Formación de t ilosas y cambios en los compuestos fenólicos de r aíces de viña inf ect adas con Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium sp.

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1 Formación de t ilosas y cambios en los compuestos fenólicos de r aíces de viña inf ect adas con Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium sp. JOSÉ A. DEL RIO 1, ANA GONZALEZ 1, MARÍA D. FUSTER 1, JUANA M. BOTIA 1, PEDRO GOMEZ 1, VÍCTOR FRIAS 2 and ANA ORTUÑO 1 Departamento de Biología Vegetal (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología. Universidad de Murcia Murcia, España. Agrométodos S.A., Pozuelo de Alarcón, Madrid, España. Palabras clave: Compuestos polifenólicos, taninos, resveratrol, vid, enfermedad de Petri, BR OT OMAX R esúmen En este trabajo se ha estudiado la implicación de los compuestos fenólicos en la resistencia de viña a la enfermedad de "decaimiento de viñas jóvenes (1) ". También ha sido relacionada dicha enfermedad con la formación de tilosas. Un estudio microscópico de las tilosas muestra que se originan a partir de células parenquimáticas adyacentes al xilema, desde donde se invade la luz del xilema. La formación de tilosas es debida a cambios producidos en la pared celular y esta asociada con la acumulación de estructuras cristalinas. Alrededor del xilema bloqueado, las células contienen mayor contenido en compuestos polifenólicos que células de xilema intacto. Los cambios en los niveles y composición de los compuestos polifenólicos son relacionados con la severidad de la infección. Así mismo, la concentración de taninos también se incrementa con el numero de vasos del xilema con tilosas. Cultivos fúngicos con extractos de raíz de viña, inhiben el crecimiento micelial de Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum y P. inflatipes. La inhibición fue mayor con extractos de raíz con tilosas y son también correlacionados con el contenido polifenólico. Extractos de hojas, tallos y frutos de viñas tratadas con Brotomax, las cuales incrementan la biosíntesis de compuestos fenólicos, inhiben el crecimiento del hongo comparado con plantas no tratadas. (1) En la asamblea general del 2 nd congreso ICGTD celebrado en Lisboa 2001 fue decidido por unanimidad que la enfermedad adoptara el nombre de "Enfermedad Petri". I ntroducción La esca y el decaimiento de viñas son dos de las enfermedades más destructivas de tejidos leñosos en viñas. En esta infección han sido implicados hongos como: Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum y P. inflatipes (Bertelli y col., 1998; Crous y col., 1996; Mugnai y col., 1996; Mugnai y col., 1997), 1

2 donde como tales patógenos, han sido aislados con frecuencia de la madera de viñas infectadas. En esta enfermedad de decaimiento de viñas jóvenes es característico un haz vascular rayado de marrón-negro, con la formación de tilosas y gomas en los vasos del xilema (Petri, 1912). Tanto las tilosas, como las gomas pécticas son conocidas como un efectivo suministro de protección, frente a la invasión de hongo y/o bacteria, formando parte ambos sistemas como mecanismos de defensa de viña frente a enfermedades vasculares (Petri, 1912). Las plantas poseen de unas sustancias presintetizadas que inhiben el crecimiento y la germinación de patógenos. Estas sustancias inhibitorias son de naturaleza fenólica y se incluyen : Catecol, ácido protocateíco, ácido clorogénico, diferentes flavonoides, etc. (Del Río y col., 1998; Kuc, 1995). Además, se conoce que viñas infectadas con Botrytis cinerea o Plasmapora viticola, son capaces de sintetizar metabolitos que confieren una cierta resistencia a ambos hongos, como resveratrol y viniferinas (Hart, 1981; Langeake, 1981). También se ha averiguado que una acumulación de resveratrol y ε-viniferina tiene lugar en la madera alterada por la enfermedad de la esca (Amalfitano y col., 2000). En este trabajo se estudió, la formación de tilosas en viñas SO4 afectadas por el decaimiento de viñas jóvenes, con microscopía óptica y electrónica. Así como la determinación de los compuestos fenólicos en raíces infectadas y su capacidad inhibitoria del crecimiento micelial de Pa. chlamydospora, Pm aleophilum y Pm. inflatipes. La utilización de Brotomax (un activador de la resistencia a la enfermedad, que ha comenzado a comercializarse en España por Agrométodos, S.A.) para estimular la producción de compuestos fenólicos, se ha demostrado que es una alternativa efectiva para controlar esta enfermedad. Material y Métodos Material vegetal y tratamiento con Brotomax. Se utilizaron 30 plantas de viña SO4 (4 años de edad) no infectadas e infectadas con Phaeomoniella chlamydospora y Phaeoacremonium sp. Las plantas fueron suministradas por un vivero español. Las aplicaciones con Brotomax fueron llevadas a cabo en otros ensayos de 60 viñas (var. Flame) localizadas en Abarán (Murcia, España), la cual consiste en una primera aplicación de Brotomax 0.3% (foliar) al principio de la floración, una segunda aplicación con el fruto ya cuajado y una tercera tras el viraje de color del fruto, donde se aplicaron 10cc/planta por goteo. Un numero similar de plantas en la misma plantación (sin tratamiento) fueron usadas como control. Reactivos. Estándar de compuestos fenólicos: Resveratrol, catequina, ácido gálico y reactivo Folin Ciocalteu`s, suministrados por Sigma (St. Louis, MO, USA). Cianidina fue suministrada por Estrasíntesis S.A. (Genay, Francia) y Brotomax por Agrométodos, S.A (Madrid, España). Extracción y medida de los compuestos fenólicos. Fueron recogidas raíces no infectadas e infectadas (SO4), y hojas de viñas control y viñas tratadas con Brotomax (var. Flame), y cada una de las cuatro muestras divididas en tres lotes iguales, aproximadamente. El material vegetal fue triturado y agitado con dimetilsulfóxido (DMSO) (100mg peso fresco/ml), durante 12 h para la extracción fenólica. En algunos casos, una fracción del extracto fue hidrolizada con HCl 2N para la medida de taninos, 2

