Desarrollo y Validación de un Método Analítico para el Control de Calidad de Ergocalciferol Inyectable al 0,5 %

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1 Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm. 26 (1): (2007) Notas técnicas Recibido el 16 de marzo de 2006 Aceptado el 4 de septiembre de 2006 Desarrollo y Validación de un Método Analítico para el Control de Calidad de Ergocalciferol Inyectable al 0,5 % Caridad M. GARCÍA PEÑA *, Joel CONCEPCIÓN, Francisco GÓMEZ LOTTI & Viviana FUSTÉ Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 N 1605 e/ Boyeros y Puentes Grandes. Plaza de la Revolución, La Habana, Cuba RESUMEN. En el presente trabajo se desarrolló y validó un método analítico alternativo aplicable en el control de la calidad del Ergocalciferol inyectable 0,5% por Cromatografía Líquida de Alta Resolución con detección ultravioleta a 254 nm. La curva de calibración se realizó en el rango de 0,3 a 0,7 mg/ml, la cual fue lineal con un coeficiente de correlación igual a 0,99902; el test estadístico para el intercepto y la pendiente resultó ser no significativo. El recobrado obtenido fue de 99,5% en el rango de concentración estudiado y las pruebas de Cochran (G) y Student s (t) fueron no significativas. El coeficiente de variación en el estudio de la repetibilidad fue igual a 0,39% para seis réplicas ensayadas, mientras que en los análisis de la precisión intermedia las pruebas de Fischer y Student fueron no significativas. El método resultó específico, lineal, preciso y exacto. SUMMARY. Development and validation of an analytic method for the quality control of Ergocalciferol injection 0.5%. An alternative analytical method was developed and validated for the quantification of 0.5% injectable Ergocalciferol by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection at 254 nm. The calibatrion curve was performed in the range from 0.3 to 0.7 mg/ml which was lineal, with a correlation coefficient equal to The statistical test for the interval and the slope were considered non significant. It was attained a recovery of 99.5% in the studied concentration range. Cochran (G) and Student s (t) tests were not significants. The variation coefficient in the repeatability study was equal to 0.39% for six tested replicas, whereas Fischer and Student s tests were not significant in the analysis of intermediate precision. The method was considered specific, lineal, accurate and exact. INTRODUCCIÓN El inyectable de ergocalciferol, o vitamina D, se utiliza en dosis terapéutica en la prevención y tratamiento de los estados carenciales de vitamina D, para elevar y mantener los niveles de calcio y fósforo en el organismo. También se usa en el tratamiento de hipofosfatemia familiar (raquitismo resistente a la vitamina D) y en la hipocalcemia asociada a la hipoparatiroidismo 1-3. Aparecen reportados varios métodos de análisis para determinar ergocalciferol, en diferentes formas farmacéuticas, por espectrofotometría y por cromatografía líquida de alta resolución. En el análisis del ergocalciferol inyectable, para el control de la calidad, se utiliza frecuentemente el método espectrofotométrico específico para las muestras que utilicen como excipiente el aceite de maní, no así para las muestras inyectables que emplean como excipiente el oleato de etilo 4, 5. Por este motivo se decidió desarrollar un método analítico alternativo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aplicable en la cuantificación del ergocalciferol en el inyectable. Siempre que se desarrolla un método analítico se exige como estudio complementario la validación del mismo porque este estudio proporciona un alto grado de confianza y seguridad en el método. En la validación del método analítico se estudiaron los siguientes parámetros: especificidad, linealidad del método, precisión y exactitud. PALABRAS CLAVE: Control de Calidad, Ergocalciferol, Cromatografía Líquida de Alta Resolución. KEY WORDS: Ergocalciferol, high performance liquid chromatography (HPLC), Quality Control. * Autor a quien dirigir la correspondencia. cinfa@infomed.sld.cu ISSN

