400,0 1,05-1,29 400,1-1000,0 1,30-1,65 > 1000,0 > 1,65 Ilustración 1: Ejemplo de una determinación de IgG (Extracto de la hoja de datos de un lote) Evaluación matemática La hoja de datos contiene los valores necesarios para la evaluación matemática según el método de 4-parámetros o el método α Resultado de la prueba Tabla 3: evaluación de las unidades determinadas IgG IgM negativo < 16 U/ml < 16 U/ml equívoco U/ml U/ml positivo < 20 U/ml < 20 U/ml 12. Limitaciones del método La prueba RIDASCREEN HSV 2 EIA detecta los anticuerpos IgG o IgM que protegen del HSV 2. Estas pruebas no pueden utilizarse para determinar una relación entre la extinción determinada y la manifestación de síntomas clínicos graves. Los resultados obtenidos deben interpretarse siempre dentro del cuadro clínico. RIDASCREEN HSV
12 La prueba de IgG contiene glucoproteína G2 (gg2) como antígeno. La gg2 es un elemento altamente específico para la detección de anticuerpos IgG contra el HSV 2. A diferencia de lo que ocurre con el antígeno total, en esta prueba no se producen reacciones cruzadas conocidas con anticuerpos contra el HSV 1. Sólo puede obtenerse una prueba serológica clara de que existe una infección de HSV 2 si se usa gg2. En la mayoría de los casos, los anticuerpos IgM están dirigidos contra antígenos distintos a la glucoproteína G2. Por este motivo, la prueba de IgM utiliza un antígeno total de HSV 2, que muestra epítopos parcialmente similares como el antígeno HSV 1. De este modo, los anticuerpos IgM contra el HSV 1 pueden hacer que se origine un resultado positivo en la prueba. No obstante, la prueba está ajustada de forma que la obtención de un resultado positivo más alto en el HSV 2 EIA en comparación con el RIDASCREEN HSV 1 EIA podría indicar una infección de HSV 2. Se recomienda hacer una búsqueda paralela de anticuerpos contra el HSV 1 y el HSV 2 para aumentar la fiabilidad del diagnóstico. La detección positiva de IgM no siempre es prueba de una infección principal. En algunos casos, pueden generarse anticuerpos IgM de forma repetida. Un resultado negativo no indica necesariamente la ausencia de una infección de HSV. Durante las primeras fases de la infección, el número de anticuerpos puede ser todavía tan pequeño que pase desapercibido y dé lugar a un resultado negativo. En este caso, si existiera sospecha de infección por razones clínicas, será preciso repetir la prueba en una segunda muestra de suero extraída cuatro semanas más tarde. Es necesario extraer siempre dos muestras de suero consecutivas de un paciente y someterlas a un análisis serológico para mejorar la calidad del diagnóstico. El progreso que ha seguido el contenido es importante a la hora de interpretar lo que se detecta. La obtención de un resultado positivo no descarta la presencia de otro patógeno infeccioso como causa de la enfermedad. 13. Características de rendimiento Tabla 4: Variación entre ensayos (n = 5) Variación entre ensayos IgG IgM OD CV OD CV Suero 1 0,126 4,7 % 0,277 7,2 % Suero 2 0,856 8,1 % 0,616 7,6 % Suero 3 2,065 6,8 % 1,111 3,6 % RIDASCREEN HSV
13 Tabla 5: Variación dentro del ensayo (n = 24) Variación dentro del ensayo IgG IgM OD CV OD CV Suero 1 0,354 6,2 % 0,254 7,7 % Suero 2 0,891 6,7 % 0,545 5,6 % Suero 3 2,035 4,4 % 1,044 2,9 % Tabla 6: Sensibilidad y especificidad en comparación con otros ensayos ELISA del mercado IgG IgM Sensibilidad 100,0 % 100,0 % Especificidad 92,0 % 98,6 % Tabla 7: Resultados de los análisis de 212 sueros de donantes de sangre extraídos en un centro de donaciones de Alemania 212 sueros de donantes de sangre IgG IgM negativo 83,0 % 93,5 % equívoco 2,8 % 0,5 % positivo 14,2 % 6,0 % RIDASCREEN HSV
14 Referencias 1. Hashido, M., Kawana, T.: Herpes simplex virus-specific IgM, IgA and IgG subclass antibody responses in primary and nonprimary genital herpes patients. Microbiol. Immunol. 41 (5): (1997) 2. Juto, P., Settergren, B.: Specific serum IgA, IgG and IgM antibody determination by a modified indirect ELISA-technique in primary and recurrent Herpes simplex virus infection. J. Virol. Methods 20 (1): (1988) 3. Kunkel, M., Oberender, H.: Herpes simplex virus type 2 infection. Etiology, clinical aspects, diagnosis, therapy, HSV-2 and cervix cancer. Zentralbl. Gynakol. 107 (24): (1985) 4. Morris, G.E., Coleman, R.M., Best, J.M., Benetato, B.B., Nahmias, A.J.: Persistence of serum IgA antibodies to Herpes simplex, varicella-zoster, cytomegalovirus, and rubella virus detected by enzyme-linked immunosorbent assays. J. Med. Virol. 16 (4): (1985) 5. Rabie-Finger, H., Valentine-Thon, E., Steinmann, J., Nehrkorn, A.: Serological responses to Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) analysed with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and western blot (WB). Acta Virol. 35 (2): (1991) 6. Webb, D.H., Fife, K.H.: Genital Herpes simplex virus infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 1 (1): (1987) RIDASCREEN HSV
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