3 los cuales fueron hidrolizados como ácido gálico. Ambos extractos hidrolizados y no hidrolizados fueron filtrados a través de una membrana de 0.45 µm de nylon, antes del análisis por: 1) Espectrofotometría, usando un espectofotometro UV2 UNICAM UV/VIS (Unicam Limited, Cambridge, UK) para estimar los fenoles totales, expresados como equivalentes de ácido gálico (Folin Ciocalteu Method; Singleton y Rossi, 1965) y taninos condensados, expresados como equivalentes de catequina (Price y col., 1978). 2) HPLC-MS con un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard (modelo HP 1050) (Hewlett-Packard Co., USA) integrado con un detector array de diodos (escaneado en un rango de nm) para cuantificar e identificar los compuestos fenólicos. Para el análisis por HPLC la fase estacionaria fue utilizada una columna Sherisorb ODS-2 (250 mm x 4 mm i.d.) con una tamaño de partícula de 5µm a 35ºC. Como disolvente fue usado: Acetonitrilo (A)/Agua (B), de 25 a 95% de A en 50 min. El flujo del eluyente fue de 1 ml. min -1. Los cambios de absorbancia fueron recogidos en el detector array de diodos UV-V a 280 y 353 nm. La cantidad de compuestos fenólicos fueron determinados desde el área ofrecida por el integrados usando el factor respuesta de los correspondientes estándar. Los principales compuestos fenólicos en estos extractos fueron recogidos en el colector de fracciones (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) y la salida por la columna del HPLC para la identificación por medida de un espectofotómetro de masas Hewlett- Packard (Model 5989). Cultivos fúngicos y actividad antifúngica de los extractos de viña. Cultivos aislados de Pa. chlamydospora, Pm aleophilum y Pm. inflatipes fueron ofrecidos por Agri- Analysis Company (Davis, CA, USA) y cultivados en dextrosa patata agar (PDA) a 25ºC para utilizarse como inoculo. Los aislados de raíces infectadas (SO4) cultivadas en las condiciones anteriores muestran un patrón de crecimiento y unas características morfológicas para Pa. chlamydospora, Pm aleophilum y Pm. inflatipes similares a las ofrecidas por Agri-Analysis Company (Davis, CA, USA). La actividad antifúngica de extractos no hidrolizados de raíces de viña (SO4) infectadas y no infectadas, del peridermo y del cilindro vascular, y extractos control y tratados con Brotomax de hojas de viña (var. Flame) fueron determinados por ensayos in vitro con el hongo, descrito previamente (Del Río y col., 1998). Microscopía óptica y electrónica. La examinación microscópica y las condiciones y procedimientos usados para procesar las raíces (SO4) infectadas y no infectadas, están publicados en estudios anteriores (Ortuño y col., 1990), los cuales fueron obtenidos y definidos como semifinos y secciones ultrafinas para microscopía óptica y electrónica. Para la observación de microscopía óptica, fue utilizado un Fotomicrsocopio II (Carl Zeiss, Oberkochem, Alemania). Para la observación ultramicroscópica, de las secciones de raíz fueron cortadas (Ultracut Reicher Jung), fijadas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y observadas en el microscopio electrónico Zeiss EM 109 con una aceleración de 60 Kv. Para conocer el grado de infección de una raíz se realizó un recuento del numero de vasos xilematicos obstruidos. De manera que, raíces con un 30 ó 90% de los vasos del xilema bloqueados pueden ser clasificadas como infectadas o muy infectadas respectivamente. 3