2 GARCÍA PEÑA C.M., CONCEPCIÓN J., GÓMEZ LOTTI F. & FUSTÉ V. MATERIALES Y MÉTODOS La sustancia de referencia química de ergocalciferol fue suministrado por el grupo de sustancias de referencia del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). El producto terminado en forma de inyectable al 0,5% (0,5 mg de Ergocalciferol y excipientes csp 100 ml), fue elaborado en la Empresa Farmacéutica Juan R. Franco. Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC. En el ensayo se empleó un cromatógrafo (Knauer) con detector UV/VIS (Knauer) ajustado a 254 nm, un inyector (Loop) de 20 µl e integrador (Shimadzu CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna Nucleosil C En el desarrollo del método de análisis se emplearon varias proporciones de pentanol y hexano, como fase móvil, con una velocidad de flujo de 2.0 ml/min 6,7. Para el análisis se disolvió una cantidad exacta de la sustancia de referencia química en fase móvil, de modo que se obtuviera una solución con una concentración final de 0,5 mg/ml. Las muestras fueron preparadas de forma similar, disolviendo en fase móvil, una alícuota de 1 ml del pool elaborado, con 20 ámpulas. En la validación del método analítico la fase móvil óptima, consistió en una mezcla de Pentanol: Hexano (8:992). Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizó la sustancia de referencia química, el placebo (contiene todos los excipientes de la formulación menos el ergocalciferol), muestra de inyectable y muestras del inyectable de concentración 0,5 mg/ml sometida a condiciones drásticas tales como: hidrólisis ácida HCl 3 N, hidrólisis básica NaOH 3 N, oxidación H 2 O 2 y exposición a la luz, por un periodo de 7 días, realizándose los scannings de las soluciones correspondientes, entre 200 y 500 nm 8,9. Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones de la sustancia de referencia química de Ergocalciferol en un rango de concentraciones de 0,3 a 0,7 mg/ml, que representan del 60 al 140 % de la concentración teórica del principio activo en la solución 7. Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 6 determinaciones de la muestra y se efectuaron valoraciones por dos analistas en dos días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método 9. En el estudio de la exactitud y linealidad del método se empleó el método de recuperación, preparando muestras con diferentes niveles de Ergocalciferol que representaban el 80, 100 y 120% de la concentración teórica del principio activo en la solución, según la formulación propuesta 8. RESULTADOS En el desarrollo del método analítico de emplearon diferentes proporciones de hexano y pentanol, como fase móvil, obteniéndose los mejores resultados empleando con una mezcla Pentanol: Hexano (8:992). La Fig. 1 muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Como se observa en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (A) no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, al ser comparado con la señal obtenida para la solución de la sustancia de referencia química (B) y de la muestra del inyectable de Ergocalciferol (C) lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solución no interfieren en la determinación del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drásticas de: hidrólisis ácida, hidrólisis básica, oxidación y exposición a la luz, se observan en los cromatogramas (D, E, F, G respectivamente) la aparición de un pico secundario, a los 5,4 aproximadamente, atribuible a un posible producto de degradación, el cual no interfiere en la determinación del principio activo, demostrándose la especificidad del método al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusión del producto principal. Simultáneamente se realizó un scanning al pico correspondiente al principio activo en un rango de 200 a 500 nm, obteniéndose una pureza del 99,6%. En la Tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema. El resultado del estudio de precisión del método desarrollado aparece reportado en la Tabla 2. En las Tablas 3 y 4, aparecen reportados los resultados del estudio de exactitud. DISCUSIÓN Se empleó como fase móvil, una mezcla de Pentanol: Hexano (8:992), para la validación del método analítico aplicable en el control de la calidad del inyectable de Ergocalciferol 0,5% por ser la proporción donde se logra la mejor separación del principio activo con respecto a los excipientes de la formulación y los productos de degradación del mismo, así como la mejor apariencia visual del pico y el mejor porciento de pureza del pico, demostrandose el no so- 104

3 Latin American Journal of Pharmacy - 26 (1) Figura 1. Resultados del estudio de especificidad del método. A) Cromatograma del placebo. B) Cromatograma de la sustancia de referencia química. C) Cromatograma de la muestra de Ergocalciferol inyectable. D) Cromatograma de la muestra degradada por Hidrólisis Ácida HCl 3N. E) Cromatograma de la muestra degradada por Hidrólisis Básica NaOH 3 N. F) Cromatograma de la muestra degradada por Oxidación. G) Cromatograma de la muestra degradada por exposición a la luz. Parámetros Resultados Límites Ecuación de la recta y = 20, ,682 x y = a x + b r = 0,99902 r 0,99900 Prueba de linealidad C.V f = 3,93% C.V f > 5,0% Prueba de proporcionalidad t calculada = 2,79 t calculada < t tabulada t tabulada = 3,18 Tabla 1. Estudio de la linealidad del método. C.V f : coeficiente de variación de los factores de respuesta; r: coeficiente de correlación; t: estadígrafo t-student. 105

4 GARCÍA PEÑA C.M., CONCEPCIÓN J., GÓMEZ LOTTI F. & FUSTÉ V. Analista 1 Analista 2 Día 1 Día 2 Día 1 Día 2 97,4 % 96,9 % 96,4 % 97,1 % 96,5 % 97,3 % 97,4 % 96,7 % 97,3 % 96,7 % 97,1 % 96,9 % 96,9 % 97,1 % 96,8 % 97,0 % 97,1 % 96,5 % 96,9 % 97,4 % 97,0 % 97,2 % 97,4 % 96,8 % X 1 = 97,03% X 2 = 96,95 % X 1 = 97,0% X 2 = 96,98% CV = 0,33% CV = 0,32 % CV = 0,39% CV = 0,26% F cal = 1,03 t cal = 0,98 F tab = 3,79 t tab =2,4 Tabla 2. Estudio de la precisión del método analítico. Leyenda: X: media; CV: Coeficiente de variación; t: estadígrafo t-student; F: estadígrafo F-Fischer. mg agregados mg recuperados promedio Recobrado (%) C.V (%) 4 mg 3,92 mg 98,0 1,28 5 mg 5,04 mg 100,8 0,99 6 mg 5,98 mg 99,7 1,07 Tabla 3. Resultados de estudio de exactitud. (n=3). C.V: coeficiente de variación. Parámetros Resultados Límites Ecuación de la recta Y= 1,08 x - 0,45; r = 0,99943 Y = a x + b; r 0,99900 Prueba de linealidad C.V f = 2,89% C.V f < 5,0% Recuperación media 99,5% 98,0-102,0% Prueba de proporcionalidad t calculada = 1,74 t tabulada = 3,18 t calculada < t tabulada Influencia del factor concentración G calculada = 0,6064 G tabulada = 0,8709 G calculada < G tabulada Tabla 4. Resultados estadísticos del estudio de exactitud. C.V f : coeficiente de variación de los factores de respuesta; r: coeficiente de correlación; t: estadígrafo t-student; G: estadígrafo G Cochran. lapamiento de los productos de degradación 6,7. Los resultados obtenidos del análisis de la muestra placebo, la solución de referencia, la muestra del producto terminado y las muestras degradadas por hidrólisis ácida con HCl 3 N, hidrólisis básica con NaOH 3 N, oxidación con H 2 O 2 y por exposición a la luz, que se muestran en la figura 1, demuestran la especificidad del método al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusión del producto principal 8,9. El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza del pico de Ergocalciferol, en el rango de 200 a 500 nm demostró que no existían solapamiento de otros productos de degradación. La curva de calibración resultó ser lineal en un rango de concentraciones entre 0,3 y 0,7 µg/ml. Al aplicar la prueba del intercepto, éste resultó ser no significativo ya que la t c a l c u l a d a fue menor que la t tabulada. En la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variación de los factores de respuesta CV f se obtuvo un coeficiente de variación menor del 5% lo que demuestra la adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido, por lo que se demuestra el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentración estudiado

5 Latin American Journal of Pharmacy - 26 (1) En el estudio de la repetibilidad se alcanzó un coeficiente de variación adecuado lo que nos demuestra la buena precisión del método según el límite para los métodos cromatográficos CV 2%. Los valores obtenidos para el estudio de la precisión intermedia demuestran que no existen diferencias significativos entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días, ya que el valor de F calculada es menor que la F tabulada. Al realizar la prueba de Student el valor calculado resultó ser menor que el tabulado, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas 9. En el rango seleccionado en el estudio de exactitud, los valores de porciento de recobro estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos (98-102%) y los valores del coeficiente de variación para cada uno de los niveles de concentración estudiados resultaron ser menor que el 2%. En la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran se obtuvo que G experimental fue menor que la G tabulada ; por tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes y nos indican que la concentración no influye en la variabilidad de éstos. No existen diferencias significativas entre la recuperación media y el 100% de recuperación al aplicar la prueba de Student, ya que la t calculada fue menor que la t tabulada, por lo que el método es exacto. La curva de recuperación reportada de mg agregados contra los mg recuperados demostró un comportamiento lineal. La prueba de significación del intercepto resultó no significativo y el valor de la pendiente no difiere significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación demostraron la exactitud y linealidad del método 8. CONCLUSIONES El método analítico desarrollado por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR) para el control de la calidad del Ergocalciferol inyectable resultó ser lineal, preciso, exacto y específico en el intervalo de concentraciones de 0,3 y 0,7 mg/ml. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Goodman & Gilman (1994) Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. Tomo II. Tercera Reimpresión. Edición Revolucionaria. La Habana. 2. Martindale the Extra Pharmacopoeia (1989) Twenty-eight edition. The Pharmaceutical Press. London, págs Vademecum Internacional (1994). Especialidades farmaceúticas y biológicas. Productos y Artículos de Parafarmacia. Métodos de Diagnóstico; edición Farmacopea de los Estados Unidos Edición 27 (USP 27), Copyright. Inc. Versión Electrónica. 5. Eisei, S. & K. Hokuko (1998) Ergocalciferol Referente Standard (Control 971) of Nacional Institute of Health Sciences 116: Quattrocchi, O.A. & R.F. Laba (1992) Introducción a la HPLC en Aplicación y práctica. Ed. Artes Gráficas Farro S.A; Buenos Aires, págs , 284, U.S. Food & Drug Administration (2001) Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods. Validation Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. FDA/Center for Drug Evaluation and Research. 8. U.S. Food & Drug Administration (1995) International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedure. ICH-Q2A, Geneva. 9. U.S. Food & Drug Administration (2000) Guidance for Industry (August 2000) Analytical Procedure and Methods Validation. Draft Guidance. 107