4 R esultados y Discusión En la Figura 1 se observa una sección transversal de raíz infectada (SO4), observando una obstrucción y decoloración del xilema. Dicha obstrucción se localiza en vasos de años anteriores, como consecuencia de la formación de tilosas (Fig. 1B), las cuales son formadas por la expansión de las células parenquimáticas del xilema, como puede observarse en la sección longitudinal de una raíz secundaria (Fig. 2A). Aquí las tilosas invaden la luz del xilema y la conexión con las células parenquimáticas del xilema puede apreciarse claramente. Un detalle de la formación de la tilosas por expansión de las células del parenquima puede ser observado en la micrografía de la Fig. 2B. La expansión de las célula del parenquima a la luz del xilema, implica cambios en las paredes celulares y xilemáticas. La presencia de una gran vacuola sugiere que el crecimiento sea debido a la entrada de agua, causando la expansión de la célula, ya que tilosas expandidas tienen la pared primaria similar a la pared de células meristemáticas. Durante la expansión, se ha detectado polímeros dentro de las tilosas, los cuales parecen ser generados por el citoplasma. Como resultado de las interacciones entre las tilosas en el xilema, aparecen ciertos cambios morfológicos como: cambios en las paredes y formación de agregados y estructuras cristalinas (Fig. 2C). Asociados al desarrollo de tilosas, existen también cambios en los compuestos fenólicos, ya que la examinación microscópica de secciones transversales de raíces infectadas tintadas con una tinción especifica de fenoles (FeCl 3 -HCl), mostró una fuerte coloración en áreas donde los vasos están obstruidos, y en cambio, mostró una débil coloración en elementos del xilema no infectados (datos no mostrados). Los compuestos fenólicos fueron identificados principalmente como taninos condensados, siendo la cianidina el principal flavonoide después de la hidrólisis. También fue detectado resveratrol en dichos extractos de raíz. La Tabla 1 muestra el contenido de polifenoles totales, taninos y resveratrol de raíces con variedad de vasos xilemáticos bloqueados / decolorados. Existe una correlación entre el alcance de la infección de la raíz con el contenido total de fenoles y, particularmente, con el contenido total de taninos. En raíces muy infectadas, el 86% de los fenoles totales son taninos condensados, un 10% taninos hidrolizables y el 4% restante otros compuestos fenólicos. También fue observada una correlación similar entre la infección y el contenido de resveratrol, ya que en raíces muy infectadas los niveles de resveratrol pueden ser 3 veces más altos que en plantas no infectadas. Cuando los extractos de raíz no infectada fueron incluidos en el medio de cultivo, se observo una correlación entre el grado de infección y el grado de inhibición. De ahí que, un incremento en los polifenoles totales fue fuertemente relacionada con la gran inhibición del crecimiento de Pa. chlamydospora, Pm aleophilum y Pm. inflatipes (Tabla 2). En las raíces, la distribución de polifenoles tiene una diferente distribución entre el peridermo y el cilindro vascular. El peridermo contiene niveles mayores de polifenoles, mientras quw el cilindro vascular tiene una alta concentración de taninos hidrolizables y resveratrol (Tabla 3). En cambio, el nivel de taninos condensado fue similar en el peridermo y en el cilindro vascular. Extractos del cilindro vascular, 4

5 los cuales contienen concentraciones fenólicas más bajas que el peridermo, tienen la misma capacidad de inhibición que extractos del peridermo, concluyendo que el resveratrol y taninos hidrolizables puedan estar implicados en los mecanismos de defensa. Por lo tanto, altos niveles de estos compuestos en plantas sanas (no infectadas), que actúan como mecanismos de defensa natural frente a patógenos, podrían ser incrementados. Y para ello, se ha observado en chequeos a viñas tratadas con Brotomax, que es posible incrementar los niveles de dichas moléculas de protección en viñas. Brotomax aplicado durante el periodo de brotación (var. Flame) incrementa los polifenoles en los diferentes órganos (Tabla 4). Por lo que, añadiendo extractos fenólicos de hojas procedentes de plantas tratadas con Brotomax al medio de cultivo, incrementa la inhibición del crecimiento micelial de Pa. chlamydospora y Pm. Inflatipes (datos no mostrados). Los resultados sugieren que los compuestos fenólicos en Vitis podrían estar implicados e la protección de viñas frente al ataque de patógenos, y que el incremento de estos compuestos pueda representar una nueva aproximación para el control de enfermedades de tronco. Bibliografía Amalfitano C., A. Evidente, G. Surico, S. Tegli, E. Bertelli and L. Mugnai, Phenols and stilbene polyphenols in the wood of esca-diseased grapevines. Phytopathologia Mediterranea 39, Bertelli E., L. Mugnai and G. Surico, Presence of Phaeoacremonium chlamydosporum in apparently healthy rooted grapevine cuttings. Phytopathologia Mediterranea 37, Crous P.W., W. Gams, M.J. Wingfield and P.S. Wyk Van, Phaeoacremonium gen. nov. associated with wilt and decline diseases of woody hosts and human infections. Mycologia 88, Del Río J.A., M.C. Arcas, O. Benavente-García and A. Ortuño, Citrus polymethoxylated flavones can confer resistance against Phytophthora citrophthora, Penicillium digitatum and Geotrichum species. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, Hart J.H., Role of phytoestilbenes in decay and disease resistance. Annual Review of Phytopathology 19, Kuc J., Phytoalexins, stress metabolism, and disease resistance in plants. Annual Review of Phytopathology 33, Langecake P., Disease resistance of Vitis spp. and the production of the stress metabolites resveratrol, ε-viniferin, α- viniferin and pterostilbene. Physiological Plant Pathology 18, Mugnai L., G. Surico and A. Esposito, Microflora associata al mal dell'esca della vite in Toscana. Informatore Fitopatologico 46(11), Mugnai L., G. Surico and A. Sfalanga, Produzione di enzimi esocellulari da parte di funghi del legno di viti colpite dal 'mal dell'esca'. Micologia Italiana 5

6 26(1), Ortuño A., J. Sánchez-Bravo, J.R. Moral, M. Acosta and F. Sabater, Changes in the concentration of indole-3-acetic acid during the growth of etiolated lupin hypocotyls. Physiologia Plantarum 78, Petri L., Observations on grapevine wood alterations following wounding. Sperimentali Agrarie Italiane 45, Price M.L., S. Van Scoyoc and L.G. Butler, A critical evaluation of the vanillin reaction as an assay for tannin in sorghum. Journal of Agricultural and Food Chemistry 26, Singleton V.L. and J.A. Rossi, Jr., Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16,

7 Anexos Fig. 1. A) Secciones transversales de raiz de viña SO4 infectada (x 100). B) Xilema con tilosas (x 400). A B 7

8 Phytopathologia Mediterránea 2002 Fig. 2. A) Secciones longitudinales de raiz de viña SO4 infectada. B) Formación de tilosas en la luz del xilema, microscopía electrónica (x3.150). C) Tilosas maduras en la luz del xilema, microscopía electrónica (x3.150). A B C 8

9 Tabla 1. Concentración de polifenoles totales (ácido gálico g/100 g PF), taninos totales (condensados e hidrolizados, expresados como equivalentes de catequina g/100 g PF) y resveratrol (g/100 g PF) en raices con diferentes porcentajes del xilema bloqueado/decoloreado. Raíces Compuestos Activos a Polifenoles Totales Taninos Totales Resveratrol No infectada 12 ± 3 5 ± ± 0.06 Infectada b 26 ± 6 16 ± ± 0.1 Muy infectada c 34 ± 8 31 ± ± 0.1 a Media ± ES (n = 3) b 30% de los vasos del xilema bloqueados por análisis microscópico. c 90% de los vasos del xilema bloqueados por análisis microscópico. Tabla 2. Capacidad (%) de inhibición del crecimiento micelial de Pa. chlamydospora, Pm. aleophilum and Pm. inflatipes. con extractos de raíz infectadas. Note: 5 ml de extracto de raíz (100 mg/ml DMSO) fueron añadidos a 100 ml de medio de cultivo PDA, para cada hongo. Raíces Especis de Hongos a Pa. Chlamydospora, Pm. aleophilum Pm. Inflatipes No infectada 12 ± 5 14 ± 6 8 ± 2 Infectada b 68 ± 7 72 ± 9 35 ± 6 Muy infectada c 89 ± 8 88 ± 8 43 ± 8 a b c (ver Tabla 1) 9

10 Tabla 3. Concentración de polifenoles totales (ácido gálico g/100 g PF), taninos condensados (equivalentes de catequina g/100 g PF), taninos hidrolizados (ácido gálico g/100 g PF), y resveratrol (g/100 g PF) en diferentes parte de raíces de vid infectada a. Compuestos Activos Tejido de Raíz Polifenoles totales Taninos condensados Taninos hidrolizados Resveratrol Peridermo 32 ± 3 15 ± ± ± 0.06 Haz Vascular 26 ± 6 16 ± ± ± 0.1 a 30% de los vasos del xilema bloqueados por análisis microscópico. b Media ± ES (n = 3) Tabla 4. Polifenoles totales (ácido gálico g/100 g PF), en diferentes órganos de Vitis var. Flame tratados conbrotomax. El análisis fue llevado en la primera semana de Agosto. Tratamiento Órganos de la planta a Hojas Tallos Frutos Raíces Control 2.24 ± ± ± ± 0.1 Tratada 4.6 ± ± ± ± 0.1 a Media ± ES (n = 3) 10